Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak
19 Haziran 2012
Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır ( E. coli Hemen hemen herhangi bir proteinin (ya da C-terminali ile kaynaşmış) içine yerleştirilir) sistem.
Bu prosedürün genel amacı, in vitro hücresiz bir sistemde translasyon sırasında üretilen SEC TED 70'in ribozoma bağlı, yeni ortaya çıkan zincir komplekslerini veya RNC'leri izole etmektir. Bu, ilk olarak 17 amino asit uzunluğunda bir SEC M durdurma dizisinin ilgilenilen genin C terminal ucuna sokulması ve bunun T yedi transkripsiyonel promotörün aşağı akışında klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, mRNA, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanılarak kopyalanır ve daha sonra saflaştırılır.
Daha sonra saflaştırılmış mRNA, sentezlenen proteini veya yeni ortaya çıkan polipeptidi etiketlemek için radyoaktif amino asitlerle bir S 30 E coli özü sisteminde çevrilir. Son olarak, ikinci Mr.Ed ribozoma bağlı yeni oluşan zincir kompleksleri sakaroz, gradyan, santrifüjleme ve fraksiyonlama ile izole edilir. Sonuç olarak, gradyan fraksiyonlarından izole edilen etiketli polipeptitlerin jel elektroforez analizi ile yeni ortaya çıkan zincirlerin 70 s ribozoma stabil bir şekilde bağlandığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu tekniğin, stok kodonu olmayan mRNA'nın kullanılması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, translasyon ve sonraki santrifüjleme aşaması sırasında yeni ortaya çıkan polipeptit zincirinin 70 s ribozoma bağlanmasını yüksek verimlilikle sağlamasıdır. Ek olarak, kesintisiz kordon teknolojisinin aksine, bu yöntem hem in vitro hem de in vivo sistem sırasında neredeyse eşit verimlilikle kullanılabilir. Bu yöntem, translasyonel protein katlanması alanında, çeviri sırasında çeşitli tranlational katlama ara ürünlerinin ne kadar erken oluşabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ayrıca yapılarını doğrudan veya dolaylı yapı kullanarak analiz etmeye yardımcı olabilir.
Problama ve belirleme yaklaşımları Bu teknik, ribozom üzerindeki protein katlanma yolunu deşifre etmemize yardımcı olabilir. Bu protokolde, 70 s ribozoma bağlı tam uzunlukta bine B kristalin yeni oluşan zincirlerin izolasyonunu tanımladık. Ancak bu teknik, hemen hemen her ilgilenilen proteinin vari hastalığının izolasyonu için kullanılabilir.
Bu stratejik, derm Es'in kesilmiş natin polipeptit zincirlerini izole etmek için de benimsenebilir.Genellikle bu yönteme yeni olan birey, sükroz gradyan santrifüjleme aşaması sırasında mücadele edebilir. Ancak, birinci deneyim için bu bir sorun olmamalıdır. Durdurma kordonu olmayan mRNA'nın kullanımını içeren ilk, daha az başarılı girişimlerden sonra ribozom olarak 70'e bağlı gama B kristalinin yeni ortaya çıkan polipeptitlerini izole etmek için ikinci durma dizisini kullanmaya karar verdik.
Daha sonraki teknik, SECM tutuklama dizisinin kullanımını içeren teknikle aynı verimlilikle sonraki santrifüjleme adımları sırasında RNC'lerin stabilitesini sağlayamadı. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü gradyanın hazırlanmasını ve RNC'nin ayrılmasını içeren adımların öğrenilmesi zor olabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için belirli bir düzeyde uzmanlık gerektirir Duruşu göstermek, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak in vitro transkripsiyon ve çeviri yapmak. Ribozom yeni oluşan zincir kompleksleri veya RNC'ler oluşturmak için herhangi bir T yedi ve/veya SP altı bazlı plazmide klonlanan bir ilgi geni ile başlayın.
Polipeptit fragmanının ribozomal tünelden dışarı çıkmasını sağlamak için M'den tutuklama indükleyici diziyi ekleyerek hedef polipeptidin C terminalini uzatın. İn vitro transkripsiyona hazırlanmak için protein ve SEC M tutuklama dizisi arasına esnek bir glisin Suriye açısından zengin bağlayıcı ekleyin, şablon DNA'yı doğrusallaştırmak için açık okuma çerçevesinin aşağı akışını kesecek kullanıcı kısıtlama enzimi ekleyin, numunenin tam sindirimini doğrulamak için AROS jel elektroforezini çalıştırın. Optimum DNA konsantrasyonunu doğruladıktan sonra, haberci RNA'yı sentezlemek için üreticinin talimatlarına göre yüksek verimli bir transkripsiyon kiti kullanın.
mRNA'yı saflaştırmak için lityum klorür çökeltmesi kullanın. Ardından, saflığını doğrulamak için bir akrilamid veya aros jel üzerinde bir numune çalıştırın. In vitro çeviri için.
