Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Bu prosedürün genel amacı, farklı zaman noktalarındaki otofajinin derecesini ve kapsamını ölçmek için işlem görmüş prostat tümör hücrelerinin kantitatif görüntülerini elde etmektir. Bu, öncelikle otofajiyi ve/veya hücre ölümünü indüklemek için hücrelerin arginin, dase veya diğer deneysel reaktiflerle işlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, canlı hücrelerin mi yoksa fikse edilmiş hücrelerin mi görüntüleneceğine karar vermek ve örnekleri buna göre hazırlamaktır.

Ardından, geniş alan, dekonvolüsyon veya yapılandırılmış aydınlatma floresan mikroskopisi kullanarak canlı veya fikse edilmiş hücrelerin 3D floresan görüntülerini elde edin. Son adım, otofagozom boyut dağılımı ve diğer hücre içi yapılarla kolokalizasyon üzerine istatistiksel veriler toplamaktır. Dijital 3D görüntü analiz yazılımı kullanan bu yaklaşım, sadece argininaz ile otofaji indüksiyonunun prostat tümör hücresi ölümüne neden olabildiğini değil, aynı zamanda bu hücrelerin apoptoz ve nekrozla ilişkili değişikliklerden morfolojik olarak farklı yapısal değişiklikler sergilediğini gösteren sonuçlar sağlayabilir.

Bu tekniğin mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, canlı bir hücre içinde meydana gelen spesifik bir moleküler olayın ne zaman ve nerede gerçekleştiğini kantitatif 3D görüntüleme ile gösterebilmesi ve ardından bunu üç boyutlu bir formatta sunabilmesidir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi, yeşil floresan proteinle eşleşmiş hafif zincir üç eksprese eden insan prostat kanseri hücrelerini 35 milimetrelik poli-D-lizine kaplı cam tabanlı kültür kaplarında büyütün. Hücreler, hızlı proliferasyonu kolaylaştıracak yeterli yoğunlukta ekilmeli, ancak görüntüleme zamanı geldiğinde hücrelerin aşırı büyümesine ve kümelenmesine neden olacak kadar yoğun olmamalıdır. Görüntülemeden yaklaşık bir saat önce, hücrelerdeki serbest arjininin tükenmesini sağlamak ve kanser hücrelerinde metabolik stres oluşturmak için seçili hücre örneklerini PBS içinde arjinin deaminaz veya ADI ile işlemleyin. 1,5 mikrolitre LysoTracker Red'i, %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren 20 mililitre RPMI ile seyreltin. Tüm besiyerlerini 37 °C'ye ısıttıktan sonra, seçilen örnekler için ADI içeren çözeltileri hazırlayın.

Her bir kültür kabına uygun medyum ekleyin; görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce, hücreleri LYO Tracker red içeren RPMI ile 37 °C'de 15 ila 45 dakika inkübe edin. Hava istasyonu çevresel muhafazasını açın ve 37 °C ile %5 karbondioksit seviyelerine dengelenmesini bekleyin; hücreleri PBS ile yıkayın ve medyumu yalnızca %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren standart RPMI ile değiştirin. Belirtildiği üzere örneklere DI ekleyin.

35 milimetre cover glass tabanlı kültür kaplarını özelleştirilmiş bir adaptöre yerleştirin. 60X büyütmeli, 1,42 sayısal açıklıklı objektif lensinde imersiyon yağı kullanın ve yerleştirilmiş kültür kabını mikroskop tablasına konumlandırın. Bu videoda, Delta vision personal IDV uygulamalı konumlandırma, dekonvolüsyon mikroskobu ve ilgili Soft Works uygulama paketinin kullanımıyla 3D mikroskopi gösterilmektedir.

Başlamak için, görüntüleme iş istasyonu ve cihaz kontrolörü dahil olmak üzere mikroskop sistemini açın. Mikroskop tablasını başlatmak için resolve 3D bilgisayar kontrol uygulamasını açın ve xenon ışık kaynağını çalıştırın. Işık kaynağının ısınması ve kararlı duruma ulaşması için 10 dakika bekleyin.

6X büyütmeli, 1,42 sayısal açıklıklı objektif lensin üzerine bir damla imersiyon yağı ekleyin ve preparat lamını, lameli aşağı bakacak şekilde, parlak alan veya harici aydınlatmanın yanı sıra kaba odak ayarını kullanarak objektif lensin üzerine ortalayın. İmersiyon yağı damlası ters çevrilmiş lamel ile temas edene kadar odak ayar düğmesini yavaşça çevirerek objektif lensi yükseltin. Bu noktadan itibaren, hücre tabakası ince odak ayar düğmesinin birkaç turuyla netleşmelidir.

Lamlar üzerindeki fikse edilmiş örneklerle çalışırken, hava kabarcığı bulunan veya bu alanlara yakın olan hücrelerden kaçınılması önerilir. Cam tabanlı kaplardaki canlı örnekleri görüntülerken, objektif lensini cam lam örtüsünün sınırları dışına çıkarmaktan kaçının. İstenilen görüş alanını seçin.

İdeal olarak, hücreler tüm uygun kanallarda iyi floresan sinyali göstermeli ve hücre içi içeriklerin kolayca görselleştirilebilmesi için lam üzerine yeterince tutunmuş ve yayılmış olmalıdır. Lateral X, Y ve Z odaklamasındaki küçük ayarlamalar, acquire 3D arayüzü kullanılarak bilgisayar tarafından kontrol edilebilir. Bir hücrenin orta kesitinden alınan belirli bir görüntü için istenen görüş alanına bağlı olarak binning ayarını birer birer veya ikişer ikişer olarak ayarlayın; maksimum piksel yoğunluğunun 3000 sayımı aşmayacağı şekilde pozlama parametrelerini belirleyin.

