Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize'a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, bitkilerde vasküler taşınmanın yapısını ve işlevini keşfetmek için senkrotron tabanlı x-ışını mikro tomografi teknolojisini kullanmaktır. Bu, önce numunelerin bir ayna tutucusuna veya canlı bitki tutucusuna monte edilmek üzere hazırlanması, taranacak kısmın mümkün olduğunca dikey olmasının sağlanması ve gerekli ön fizyolojik ölçümlerin alınması ile gerçekleştirilir. İkinci adım, hazırlanan numuneleri veya canlı bitkileri A LS Beamline 8.3 0.2 kulübesine yerleştirmek ve kafesi tarama için sabitlemektir. Önümüzdeki.

Numunenin uygun şekilde konumlandırılmasından sonra tarama başlatılır. Son adım, verileri 3B görselleştirme işlemi için bir VISO'ya aktarmadan önce taramanın kalitesini normalleştirmek, yeniden yapılandırmak ve değerlendirmek için iş istasyonu bilgisayarlarını kullanmaktır. Sonuç olarak, x-ışını mikro tomografisi, bitkilerde su ileten damar sisteminin ara bağlantılarının ve fonksiyonel durumunun ince ayrıntılarını ortaya çıkarmak için kullanılır.

Bu tekniğin seri kesit alma ve ışık mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bitki dokusunun herhangi bir oryantasyonda benzeri görülmemiş bir çözünürlükle keşfedilebilmesidir. Bu yöntem, bitkilerde su taşınımının temel yönlerinden kuraklığa ve donma toleransına, patojenlerin konukçu bitkilerde sistemik olarak nasıl hareket ettiğine kadar bitki biyolojisi alanındaki temel soruları anlamamıza yardımcı olabilir. Bu protokol, açıklandığı gibi, gelişmiş ışık kaynağında çalışmak için tasarlanmıştır.

8.3 0.2. Diğer senkrotron tesislerinde çalışmak için ışın hattı uyarlamaları gerekebilir. Canlı bitkiler için numune hazırlamaya başlamak için bu tesislerin kullanımı için gerekli güvenlik ve radyasyon eğitimini takip ettiğinizden emin olun.

İlk olarak, bitkileri yaklaşık 10 santimetre çapındaki saksılarda büyütün, taranacak bitkinin ana gövdesinin veya diğer kısmının mümkün olduğunca ortalandığından ve saksıda dikey olarak yönlendirildiğinden emin olun. HRCT cihazı Hutch'un fiziksel boyutları, canlı bitkileri yaklaşık bir metre yüksekliğe kadar sınırlar. Sonuç olarak, canlı bitkilerin görüntülenmesi en iyi şekilde fide veya fidan üzerinde yapılır.

Küçük saksılarda yetiştirilen, canlı saksı bitkilerini monte etmek için özel yapım sert bir alüminyum saksı tutucusu kullanın. Üst plaka yüksekliği, bir dizi tencere yüksekliğine uyacak şekilde ayarlanmalıdır. Burada, plakanın üst kısmı, toprak yüzeyinin üst kısmı ile aynı hizada olacak şekilde tasarlanmıştır ve bitki, iki parçalı plakanın merkezinden çıkıntı yapar.

Tutucuya monte edildikten sonra, taramadan önce bitkinin fizyolojik durumunu belirlemek için SHO iniş aracı tarzı bir basınç odası veya klipsli bir yaprak parametresi kullanarak gövde suyu potansiyelini ölçün. Tekrar tekrar taranacak bitkiler üzerinde tutarlı bir tarama konumu sağlamak için bir mütevelli olarak hizmet etmek üzere gövdenin etrafına küçük bir bakır tel parçası bükün. Şimdi, alüminyum bitki tutucusunun üzerine bitkinin üzerine ince duvarlı bir akrilik silindir yerleştirin ve numuneyi stabilize etmek için vidalarla yerine sabitleyin.

Görüntü bozulmalarına neden olabilecek bitki parçalarının titreşimini ve hareketini daha da en aza indirmek için ek plastik sargı kağıt havlular ve bant kullanılmalıdır. Özel tencere tutucuyu hava yatağı aşamasına takın ve x-ışını kaynağı ile görüntüleme sensörü ve kamera ekipmanı arasına yerleştirilmiş yerine kilitleyin. Sapı mümkün olduğunca dikey olarak konumlandırdığınızdan ve görüş alanında kalmasını sağlamak için numuneyi manyetik ayna tabanı üzerinde ortaladığınızdan emin olun Rotasyon sırasında, taze bitki materyali, tipik olarak gövdeler veya evcil hayvanlar, canlı bir bitkiden hemen çıkarıldıktan sonra taranabilir.

Deneyin amacı ksilem ağının tamamını görselleştirmekse, önce kaplar içindeki su boşaltılmalı ve hava ile değiştirilmelidir. Bunu yapmak için, numuneyi iftira tarzı bir basınç odasına monte edin ve yaklaşık beş dakika boyunca düşük basınçta numuneden basınçlı hava veya nitrojen itin. Türler, gemi ağını tahliye etmek için gereken sürede farklılık gösterecektir.

