Protein Kompleksi belirlenmesi Escherichia coli Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu deneyin amacı, e coli'den protein, protein etkileşimleri ve doğal MultiPro komplekslerinin alt birim bileşimini tanımlamaktır. Bu, diziye özgü doğrusal PCR ürünlerinin amplifiye edilmesi, SPA etiketinin kodlanması ve seçilebilir bir işaretleyici ile elde edilir, bunlar bir ddy 3, 3 0 arka planında karboksi terminal füzyonları olarak entegre edilir ve ifade edilir, ikinci adım olarak bakteri Fage lambda rekombinasyon sistemi kullanılarak çift aşamalı saflaştırma, düşük bolluktaki protein komplekslerini verimli bir şekilde geri kazanmak için modlin ve Anti-Flag afinite boncukları kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, modlini, elüsyon tamponu veya CEB ile ima edilen bağlı proteinler, tripsin ile sindirilir ve protein tanımlaması için kütle spektrometresi ile işlenir.

Elde edilen sonuçlar, transkripsiyon sonlandırması da dahil olmak üzere çekirdek RNA polimeraz enziminin çeşitli alt birimlerinin, anti belirleme faktörlerinin etiketli RNA polimeraz alt birimi D proteini ile verimli bir şekilde birlikte saflaştırıldığını göstermektedir, bu da yeni ilişkili bileşenlerin bu yaklaşım kullanılarak verimli bir şekilde ortaya çıkarılabileceğini göstermektedir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, büyük ölçekli kültürlerden düşük ve yüksek bolluktaki yük komplekslerinin verimli bir şekilde geri kazanılmasında başarıyı sağlamak için hücre lizatlarının uygun tampon çözeltileri ile dikkatli bir şekilde işlenmesinin kesinlikle gerekli olduğu iki yuvarlak afinite saflaştırması ile mücadele edebilirler Afinite saflaştırma ve kütle spektrometresi prosedürlerini göstermek, laboratuvarımdaki iki teknisyen Olga Kagan ve HBO guo olacaktır. Bu protokol, Lambda kırmızı rekombinasyon mekanizmasının yazılı protokolde açıklandığı gibi ifade edildiği DDY üç 30 suşuna belirli amplifiye dizilerin hedeflenmesiyle başlar.

Daha sonra, bakterinin 32 santigrat derecede iki mililitre Luria bati veya LB ortamında gece boyunca zorlanmayı ifade ettiği ve ertesi gün 180 RPM'de çalkalandığı Lambda rekombinasyon sisteminin, gece boyunca kültürün bir mililitresini 500 mililitrelik bir şişede 70 mililitre taze LB ortamına aşıladığı yerde. OD 600 yaklaşık 0,8'e ulaşana kadar 180 RPM'de sallayarak aşıyı 32 santigrat derecede büyütün. Şişeyi 42 santigrat derecede bir su banyosunda 180 RPM'de 15 dakika hafifçe çalkalayarak inkübe ederek hücreleri indükleyin.

İndüksiyondan hemen sonra, şişeyi çalkalayarak en az 30 dakika buzlu su bulamaç banyosunda inkübe edin. Hücreleri yazılı prosedürde anlatıldığı gibi hasat ettikten ve yıkadıktan sonra, Reese hücre peletini 700 mikrolitre buz, soğuk, steril su içinde askıya alır ve bu da elektroporasyon yoluyla elektro yetkin hücrelerle sonuçlanır. Saflaştırılmış amplikonun bir mikrolitresini elektro yetkin hücrelerin 40 mikrolitresine ekleyin.

Hücreler homolog rekombinasyon ve entegrasyondan sonra elektroporasyona tabi tutulur. Etiket eğik çizgi kasetini kromozoma başarılı bir şekilde yeniden birleştiren dönüştürücüler, SPA'nın bayrak epitoplarına karşı seçici olan Anti-Flag M iki antikoru ile SPA etiketli füzyon proteinlerinin doğru oluşumunu doğrulamak için misin seçme çoklu transformatörlerine karşı dirence dayalı olarak seçilir. Dört litrelik bir şişede mililitre başına 25 mikrogram kutu misin ile desteklenmiştir.

OD 600 iki ila üç arasına ulaşana kadar beş ila altı saat boyunca 250 RPM'de sürekli çalkalayarak kültürü 32 santigrat derecede büyütün. Bir litre e coli SPA tag kültürünü temiz santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri 15 dakika boyunca dört santigrat derece ve 3.993 kez G'de döndürün. Resus'tan sonra hücreleri yazılı protokolde anlatıldığı gibi askıya alın.

