Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, in vitro hücresiz bir sistemde translasyon sırasında üretilen SEC TED 70'in ribozoma bağlı, yeni ortaya çıkan zincir komplekslerini veya RNC'leri izole etmektir. Bu, ilk olarak 17 amino asit uzunluğunda bir SEC M durdurma dizisinin ilgilenilen genin C terminal ucuna sokulması ve bunun T yedi transkripsiyonel promotörün aşağı akışında klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, mRNA, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanılarak kopyalanır ve daha sonra saflaştırılır.

Daha sonra saflaştırılmış mRNA, sentezlenen proteini veya yeni ortaya çıkan polipeptidi etiketlemek için radyoaktif amino asitlerle bir S 30 E coli özü sisteminde çevrilir. Son olarak, ikinci Mr.Ed ribozoma bağlı yeni oluşan zincir kompleksleri sakaroz, gradyan, santrifüjleme ve fraksiyonlama ile izole edilir. Sonuç olarak, gradyan fraksiyonlarından izole edilen etiketli polipeptitlerin jel elektroforez analizi ile yeni ortaya çıkan zincirlerin 70 s ribozoma stabil bir şekilde bağlandığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, stok kodonu olmayan mRNA'nın kullanılması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, translasyon ve sonraki santrifüjleme aşaması sırasında yeni ortaya çıkan polipeptit zincirinin 70 s ribozoma bağlanmasını yüksek verimlilikle sağlamasıdır. Ek olarak, kesintisiz kordon teknolojisinin aksine, bu yöntem hem in vitro hem de in vivo sistem sırasında neredeyse eşit verimlilikle kullanılabilir. Bu yöntem, translasyonel protein katlanması alanında, çeviri sırasında çeşitli tranlational katlama ara ürünlerinin ne kadar erken oluşabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ayrıca yapılarını doğrudan veya dolaylı yapı kullanarak analiz etmeye yardımcı olabilir.

Problama ve belirleme yaklaşımları Bu teknik, ribozom üzerindeki protein katlanma yolunu deşifre etmemize yardımcı olabilir. Bu protokolde, 70 s ribozoma bağlı tam uzunlukta bine B kristalin yeni oluşan zincirlerin izolasyonunu tanımladık. Ancak bu teknik, hemen hemen her ilgilenilen proteinin vari hastalığının izolasyonu için kullanılabilir.

Bu stratejik, derm Es'in kesilmiş natin polipeptit zincirlerini izole etmek için de benimsenebilir.Genellikle bu yönteme yeni olan birey, sükroz gradyan santrifüjleme aşaması sırasında mücadele edebilir. Ancak, birinci deneyim için bu bir sorun olmamalıdır. Durdurma kordonu olmayan mRNA'nın kullanımını içeren ilk, daha az başarılı girişimlerden sonra ribozom olarak 70'e bağlı gama B kristalinin yeni ortaya çıkan polipeptitlerini izole etmek için ikinci durma dizisini kullanmaya karar verdik.

Daha sonraki teknik, SECM tutuklama dizisinin kullanımını içeren teknikle aynı verimlilikle sonraki santrifüjleme adımları sırasında RNC'lerin stabilitesini sağlayamadı. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü gradyanın hazırlanmasını ve RNC'nin ayrılmasını içeren adımların öğrenilmesi zor olabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için belirli bir düzeyde uzmanlık gerektirir Duruşu göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak in vitro transkripsiyon ve çeviri yapmak. Ribozom yeni oluşan zincir kompleksleri veya RNC'ler oluşturmak için herhangi bir T yedi ve/veya SP altı bazlı plazmide klonlanan bir ilgi geni ile başlayın.

Polipeptit fragmanının ribozomal tünelden dışarı çıkmasını sağlamak için M'den tutuklama indükleyici diziyi ekleyerek hedef polipeptidin C terminalini uzatın. İn vitro transkripsiyona hazırlanmak için protein ve SEC M tutuklama dizisi arasına esnek bir glisin Suriye açısından zengin bağlayıcı ekleyin, şablon DNA'yı doğrusallaştırmak için açık okuma çerçevesinin aşağı akışını kesecek kullanıcı kısıtlama enzimi ekleyin, numunenin tam sindirimini doğrulamak için AROS jel elektroforezini çalıştırın. Optimum DNA konsantrasyonunu doğruladıktan sonra, haberci RNA'yı sentezlemek için üreticinin talimatlarına göre yüksek verimli bir transkripsiyon kiti kullanın.

mRNA'yı saflaştırmak için lityum klorür çökeltmesi kullanın. Ardından, saflığını doğrulamak için bir akrilamid veya aros jel üzerinde bir numune çalıştırın. In vitro çeviri için.