Amaç, taze bitki dokusundaki emboli oluşumunun derecesini değerlendirmekse, kesimleri su altında yaparak taze bir tıraş bıçağı kullanarak bitkiden alınan örnekleri kesin. Daha sonra, tarama sırasında kurumayı önlemek için numuneyi bir paraform tabakasına sarın, numuneyi hava taşıyan aşama merkezine vidalanmış metal bir plakaya sabitlenmiş bir matkap aynasına monte edin ve numunenin görüş alanında kalmasını sağlamak için numuneyi daha önce açıklandığı gibi dikey olarak yönlendirin. Kurutulmuş odunsu dokudan örnekler hazırlamak için, örnekleri yaklaşık altı santimetre uzunluğunda keserek başlayın.

Hedeflenen tarama bölgesinde mümkün olduğunca düz olan ve çapı yaklaşık bir santimetre olan numuneleri seçin. Bir sonraki adım, optimum doku örneği görselleştirmesi ve görüntü kontrastı sağlamak için tüm numuneyi yavaşça kurutmaktır. Dokuda herhangi bir çatlamaya veya ayrılmaya neden olmadan numuneyi yavaşça kurutmak için odunsu doku numunesini düşük sıcaklıkta bir kurutma fırınına yerleştirin.

Bazı durumlarda, numuneye bağlı bir güvene dayalı işaretleyicinin olması istenebilir. Bu, taramalı elektron mikroskobu kullanılarak sonraki diseksiyon ve görselleştirmenin HRCT görüntüsündeki belirli noktalara yönlendirilebilmesini sağlar. Bunu yapmak için, parfüm kullanarak gövdenin dışına metal veya cam bir boncuk veya tel yapıştırın.

Son olarak, numuneyi taramadan önce yukarıda açıklandığı gibi matkap kontrolüne ve ortasına monte edin. Uygulamanız için en uygun büyütmeyi belirleyin. Burada kullanılan A LS Beamline 8.3 0.2, iki x beş x ve 10 x büyütme oranlarına sahip lenslerle tarama özelliğine sahiptir.

X-ışını enerjisini 15 kilo elektron volta ayarlayın. Maruz kalma süreleri genellikle numunenin kalınlığına ve yoğunluğuna bağlıdır ve 100 ila 1000 milisaniye arasında değişir. Uygulamanız için uygun olan açısal bir artış seçin.

Örnekler bir tarama sırasında 180 derece döndürülür ve döndürme sırasında çekilen görüntü sayısı, veri kümesinin boyutu, tarama aralığının uzunluğu ve nihai görüntü kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Tipik taramalar 0,25 derecelik artışlarla gerçekleştirilir ve tarama başına 513 görüntü elde edilir. Her tarama için görüntüler yakalanırken numunenin sürekli olarak döndüğü sürekli tomografi ayarı kullanılarak daha kısa tarama aralıkları elde edilebilir, Parlak alan ve karanlık alan görüntüleri de toplanmalıdır.

Parlak alan görüntüleri, ışında örnek olmayan görüntülerdir. Bunlar genellikle numunenin taranmasından önce ve sonra, numunenin yatay olarak çevrilmesiyle toplanır. Karanlık alanlar, x-ray deklanşörü kapatılarak toplanır.

Bu, kameranın x-ışınları olmadan gösterdiği sinyal miktarını ölçer. Tarama tamamlandıktan sonra, ham 2D TIFF görüntülerini alma bilgisayarından bir dosya sunucusuna aktarın ve ardından veri işleme için kullanılacak bir bilgisayara aktarın. Daha sonra, görüntüler yüzde iletim ölçeğine dönüştürülmelidir.

Beamline 8.3 0.2, ücretsiz olarak kullanılabilen yazılım paketleriyle indirilebilen ve kullanılabilen özel bir arka plan normalleştirme eklentisine sahiptir. Görüntü J veya Fiji, normalleştirilmiş görüntüleri ahtapot yazılım paketine yükleyin, ardından belirlenen işleme adımlarını kullanarak 2B ham TIFF görüntü dosyalarından bir 3B veri kümesini yeniden oluşturun. Daha sonra, görüntü yığını çeşitli yazılım paketlerinden birinde görselleştirilebilir.

Burada aviso yazılım paketi kullanılır, veri kümelerini sistem belleğine yükler ve örneği sanal enine, boylamasına veya radyal dilim yönelimlerinde görüntüler Veri kümesinin 3B öznitelikleri nedeniyle, örnek boyunca sanal dilimler, ilgilenilen bölgelerle hizalamak için herhangi bir düzlemde döndürülebilir. Segmentasyon tamamlandıktan sonra, hedef bitki yapılarını veya hacim, uzunluk, genişlik, su, hava vb. varlığı veya yokluğundaki fonksiyonel değişiklikleri ölçmek mümkündür. Senkrotron HRCT taramaları, Beamline 8.3 0.2 kullanılarak çok çeşitli bitki dokuları ve türleri üzerinde başarıyla uygulanmıştır ve 3D olarak benzeri görülmemiş bir çözünürlükte bitki ksileminin yapısı ve işlevi hakkında yeni bilgiler sağlamıştır.

Burada görüldüğü gibi 3D rekonstrüksiyonlar tarafından sağlanan görselleştirme ve keşif yetenekleri, hem tüketim numunelerinde hem de canlı bitkilerde Xylem ağları ile yapıların konumunun ve oryantasyonunun hassas bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. Burada, kuraklık stresine maruz kalan ve hem hava hem de su dolu traklar sergileyen sekoya ağacı gövdesinin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonunu görüyoruz Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dakikalar içinde gerçekleştirilebilir. Taramalı elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler, bitkilerin içinde gördüğümüz yapıları doğrulamak ve daha sonra veri analizi için kullandığımız işleme programlarına beslenen boyut eşiklerini bulmak için kullanılabilir.