Numuneleri, sonikasyon için buz üzerine yerleştirilmiş steril bir paslanmaz çelik kaba aktarın. Probu numuneye batırın ve üç dakika boyunca sonikat yapın. Sonikasyonun ardından, sonikat lizatının santrifüjlenmesini takiben numunenin aşırı ısınmasını önlemek için iki dakika daha bekleyin.

S süpernatantını santrifüj tüpünden dikkatlice 50 mililitrelik bir polipropilen şahin tüpüne aktarın. Numuneyi sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve sonikasyonlu donmuş hücre ekstraktını ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede en fazla altı ay süreyle saklayın. Tüpü soğuk suya yerleştirerek donmuş sonikasyonlu hücre ekstraktı için afinite saflaştırmasına başlamak için, TH hücre ekstraktını üç mikrolitre benzo, 30 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca bir nükleaz ile inkübe edin.

Bu karışıma iyonik olmayan deterjan Triton X 100 ve 200 mikrolitre Anti-Flag M iki agro boncuk süspansiyonu ekleyin. Tüpü üç saat boyunca dört santigrat derecede döndürerek içeriği yavaşça karıştırın, üç saatlik rotasyondan sonra tüpü altı dakika boyunca 1.700 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, gevşek hız peletini bozmadan mümkün olduğunca çok suyu dikkatlice çıkarın.

Peleti kalan SNA'da yeniden askıya alın ve ardından bir polipropilen hazırlama kolonuna aktarın. Elüatın yerçekimi ile boşalmasını sağlamak için kolonun alt çıkış tapalarını çıkarın. Akmak. Daha sonra, sütunu 200 mikrolitre bir FC tamponu ile beş kez yıkayın ve yazılı protokolde açıklandığı gibi TEV ile Cleve'e devam edin.

Kolonun hem üstünde hem de altında hızlı bir şekilde dekolteyi takip edin. Gece boyunca döndürdükten sonra gece boyunca dört santigrat derecede döndürerek sütundaki içeriği nazikçe karıştırın. Üst kapağı ve alt tapayı yeni kolona çıkararak elüatı boşaltın.

Eski sütunu 400 mikrolitre bir x cal Modlin bağlama tamponu ve 150 mikrolitre Cal Modlin bağlama boncukları süspansiyonu ile yıkayın. Bağlı proteini 50 mikrolitrelik dört fraksiyonda taze bir eend orph tüpünde elute edin. Bir x cal Modlin elüsyon tamponu kullanarak.

Ayrıştırılan fraksiyonu eşit hacimlerde iki temiz eend orph tüpüne dağıtın. Ardından, her iki tüpün içeriğini bir hızlı vakum kullanarak kurutun. Bir tüpten alınan kurutulmuş elüat, metinde anlatıldığı gibi bir gümüş boyama jeli çalıştırmak için kullanılırken, diğeri eksi 80 santigrat derecede saklanır.

Kurutulmuş numuneye kütle spektrometresinde ileride kullanılmak üzere, 50 mikrolitre sindirim tamponu ve 0.9 mikrolitre 100 milimolar tris fosfin hidroklorik asit ekleyin, indirgeme aşaması için karışımı 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin Ardından, 500 milimolar IDO asetamidden bir mikrolitre ekleyin ve karanlıkta 40 dakika daha inkübe edin. Numune alkilasyonuna izin vermek için: İkinci inkübasyon turundan sonra, karışıma bir mikrogram trip ekleyin. Numuneyi ya 37 santigrat derecede beş saat inkübe edin ya da inkübasyonu takiben gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Bir mikrolitre asetik asit ekleyerek reaksiyonu durdurduğunuzdan emin olun. Ardından, peptidin uç borusu pepine verimli bir şekilde bağlanması için Millipore fermuar ucunu, pipet ucunu metinde açıklandığı gibi hazırlayın. Peptit karışımını 20 kez karıştırın, yıkama solüsyonunu aspire ederek ve dağıtarak ucuna yaptığı peptit karışımını yıkayın.

Peptit karışımının, bağlı peptidi içeren uç ile uca verimli bir şekilde bağlanması için bu prosedürü iki kez tekrarlayın. 10 mikrolitre ıslatma ve dengeleme solüsyonunu aspire edin ve temiz bir eend orph tüpüne dağıtın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.

Elütasyonlu numuneler hızlı bir vakumda kurutulduktan sonra, numuneler hemen kütle spektrometresi ile analiz edilebilir veya kullanımdan önce eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Bu prosedürde kullanılan mikro sütunlar, yaklaşık 10 santimetre üç mikron ay C 18 reçinesi ile paketlenir ve orbitrap cihazı ile aynı hizada yerleştirilen bir pro Zion nano elektrosprey iyon kaynağına bağlanır. Bir pro Zion nano akış ikili HPLC pompası, peptit seyreltmesini elde etmek ve numune karmaşıklığına göre bir organik tampon gradyanı oluşturmak için peptit ayırmaları sırasında dakikada yaklaşık 300 nanolitrelik sabit bir uç akış hızı sağlamak için kullanılır.