Nükleaz içermeyen suda bir e coli sistemi kullanarak, bir milimolar amino asit karışımı eksi metiyonin, 10 birim ribonükleaz inhibitörü 20, mikro küriler 35 s metiyonin, 20 mikrolitre reaksiyon karışımı, 24 mikrolitre sulandırma tamponu ve 24 mikrolitre e coli ekleyin. Lizat. Reaksiyonu 30 santigrat derecede beş dakika inkübe ederek önceden ısıtın. Daha sonra bir ila iki mikrogram mRNA ekleyin ve 30 santigrat derecede 10 ila 15 dakika daha inkübe edin.

70 s ribozoma bağlı yeni oluşan zincir komplekslerini veya ncs'yi izole etmek için buzun üzerine koyarak reaksiyonu durdurun. Translasyon reaksiyonunu 20 milimolar yığınlar halinde %5 ila %30 sükroz gradyanının 4,5 mililitresinin üzerine katmanlayın. Potasyum hidroksit pH 7.5 15 milimolar magnezyum, 100 milimolar potasyum asetat ve santrifüjlemeyi takiben dört santigrat derecede iki saat boyunca 41.000 RPM'de bir milimolar DTT santrifüjü, programlanabilir bir yoğunluk gradyan sistemi ve 254 nanometrede ayarlanmış bir absorbans detektörü kullanarak sakaroz gradyanını parçalara ayırın.

SEC M genişletilmiş proteininin 70 s ribozoma bağlı kalıp kalmadığını belirlemek için daha fazla analiz için 70 s ribozom içeren fraksiyonları toplayın. Trikloroasetik asit ekleyerek her gradyan fraksiyonunda proteini çökeltin. Numuneleri ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin, proteini peletlemek için numuneleri 15 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin, peletleri dört ila bir milimolar tris, HCL pH 7.6 oranında yıkayın.

Peletleri havayla kurutun, ardından SDS sayfa yükleme tamponunda yeniden askıya alın. Numuneleri tris Trice SDS sayfasına göre çözün, ardından jelleri sabitleyin ve kurutun ve burada gösterildiği gibi oto radyografi ve fosfo görüntülemeye tabi tutun. İn vitro translasyonun ardından, 70 S ribozomları, gama B kristalin proteininin ribozoma stabil bir şekilde bağlı kalmasını sağlamak için sakaroz, gradyan, santrifüjleme ve fraksiyonlama ile izole edildi.

Fraksiyonlar içeren 70'ler bir araya getirildi, tuzdan arındırıldı, tampon değiştirildi ve ek bir sükroz gradyan santrifüjleme turuna tabi tutuldu. Burada sunulan sonuçlar, SEC M'nin gama B kristalin RNC'lerinin translasyonel durmasını verimli bir şekilde indükleyebileceğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, genellikle bir gece TCA çökeltme adımını içeren yeni oluşan zincirin jel elektroforez analizi dışında bir iş gününde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, herhangi bir adımda RNA kontaminasyonunu önlemek açıkça kritiktir. RNS kontaminasyonu, ekstraktın translasyon verimliliğini etkileyebilir ve 70. ribozomdan yeni ortaya çıkan polipeptitin salınmasına yol açabilir. Bu prosedürü takiben, nihai hedefe bağlı olarak 70. ribozoma stabil bir şekilde bağlanmış önceden belirlenmiş lanxess'in NAST ve polipeptitleri elde edilebilir.

Bu kompleksler, NMR veya fre gibi doğrudan ve dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ribozoma bağlı yeni oluşan zincirlerin doğrulanmasının belirlenmesi veya geliştirildikten sonra faktör ve ligand bağlanmasının test edilmesi gibi çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Bu teknik, yapısal biyoloji ve protein katlama alanındaki araştırmacıların, ribozoma bağlı tam uzunlukta proteinlerin yanı sıra cot translasyonel katlama ara maddelerinin doğrulanmasını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, 70 s ribozoma kararlı bir şekilde bağlanmış yeni ortaya çıkan polipeptidin nasıl hazırlanacağını ve izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız, bu da tranalizyonel protein katlanması alanındaki çeşitli soruları yanıtlamak için daha fazla kullanılabilir.

Radyoaktif izotoplar ve örneğin A 35 metiyonin gibi etiketli amin asitlerle çalışmanın özel önlemler gerektirdiğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman dikkate alınması gerektiğini unutmayın.