Nükleaz içermeyen suda bir e coli sistemi kullanarak, bir milimolar amino asit karışımı eksi metiyonin, 10 birim ribonükleaz inhibitörü 20, mikro küriler 35 s metiyonin, 20 mikrolitre reaksiyon karışımı, 24 mikrolitre sulandırma tamponu ve 24 mikrolitre e coli ekleyin. Lizat. Reaksiyonu 30 santigrat derecede beş dakika inkübe ederek önceden ısıtın. Daha sonra bir ila iki mikrogram mRNA ekleyin ve 30 santigrat derecede 10 ila 15 dakika daha inkübe edin.
70 s ribozoma bağlı yeni oluşan zincir komplekslerini veya ncs'yi izole etmek için buzun üzerine koyarak reaksiyonu durdurun. Translasyon reaksiyonunu 20 milimolar yığınlar halinde %5 ila %30 sükroz gradyanının 4,5 mililitresinin üzerine katmanlayın. Potasyum hidroksit pH 7.5 15 milimolar magnezyum, 100 milimolar potasyum asetat ve santrifüjlemeyi takiben dört santigrat derecede iki saat boyunca 41.000 RPM'de bir milimolar DTT santrifüjü, programlanabilir bir yoğunluk gradyan sistemi ve 254 nanometrede ayarlanmış bir absorbans detektörü kullanarak sakaroz gradyanını parçalara ayırın.
SEC M genişletilmiş proteininin 70 s ribozoma bağlı kalıp kalmadığını belirlemek için daha fazla analiz için 70 s ribozom içeren fraksiyonları toplayın. Trikloroasetik asit ekleyerek her gradyan fraksiyonunda proteini çökeltin. Numuneleri ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin, proteini peletlemek için numuneleri 15 dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin, peletleri dört ila bir milimolar tris, HCL pH 7.6 oranında yıkayın.
Peletleri havayla kurutun, ardından SDS sayfa yükleme tamponunda yeniden askıya alın. Numuneleri tris Trice SDS sayfasına göre çözün, ardından jelleri sabitleyin ve kurutun ve burada gösterildiği gibi oto radyografi ve fosfo görüntülemeye tabi tutun. İn vitro translasyonun ardından, 70 S ribozomları, gama B kristalin proteininin ribozoma stabil bir şekilde bağlı kalmasını sağlamak için sakaroz, gradyan, santrifüjleme ve fraksiyonlama ile izole edildi.
Fraksiyonlar içeren 70'ler bir araya getirildi, tuzdan arındırıldı, tampon değiştirildi ve ek bir sükroz gradyan santrifüjleme turuna tabi tutuldu. Burada sunulan sonuçlar, SEC M'nin gama B kristalin RNC'lerinin translasyonel durmasını verimli bir şekilde indükleyebileceğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, genellikle bir gece TCA çökeltme adımını içeren yeni oluşan zincirin jel elektroforez analizi dışında bir iş gününde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, herhangi bir adımda RNA kontaminasyonunu önlemek açıkça kritiktir. RNS kontaminasyonu, ekstraktın translasyon verimliliğini etkileyebilir ve 70. ribozomdan yeni ortaya çıkan polipeptitin salınmasına yol açabilir. Bu prosedürü takiben, nihai hedefe bağlı olarak 70. ribozoma stabil bir şekilde bağlanmış önceden belirlenmiş lanxess'in NAST ve polipeptitleri elde edilebilir.
Bu kompleksler, NMR veya fre gibi doğrudan ve dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ribozoma bağlı yeni oluşan zincirlerin doğrulanmasının belirlenmesi veya geliştirildikten sonra faktör ve ligand bağlanmasının test edilmesi gibi çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Bu teknik, yapısal biyoloji ve protein katlama alanındaki araştırmacıların, ribozoma bağlı tam uzunlukta proteinlerin yanı sıra cot translasyonel katlama ara maddelerinin doğrulanmasını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, 70 s ribozoma kararlı bir şekilde bağlanmış yeni ortaya çıkan polipeptidin nasıl hazırlanacağını ve izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız, bu da tranalizyonel protein katlanması alanındaki çeşitli soruları yanıtlamak için daha fazla kullanılabilir.
