Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, in vitro hücre dışı bir sistemde translasyon sırasında üretilen SEC TED 70 s ribozomuna bağlı, yeni sentezlenen zincir komplekslerini veya RNC'leri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen genin C-terminal ucuna 17 amino asit uzunluğunda bir SEC M duraklama dizisinin eklenmesi ve bunun T seven transkripsiyonel promoterinin aşağısına klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, mRNA bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanılarak transkribe edilir ve daha sonra saflaştırılır.

Ardından, saflaştırılmış mRNA, sentezlenen proteini veya yeni oluşan polipeptidi işaretlemek için radyoaktif amino asitler içeren bir S 30 E coli ekstrakt sisteminde transkribe edilir. Son olarak, ikinci Mr.Ed ribozomuna bağlı yeni zincir kompleksleri, sükroz gradyan santrifüjleme ve fraksiyonlama ile izole edilir. Nihayetinde, gradyan fraksiyonlarından izole edilen işaretli polipeptidlerin jel elektroforez analizi ile yeni zincirlerin 70 s ribozomuna stabil bir şekilde bağlı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, stop kodonu içermeyen mRNA kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, translasyon ve ardından gelen santrifüj aşaması sırasında yeni sentezlenen polipeptit zincirinin 70 S ribozoma yüksek verimlilikle bağlanmasını sağlamasıdır. Ayrıca, stop kodonu içermeyen teknolojiyle karşıt olarak, bu yöntem hem in vitro hem de in vivo sistemlerde neredeyse eşit verimlilikle kullanılabilir. Bu yöntem, translasyonel protein katlanması alanındaki, çeşitli translasyonel katlanma ara formlarının translasyonun ne kadar erken safhalarında oluşabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ayrıca doğrudan veya dolaylı yapı analizi kullanarak bu yapıların incelenmesine katkı sağlayabilir.

Sonda ve belirleme yaklaşımları Bu teknik, ribozom üzerindeki protein katlanma yolunu çözmemize yardımcı olabilir. Bu protokolde, 70 s ribozoma bağlı tam uzunluktaki bine gamma B kristalin yeni sentezlenen zincirlerin izolasyonunu tanımladık. Ancak bu teknik, neredeyse herhangi bir ilgi duyulan proteinin çeşitli varyantlarının izolasyonu için kullanılabilir.

Bu strateji, derm Es'in kesilmiş natin polipeptit zincirlerini izole etmek için de benimsenebilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler sükroz gradyan santrifüjleme adımında zorluk yaşayabilirler. Ancak, deneyimli olanlar için bu durum bir sorun teşkil etmemelidir. Stop kodonu içermeyen mRNA kullanımını içeren ilk ve daha az başarılı denemelerin ardından, 70S ribozoma bağlı gamma B kristallin nascent polipeptitleri izole etmek için ikinci durdurma dizisini kullanmaya karar verdik.

Sonraki teknik, sonraki santrifüj aşamaları sırasında RNC'lerin stabilitesini, SECM durdurma dizilimi kullanımını içeren teknik kadar yüksek bir verimlilikle sağlayamamıştır. Gradyan hazırlama ve RNC ayırma işlemlerini içeren adımların öğrenilmesi zor olabileceğinden ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için belirli bir düzeyde uzmanlık gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Uygulama biçimi, laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrenci tarafından gösterilecektir. In vitro transkripsiyon ve translasyonu gerçekleştirmek için; ribozom yeni sentezlenen zincir kompleksleri veya RNC'ler üretmek amacıyla, herhangi bir T7 ve/veya SP6 tabanlı plazmite klonlanmış bir ilgi geni ile başlayın.

Polipeptit fragmanının ribozomal tünelden dışarı çıkmasını sağlamak için, hedef polipeptidin C terminusunu M'den gelen arrest indükleyici diziyi ekleyerek uzatın. İn vitro transkripsiyona hazırlık için protein ile SEC M arrest dizisi arasına esnek bir glisin zengin bağlayıcı (linker) ekleyin; şablon DNA'yı lineerleştirmek için açık okuma çerçevesinin aşağısından kesecek bir restriksiyon enzimi kullanın ve örneğin tamamen sindirildiğini doğrulamak için agarose jel elektroforezi yapın. Optimum DNA konsantrasyonunu doğruladıktan sonra, haberci RNA sentezlemek için üretici talimatlarına uygun olarak yüksek verimli bir transkripsiyon kiti kullanın.

mRNA'yı saflaştırmak için lityum klorür çöktürmesini kullanın. Ardından, saflığını doğrulamak için bir örneği akrilamid veya agaroz jelde yürütün. İn vitro translasyon için.