Bu e coli SPA numunesi için, mobil faz çözücü A, %95 HPLC gradyan suyuna ve %0.1 formik asit içeren %5 aseto nitrile sahipken, çözücü B, kütle spektrometresini takiben %5 HPLC gradyan suyuna ve %0.1 formik asit içeren %95 aseto nitrile sahiptir. Düşük bir yanlış keşif oranı sağlamak için yıldız arayışı gibi bir olasılık algoritması kullanarak sonucu istatistiksel olarak filtreleyin, hem SPA etiketli RNA polimeraz sigma faktörü hem de bilinmeyen fonksiyona sahip yak LA proteini, alfa beta ve beta prime alt birimleri dahil olmak üzere çekirdek RNA polimeraz enzimi ile spesifik olarak saflaştırılır ve ayrıca RNA polimeraz geri dönüşüm faktörü. Etiketli RNA polimeraz sigma faktörünün aksine, yak L, ek olarak temel bir transkripsiyon sonlandırma anti belirleme faktörüne bağlanır ve bu da transkripsiyonda özel bir işlevi düşündürür.

RNA polimeraz Omega alt birimi ve transkripsiyon, sonlandırma ve belirleme faktörleri ve ABD ve NUSD dahil olmak üzere jel üzerinde belirgin olmayan birkaç başka küçük kosaflaştırıcı protein de LCMS tarafından tespit edildi. Tersine, kükürt makinelerinin mobilizasyonu etiketli bağımsız bir deneyde, S-U-F-B-S-U-F-C ve SUFD birbiriyle saflaştırıldı, bu da tek bir iskele kompleksi olarak demir kükürt kümesi biyosentezine ortak katılımı gösterdi. Bu temsili örnek, daha önce iyi çalışılmış, temel biyolojik süreçlere katılan yüksek açıklamalı bakteriyel MultiPro komplekslerinin genellikle verimli bir şekilde tanımlanabilen yeni ilişkili bileşenlere sahip olduğu gerçeğini vurgulamaktadır.

Bu yaklaşımı kullanarak, SUFB proteininin düşük kopya sayısı, kararlı çok birimli protein komplekslerinin bileşimini tanımlamak için SUFC ve SUFD aşağı çekme deneylerinden gözlemlenen güçlü yoğunluğa göre zayıf sinyal yoğunluğuna neden olmuş olabilir, ortak saflaştırma puanları, yem avının benzersizliği dikkate alınarak yüksek güvenilirlikli etkileşimlere atanmıştır, yem, yem ve av, av ilişkileri. Ardından, işaretleme kümeleme algoritması gibi grafik kümeleme prosedürlerini kullanarak. Ayrık protein kümeleri, bölümlenmiş olasılıksal PPI ağından tanımlanır.

Varsayılan etkileşim ağları, cyto scape kullanılarak görselleştirilebilir. Proteomik verilerin genomik yöntemlerle çıkarılan ek fonksiyonel ilişki kanıtlarıyla birleştirilmesi, daha önce açıklanmış e coli proteinlerinin yeni mekanik rollerini araştırmak için kullanılabilir. Burada, e coli'de daha geniş fonksiyonel komşuluklar olarak katılan protein komplekslerinin ve fonksiyonel modüllerin alt ağları tanımlanmıştır.

Ana hiyerarşik küme Graham, e coli'nin işlevsel olarak yetim ve karakterize edilmiş genleri için işlevsel tahminlerin kalıplarını ve mevcut açıklamaları gösterir, sarı ve mavi renkler sırasıyla mevcut ve çıkarılan işlevleri temsil ederken, gölge yoğunlukları güven puanlarını yansıtır. Çeşitli komşuluklarla ilişkili biyolojik süreçler sağ iç kısımlarda belirtilmiştir, entegre fiziksel ve işlevsel etkileşim ağı benzerlik puanlarına dayalı olarak temsili bir mahallenin bireysel bileşenlerini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, estia Coli'den elde edilen stabil protein komplekslerinin, kütle spektrometresi yaklaşımı ile birleştirilmiş afinite saflaştırması kullanılarak nasıl izole edilebileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Prensip olarak, bu teknik, mümkün olduğu kadar yeniden birleştirilmesi için zar protein komplekslerini veya başka herhangi bir türden protein komplekslerini karakterize etmek için uygulanabilir.