Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Bu prosedürün genel amacı, farklı zaman noktalarında otofajinin derecesini ve derecesini ölçmek için tedavi edilen prostat tümörü hücrelerinin kantitatif görüntülerini elde etmektir. Bu, otofajiyi ve/veya hücre ölümünü indüklemek için önce hücrelerin arginin, daz veya diğer deneysel reaktiflerle muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, canlı hücrelerin mi yoksa sabit hücrelerin mi görüntüleneceğine karar vermek ve buna göre örnekler hazırlamaktır.

Ardından, geniş alan, evrişim bozukluğu veya yapılandırılmış aydınlatma floresan mikroskobu kullanarak canlı veya sabit hücrelerin 3D floresan görüntülerini elde edin. Son adım, otofagozom boyut dağılımı ve diğer hücre içi yapılarla kolokalizasyon hakkında istatistiksel veri toplamaktır. Dijital 3D görüntü analiz yazılımını kullanarak, bu yaklaşım, yalnızca arginin daz tarafından otomatik faj indüksiyonunun prostat tümör hücresi ölümüne neden olabileceğini değil, aynı zamanda bu hücrelerin apoptoz ve nekroz ile ilişkili değişikliklerden morfolojik olarak farklı yapısal değişiklikler sergilediğini gösteren sonuçlar elde edebilir.

Bu tekniğin şu anda mevcut olan diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, kantitatif 3D görüntülemenin, bir canlı hücre içinde meydana gelen belirli bir moleküler olayın ne zaman ve nerede olduğunu gösterebilmesi ve daha sonra bunu üç boyutlu bir formatta sunabilmesidir: Yeşil floresan proteini eksprese eden insan prostat kanseri hücrelerinin büyümesine başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi 35 milimetre poli de lisin kaplı cam alt kültür kapları üzerine birleştirilmiş hafif zincir hücreleri kaplanmalıdır hızlı çoğalmayı kolaylaştırmak için yeterli yoğunlukta, ancak görüntüleme sırasında hücrelerin aşırı büyüdüğü ve topaklandığı kadar değil. Serbest arginin hücrelerini tüketmek ve görüntülemeden yaklaşık bir saat önce kanser hücrelerinde metabolik stresi indüklemek için seçilen hücre örneklerini PBS'de arginin daz veya DI ile tedavi edin, 1.5 mikrolitre Lyo tracker kırmızısını %10 FPS ve %1 antibiyotik içeren 20 mililitre RPMI ile seyreltin. Tüm ortamları 37 santigrat dereceye kadar ısıttıktan sonra muamele edilen seçilmiş numuneler için bir DI ile çözeltiler hazırlayın.

Her bir kültür kabına uygun ortamı ekleyin, görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce, 37 santigrat derecede 15 ila 45 dakika boyunca LYO Tracker kırmızı içeren RPMI ile hücreleri inkübe edin. Hava durumu istasyonu çevre muhafazasını açın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite kadar dengelemeye izin verin, hücreleri PBS ile yıkayın ve ortamı yalnızca% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren standart RPMI ile değiştirin. Belirtildiği gibi örneklere bir DI ekleyin.

35 milimetre kapaklı cam alt kültür kaplarını özelleştirilmiş bir adaptöre monte edin. Altı DX büyütmeli, 1.42 sayısal açıklıklı objektif merceğinde daldırma yağı kullanın ve monte edilmiş kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Bu videoda, Delta vision kişisel IDV uygulanan pozisyon, dekonvolüsyon mikroskobu ve Associated Soft Works uygulama paketi kullanılarak 3D mikroskopi gösterilmektedir.

Başlamak için, edinme iş istasyonu ve cihaz kontrolörü dahil olmak üzere mikroskop sistemini açın. Mikroskop aşamasını başlatmak ve xenon ışık kaynağını açmak için resolve 3D bilgisayar kontrol uygulamasını açın. Işık kaynağının ısınması ve kararlı koşullara ulaşması için 10 dakika bekleyin.

Altı DX büyütmeli, 1.42 sayısal diyaframlı objektif merceğine bir damla daldırma yağı ekleyin ve slayt örneğini, parlak alan veya harici aydınlatmanın yanı sıra kaba odak kullanarak objektif merceğin üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde ortalayın. Düğmeyi ayarlayın, daldırma yağının vuruşu ters çevrilmiş kapak camı ile temas edene kadar objektif merceği yavaşça kaldırın. Bu noktadan sonra, hücre katmanı, ince odak ayar düğmesinin birkaç dönüşü içinde odaklanmalıdır.

Slaytlar üzerinde sabit numunelerle çalışırken, kabarcıklı herhangi bir alanın içinde veya yakınında hücrelerden kaçınılması önerilir. Canlı ile görüntülerkenampcam alt çanak üzerinde, objektif merceği cam kapak kaymasının sınırlarının dışına çıkarmaktan kaçının. İstediğiniz görüş alanını seçin.

İdeal olarak, hücreler tüm uygun kanallarda iyi floresan sinyali sergilemeli ve hücre içi içeriğin görselleştirilmesi kolay olacak şekilde kapak kayma yüzeyine yeterince bağlanmalı ve yayılmalıdır. Yanal X, Y ve Z odağındaki küçük ayarlamalar, edinme 3D arayüzü kullanılarak bilgisayar tarafından kontrol edilebilir. Bir hücrenin orta bölümünden geçen belirli bir görüntü için istenen görüş alanına bağlı olarak benning'i bire bir veya ikiye iki olarak ayarlayın, pozlama parametrelerini maksimum piksel yoğunluğu 3000 sayımı aşmayacak şekilde ayarlayın.