Nükleaz içermeyen su içindeki bir E. coli sistemi kullanarak; metiyonin içermeyen 1 mM amino asit karışımı, 10 ünite ribonükleaz inhibitörü, 20 µCi 35S-metiyonin, 20 µL reaksiyon karışımı, 24 µL rekonstitüsyon tamponu ve 24 µL E. coli lizatı ekleyin. Reaksiyonu 30 °C'de beş dakika inkübe ederek ön ısıtma yapın. Ardından 1 ila 2 µg mRNA ekleyin ve 30 °C'de 10 ila 15 dakika daha inkübe edin.

70 s ribozoma bağlı yeni sentezlenen zincir komplekslerini veya NC'leri izole etmek için reaksiyonu buz üzerine yerleştirerek durdurun. Translasyon reaksiyonunu; 20 milimolar HEPES, potasyum hidroksit pH 7.5, 15 milimolar magnezyum, 100 milimolar potasyum asetat ve 1 milimolar DTT içeren %5 ila %30'luk 4,5 mililitre sukroz gradyanının üzerine ekleyin. 4 °C'de iki saat boyunca 41.000 RPM'de santrifüjleyin; santrifüjleme sonrası, programlanabilir bir yoğunluk gradyan sistemi ve 254 nanometreye ayarlanmış bir absorbsans dedektörü kullanarak sukroz gradyanını fraksiyonlara ayırın.

SEC M uzatılmış proteinin 70 s ribozoma bağlı kalıp kalmadığını belirlemek amacıyla yapılacak ileri analizler için 70 s ribozomları içeren fraksiyonları toplayın. Her gradyan fraksiyonundaki proteini trikloroasetik asit ekleyerek çöktürün. Numuneleri dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, proteini peletlemek için numuneleri 14.000 ×g hızda 15 dakika boyunca santrifüjleyin ve peletleri bir millimolar Tris-HCL pH 7.6 ile asetonun 4:1 oranında olduğu bir karışımda yıkayın.

Peletleri havada kurutun, ardından SDS page yükleme tamponunda yeniden süspande edin. Örnekleri tris Trice SDS page ile ayırın, ardından jelleri sabitleyip kurutun ve burada gösterildiği gibi autoradyografiye ve fosfo görüntülemeye tabi tutun. İn vitro translasyonun ardından, gama B kristalin proteinin ribozoma stabil şekilde bağlı kaldığından emin olmak için 70 S ribozomlar sükroz gradyan santrifüjasyonu ve fraksiyonlama ile izole edilmiştir.

70 s içeren fraksiyonlar birleştirilmiş, tuzdan arındırılmış, tampon değişimi yapılmış ve ek bir sakkaroz gradyan santrifügasyon işlemine tabi tutulmuştur. Burada sunulan sonuçlar, SEC M'nin gamma B kristalin RNC'lerin translasyonel duraksamasını etkili bir şekilde indükleyebileceğini göstermektedir. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, genellikle gece boyu süren bir TCA çöktürme adımı içeren yeni sentezlenen zincirin jel elektroforez analizi hariç, bir iş gününde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, herhangi bir adımda RNA kontaminasyonundan kaçınmak açıkça kritik öneme sahiptir. RNA kontaminasyonu, ekstraktın translasyonel verimliliğini etkileyebilir ve 70S ribozomdan yeni sentezlenen polipeptidin salınmasına yol açabilir. Bu prosedür takip edilerek, nihai hedefe bağlı olarak, 70S ribozoma stabil şekilde bağlanmış NAST ve önceden belirlenmiş uzunluktaki polipeptitler elde edilebilir.

Bu kompleksler, NMR veya FRET gibi doğrudan ve dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ribozoma bağlı yeni sentezlenen zincirlerin konformasyonunun belirlenmesi veya geliştirilmesinin ardından faktör ve ligand bağlanmasının test edilmesi gibi çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Bu teknik, yapısal biyoloji ve protein katlanması alanındaki araştırmacıların, ribozoma bağlı tam uzunluktaki proteinlerin konformasyonunu ve aynı zamanda kotranslasyonel katlanma ara ürünlerini keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, translasyonel protein katlanması alanındaki çeşitli soruları yanıtlamak için daha sonra kullanılabilecek, 70 S ribozomuna stabil şekilde bağlı yeni sentezlenen polipeptitlerin nasıl hazırlanacağı ve izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Radyoaktif izotoplar ve örneğin [^35S]metiyonin gibi işaretli amino asitlerle çalışmanın özel önlemler gerektirdiğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken bunların her zaman göz önünde bulundurulması gerektiğini unutmayın.