Radyoaktif izotoplar ve örneğin A 35 metiyonin gibi etiketli amin asitlerle çalışmanın özel önlemler gerektirdiğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman dikkate alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, 17 amino asitlik bir SecM arrest sekansı kullanarak kararlı olarak bağlanmış ribozom yeni sentezlenen zincir komplekslerini (RNC'ler) izole etmek için bir tekniği açıklar. Yöntem, prokaryotik bir E. coli sisteminde uygulanabilir ve translasyon uzamasının incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Translasyon Mekanizmaları
Arka Plan
- Ribozom yeni sentezlenen zincir kompleksleri (RNC'ler) protein sentezini anlamak için gereklidir.
- SecM stalling sekansı, translasyon uzamasını durdurarak yeni sentezlenen zincirlerin çalışılmasını sağlar.
- Bu teknik, stalling sekansını proteinlerin C-terminal ucuna füzyon ederek çeşitli proteinlere uygulanabilir.
- RNC'lerin izolasyonu, kontrollü bir ortamda translasyonun dinamiklerini anlamamızı sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Translasyon sırasında SEC TED 70S ribozom bağlı yeni sentezlenen zincir komplekslerini izole etmek.
- Translasyon süreçlerini incelemek için in vitro hücresiz bir sistemi kullanmak.
- Ribonazolara bağlı yeni sentezlenen zincirlerin stabilitesini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Genin ilgili C-terminal ucuna 17 amino asit uzunluğunda bir SecM stalling sekansı eklenmesi.
- Modifiye edilmiş genin T7 transkripsiyonel promotörünün altına klonlanması.
- In vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanarak mRNA'nın transkripsiyonu.
- Saflaştırılmış mRNA'nın radyoaktif amino asitlerle bir S30 E. coli ekstre sisteminde translasyonu.
- Sükroz gradyan santrifüjlemesi kullanarak ribozom bağlı yeni sentezlenen zincir komplekslerinin izolasyonu.
Ana Sonuçlar
- 70S ribozoma kararlı olarak bağlı yeni sentezlenen zincirlerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Etiketli polipeptitlerin jel elektroforezi analizi ile sonuçların doğrulanması.
- SecM stalling sekansının translasyonu durdurmada etkinliğinin gösterilmesi.
- Ribozom-yeni sentezlenen zincir etkileşimlerinin dinamiklerine ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Açıklanan teknik, prokaryotik bir sistemde RNC'leri izole etmek için etkilidir.
- Bu yöntem, translasyon dinamiklerini incelemek için çeşitli proteinlere uygulanabilir.
- RNC'leri anlamak, protein sentez mekanizmaları hakkındaki genel bilgiye katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolation of ribosome-bound nascent chain complexes (RNCs) using the SecM arrest sequence enables precise interrogation of co-translational protein folding pathways, a critical challenge in early discovery. This approach provides mechanistic clarity on folding intermediates, supporting predictive confidence in target validation and de-risking of protein-based therapeutic strategies. The method's adaptability across diverse proteins positions it as a reusable capability for structural and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct capture of folding intermediates for mechanistic de-risking of protein targets.
- Supports functional target validation by isolating nascent chains at defined translation stages.
- Facilitates predictive assessment of folding pathways relevant to therapeutic protein design.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNCs for downstream structural and functional assays.
- Ensures reproducibility and standardization by stably arresting translation at precise points.
- Enables quantitative analysis of nascent chain properties for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural interrogation of nascent chains with disease-relevant protein folding questions.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of protein therapeutics.
- Reduces translational risk by clarifying folding outcomes at the ribosome interface.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and structural biology, bridging hypothesis-driven target validation with preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on co-translational folding and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNC preparations for comparative analysis.
- Analytics: Provides labeled, ribosome-bound polypeptides for direct structural and functional readouts.
- Translational Research: Enables mechanistic insights that inform preclinical protein engineering and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to virtually any protein of interest, supporting broad portfolio applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein folding and target validation.
- Operational Value: Standardizes RNC isolation for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying folding liabilities early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, in vitro transcription/translation, and gradient centrifugation.
- Demands access to analytical infrastructure for sucrose gradient fractionation and radiolabel detection.
- Necessitates rigorous RNase-free technique to maintain translational efficiency and RNC stability.
- Adaptable across diverse protein targets but may require optimization for specific constructs.
- Radioactive labeling steps require specialized safety protocols and regulatory compliance.