Genel olarak, iletim yüzdesi, karşılık gelen maruziyeti artırmadan mümkün olduğunca düşük ayarlanmalıdır. Bir saniyeden fazla süre. Görüntülenecek her floresan rengi ve her ayrı görüş alanı için bu prosedürü tekrarlayın.

En yüksek kalitede görüntüler elde etmek için, odağı sırasıyla hücre örneğinin üst ve alt kısmının biraz üzerine ayarlayarak Zack'in üst ve alt sınırlarını ayarlayın. Bu nedenle, belirli bir Z yığınındaki toplam görüntü sayısı, bu sınırlar ve katmanlar arasındaki boşluk tarafından belirlenecektir. Görüntü alımı sırasında hareket artefaktlarını en aza indirmek için, görüntü alma modu dalga boyuna ayarlanabilir.

Daha sonra sabit numuneler için ZS yığını ve ZS yığını, ardından canlı numuneler için dalga boyu. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, floresan görüntüleri elde edilebilir. Floresan görüntüler daha sonra yumuşak işler kullanılarak aktarılır ve daha sonra hız kullanılarak analiz edilir.

Burada gösterilen görüntü dizisi, otofaji indüksiyonunun ilk 80 dakikası sırasında cwr 22 hücrelerinde meydana gelen fiziksel değişiklikleri göstermektedir. Bu görüntülerde, beyaz noktalı çizgi hücrenin ana hatlarını temsil eder ve açık gölgeli bölge çekirdeğin konumunu temsil eder. 80 dakika boyunca, görüntüler çekirdeğin hücre merkezinden uzağa yer değiştirmesini, fokal yapışma noktalarının azalmasını ve otozomların ve lizozomların hücrenin merkezine doğru genel translokasyonunu ortaya çıkarır ve burada daha sonraki zaman noktalarında sırasıyla yeşil ve kırmızı olarak görüntülenir.

Sarı renkle gösterildiği gibi otozomlar ve lizozomlar arasında kolokalizasyonda küçük bir artış da gözlendi. Velocity Digital görüntüleme uygulama paketi daha sonra CWR 22 hücrelerinin görüntülerindeki etiketli otozomlar ve lizozomlar hakkında istatistiksel verileri tanımlamak, saymak ve toplamak için kullanıldı. Burada gösterilen, ilk oluşumlarından sonra otozomların sayısı ve boyutu, görünüşte zamanla değişir.

80 dakikalık otofaji indüksiyonundan sonra, otozomların ortalama boyutunda karşılık gelen bir artışla birlikte otozom sayısında kademeli bir düğme net azalması oldu. Ek olarak, Pearson'ın korelasyon katsayısı analizine dayalı olarak otozomların ve lizozomların kolokalizasyonunda ölçülebilir bir artış olmuştur. Birlikte, bu bulgular, otofajinin uyarılması üzerine, çok sayıda küçük otozomun zamanla daha büyük otozomlar oluşturmak üzere fsed olduğunu gösterdi.

Burada, DV modunda elde edilen ve yeniden yapılandırılan görüntülerin, simüle edilmiş geniş alan evrişim bozukluğu ve yapılandırılmış aydınlatma modunun yan yana karşılaştırması gösterilmektedir. OMX mikroskobu kullanılarak, yanal çözünürlük, geleneksel kırınım sınırlı mikroskobun çözünürlüğünün iki katı olan 120 nanometreye kadar iyileştirildi. Otozomların ve lizozomların küçük ölçekli kolokalizasyonu süper çözünürlüklü mikroskopi ile açıkça görülürken, geleneksel floresan görüntüleme ile neredeyse hiç belirgin değildi.

Dekonvolüsyon mikroskobu kullanmanın avantajlarından biri, tüm görüntüleri farklı moleküller arasında daha doğru uzamsal bilgileri ortaya çıkaracak bir 3B modele yeniden yapılandırmaktır. Burada, otozomlar ve lizozomlar arasında önemli miktarda kolokalizasyonun meydana gelmeye başladığı daha sonraki bir zaman noktasında otofaji geçiren bir hücre olan bir Cwr 22 RV'nin genel bir resmi gösterilmektedir. Beyaz renkle gösterildiği gibi e tutarlı boyama, bu filmde hedef hücrenin ana hatlarını ortaya çıkarır.

3B yeniden yapılandırılmış model, otozomlar ve lizozomlar arasındaki füzyonun daha uzamsal ayrıntılarını sağlar. Sarı renkle gösterildiği gibi, yeşil hafif zincir üç sinyali ile kırmızı lizozom sinyalleri arasındaki etkileşim, sarı üretmek için birleştirilmiş sinyallerin varlığında belirgindir. Dolayısıyla bu yaklaşım, otofaji çalışmaları olan araştırmacılar için iki büyük zorluğu ele alacaktır.

Her şeyden önce, mikroskop aşamalarında orijinal fizyolojik durumunu korumak için füzyon odası olan mikro sıvıyı kullanarak stressiz bir ortam sağlamak istiyoruz. İkinci zorluk, istatistiksel olarak ilgili nicel görüntü verilerini toplamaktır ve sabit hücreler için genellikle farklı hücrelerden çok sayıda görüntü alır ve bunları yararlı bilgilere dönüştürürüz. Bununla birlikte, yaşam hücresi ile, eşdeğer bilgi elde etmek için zaman içinde sadece bir hücreyi takip ederiz.

Bu nedenle, bu tekniğin diğer araştırmacıların farklı organ ve farklı hastalıklarda otofajinin işlevini ve rolünü incelemesini sağlayacağına inanıyoruz.