Genellikle, ilgili pozlama süresini artırmadan geçirme yüzdesi mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. Süre bir saniyenin üzerinde olmalıdır. Bu prosedürü, görüntülenmesi istenen her floresan rengi ve her ayrı görüş alanı için tekrarlayın.

En yüksek kaliteli görüntüleri elde etmek için, odağı sırasıyla hücre örneğinin hemen üstünün ve altının biraz dışına ayarlayarak Z yığınının üst ve alt sınırlarını belirleyin. Belirli bir Z yığındaki toplam görüntü sayısı, böylece bu sınırlar ve katmanlar arasındaki boşluk tarafından belirlenecektir. Görüntüleme sırasında hareket artefaklarını en aza indirmek için, görüntüleme modu dalga boyu olarak ayarlanabilir.

Ardından, fikse edilmiş örnekler için ZS yığını, canlı örnekler için ise önce ZS yığını sonra dalga boyu belirlenir. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra floresan görüntüler elde edilebilir. Floresan görüntüler daha sonra soft works kullanılarak dekonvolüsyona tabi tutulur ve ardından velocity kullanılarak analiz edilir.

Burada gösterilen görüntü dizisi, otofaji indüksiyonunun ilk 80 dakikası boyunca cwr 22 hücrelerinde meydana gelen fiziksel değişiklikleri göstermektedir. Bu görüntülerde beyaz noktalı çizgi hücrenin dış hattını, açık gölgeli bölge ise çekirdeğin konumunu temsil etmektedir. 80 dakikalık süre boyunca görüntüler; çekirdeğin hücre merkezinden uzaklaşmasını, fokal adezyon noktalarının azalmasını ve sonraki zaman noktalarında sırasıyla yeşil ve kırmızıyla gösterilen otosomların ve lizozomların genel olarak hücre merkezine doğru yer değiştirmesini ortaya koymaktadır.

Sarı renkle belirtildiği üzere, otozomlar ve lizozomlar arasında kolokalizasyonda küçük bir artış da gözlemlenmiştir. Ardından, CWR 22 hücrelerinin görüntülerindeki işaretli otozom ve lizozomları tanımlamak, saymak ve bunlarla ilgili istatistiksel veriler toplamak için velocity Dijital görüntüleme uygulama paketi kullanılmıştır. Burada, ilk oluşumlarından sonra ortaya çıkan otozomların sayısının ve boyutunun zamanla değişkenlik gösterdiği görülmektedir.

Otofaji indüksiyonunun 80. dakikasından sonra, otozom sayısında kademeli bir azalma ve buna paralel olarak otozomların ortalama boyutunda bir artış gözlemlendi. Ayrıca, Pearson korelasyon katsayısı analizi temel alındığında, otozomlar ve lizozomların kolokalizasyonunda ölçülebilir bir artış olduğu görüldü. Birlikte değerlendirildiğinde bu bulgular, otofaji stimülasyonu üzerine, çok sayıda küçük otozomun zamanla birleşerek daha büyük otozomlar oluşturduğunu göstermiştir.

Burada, DV modunda edinilen ve yeniden oluşturulan görüntülerin, simüle edilmiş geniş alan dekonvolüsyonu ile yapılandırılmış aydınlatma moduna göre yan yana karşılaştırması gösterilmektedir. OMX mikroskobu kullanılarak yan çözünürlük, geleneksel difraksiyon sınırlı mikroskobinin çözünürlüğünün iki katına kadar, 120 nanometreye kadar iyileştirilmiştir. Otozomların ve lizozomların küçük ölçekli kolokalizasyonu süper çözünürlüklü mikroskopi ile açıkça görülürken, geleneksel floresan görüntüleme ile neredeyse hiç fark edilememektedir.

Dekonvolüsyon mikroskopisi kullanmanın avantajlarından biri, farklı moleküller arasındaki daha doğru uzamsal bilgileri ortaya çıkaracak şekilde tüm görüntüleri 3D bir modele dönüştürmektir. Burada, otozomlar ve lizozomlar arasında önemli miktarda kolokalizasyonun meydana gelmeye başladığı daha geç bir zaman noktasındaki, otofaji geçiren bir Cwr 22 RV hücresinin genel görüntüsü gösterilmektedir. Beyaz renkle belirtilen e koherent boyama, bu videodaki hedef hücrenin ana hatlarını ortaya çıkarmaktadır.

3D yeniden oluşturulmuş model, otosomlar ve lizozomlar arasındaki füzyonun daha fazla mekansal detayını sunmaktadır. Sarı renkle belirtildiği üzere, yeşil hafif zincir üç sinyalleri ile kırmızı lizozom sinyalleri arasındaki etkileşim, sarı renk üretmek için birleşmiş sinyallerin varlığında belirgindir. Bu nedenle, söz konusu yaklaşım otofaji çalışmaları yürüten araştırmacılar için iki temel zorluğu ele alacaktır.

Öncelikle, mikroskop sahnelerinde orijinal fizyolojik durumunu korumak amacıyla mikro akışkanlar ve perfüzyon odası kullanarak stressiz bir ortam sağlamak istiyoruz. İkinci zorluk ise istatistiksel olarak anlamlı nicel görüntü verileri toplamaktır; sabitlenmiş hücreler için genellikle farklı hücrelerden çok sayıda görüntü alır ve bunları yararlı bilgilere dönüştürürüz. Ancak, canlı hücrelerde eşdeğer bilgileri edinmek için zaman içinde tek bir hücreyi takip etmemiz yeterlidir.

Bu nedenle, bu tekniğin diğer araştırmacıların farklı organlarda ve farklı hastalıklarda otofajinin işlevini ve rolünü incelemesine olanak sağlayacağına inanıyoruz.