Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Bu prosedürün genel amacı, hücre göçünü incelemek için yapışkan ve çözünür gradyanlar oluşturmaktır. Bu, spesifik olmayan hücre yapışmasını önlemek için bir yüzey olan ilk önce pasifleştirilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, mikro temaslı baskıdan pullar üretmektir.

Daha sonra, paketlenmiş yüzey mikro kontakt baskı ile strep avid çizgileri ile desenlendirilir. Çemberli din, mikroakışkan bir cihazın altına takılan daldırma kalemi litografisi kullanılarak noktalar halinde de basılabilir. Modifiye edilmiş yüzey, biyotin RGD'nin yapışkan bir gradyanı için bir temel görevi görecektir.

Son adım, çözünür bir kemoterapi cezbedici gradyan varlığında hücreleri yapışkan ipucu ile yüzeye yüklemektir. Sonuç olarak, canlı hücre mikroskobu, hem yapışkan hem de çözünür ipuçlarına yanıt olarak hücre göçünü göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, transwell veya boşluk odası tahlili ve geleneksel bir mikroakışkan kurulum gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, parçalanmış yüzey deseni sistemi Mikroakışkan cihazın, hücrelerin uzamsal olarak kontrol edilen yapışkan ipuçlarına ve yapışkan gradyanına ve aynı anda çözünür bir gradyana verdiği tepkilerin gözlemlenmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, hücre göçü alanındaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin hücre yapışmasının önemi ve reseptör görülen kinaz G-proteinine bağlı reseptörler gibi kemoterapi Texas reseptörleri ve RIN gibi yapışma reseptörleri arasında felce neden olabilir. İlk olarak, kapak fişlerini %100 etanol içinde bir rafa batırarak ve rafı 30 dakika boyunca bir paten su banyosuna koyarak temizleyin. Cam kapağı havada kurutun.

Daha sonra, cam kapak bir molar sodyum hidroksit içinde 30 dakika boyunca kayar. Daha sonra, bir buçuk litre mili küp su ile doldurulmuş bir beherde rafı dikkatlice eğerek cam yüzeyleri durulayın. Durulama işlemini her seferinde taze mili küp su kullanarak üç kez tekrarlayın.

Üçüncü durulamadan sonra, cam kapak yaklaşık yarım saat boyunca 60 santigrat derecede bir fırında kayar. Temiz cam kapak kızaklarının yarısını, kısmen suyla doldurulmuş 24 oyuklu bir plakadan yapılmış nemli bir odaya ayrı ayrı yerleştirin. Kuyular su ile doldurulur ve cam örtüler kuyuların üzerine serilir, Peg moleküllerinin %20'sinin biyotine aşılandığı bir polilisin ve polietilen glikol kopolimeri kullanılır.

PLL Peg biotin olarak kısaltılır, her cam kapak kızağında PBS'de 15 mikrolitre PLL Peg biotin damlası. Kalan temiz cam kapak fişlerinin diğer yarısını alın ve PEG solüsyonunu dikkatlice sandviçleyin. Kapak fişlerini nemli odada bir saat bekletin.

Bir saatlik kaymadan sonra, sandviç kapak, PEG kaplı yüzeyi kazımadan nazikçe birbirinden kayar ve UE suyu ile durulanır. Su, dübel ile muamele edilmiş tarafta kolayca kaymalıdır. Gerektiğinde.

Cam kapağı havayla kurutun, işlenmiş yüzey yukarı bakacak şekilde bir kağıt havlu üzerinde kayar, saklayın. Cam kapak, daha fazla kullanılana kadar vakumda kurur. Bu prosedür için gerekli olan silikon master, PDMS elastomeri için A-P-D-M-S damgasını bir Petri kabı içindeki Silicon Master'a yaklaşık bir santimetre yüksekliğe dökmek ve master ve PDMS karışımını bir saat boyunca 70 santigrat derecede bir fırında kürlemek için fotolitografi ile üretilir.

Daha sonra, PDMS damgası Silikon ustasından çıkarılır ve mikro kontakt baskı tekniğini kullanarak protein desenlerini basmak için boyuta göre kesilir, önce temizleyin ve desen tarafını bir UV ve ozon temizleyicide bir buçuk saat boyunca tedavi ederek PDMS damgalarını daha hidrofilik hale getirmek için ozon tedavisi hemen sonra yer. Ve 10 mikrolitre soyulmuş adini PDMS damgalarının üzerine yayın. İzlerin floresan mikroskobu altında görünmesi gerekiyorsa, soyulmuş avid ve LOR üç 50 gibi bir floro dördüne konjuge edilmiş soyulmuş Aden kullanın.

Nemli bir odada bir saat bekletin. Damgadaki fazla strep din'i kağıt mendil, kağıt ve hava ile çıkarın. Damgayı yaklaşık bir dakika kurutun.

Damgayı PLL peg biotin kaplı cam kapak sürgüsüne hafifçe bastırın. Floresan strep din kullanılmışsa, deseni bir epi floresan mikroskobu altında inceleyin. Protein desenleri, daldırma kalem litografisi kullanılarak da basılabilir.

Önce mililitre başına bir miligramın bir kısmını, strippin veya sıyrılmış avidan elif Fluor three 50'yi 10 kısım gliserol ile karıştırın ve karışımın beş mikrolitresini konsol üzerine yükleyin. Yazdırma hızını ayarlayın. Nokta boyutunu küçültmek için konsolun yüzeye temas süresi veya konsolun yüzeye dikey mesafesi.

Yaklaşık beş mikrometre, daldırma kalemi litografi alet mağazasının kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi yazdırma işlemine başlar. Basılı tüm yüzeyler kurur. Yüzey gradyanları oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen bir mikroakışkan cihaz kullanılır.

Birkaç saat boyunca sızıntı olmamasını sağlamak için bu tritin kaplı veya desenli cam kapak kayışlarını cihazın yapışkan tarafına yapıştırın. Cihazın kenarlarını ince bir ısıtılmış Vazelin tabakası ve bir kısım Vazelin ile bir kısım parafin mumu karışımının ikinci bir tabakası ile kapatın. İki karşıt gradyan oluşturmak için cihazın kanalını altı mikrolitre PBS ile doldurun.

Biri 70 mikrolitre biotin, dört floresein ve diğeri biyotinile peptit arginin glisin, spartik asit veya RGD ile konjuge edilmiş 70 mikrolitre biotin ile iki rezervuarı doldurun, numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Mikroakışkan cihazın biotin, RGD ve biotin uyumunu durulamak bu prosedürün en zor yönüdür çünkü hava kabarcıklarını hapsetme ve mikro temas baskılı izleri bozma riski vardır. Başarıyı sağlamak için, biyotin ve PBS dikkatli ve yavaş bir şekilde çıkarılmalıdır.

Biyotin çözeltilerini çıkarın ve hala mikroakışkan cihaza bağlıyken yüzeyi PBS ile iki kez dikkatlice durulayın. Floresan etiketli hücreleri mikroakışkan cihaza yüklemeden önce yapışkan gradyanın yönünü işaretleyin. Hücreleri sayın ve eşit hücre sayılarına sahip iki tüpe bölün.

Yıkayın ve yeniden canlandırın. % 10 FBS yıkamalı düşük glikoz DMEM gibi kemoterapi cezbedici içeren ortamlara sahip bir hücre tüpünü ve ortamdaki diğer hücre tüpünü askıya alın. % 0 FBS'li DMEM gibi kemoterapi cezbedici olmadan, her tüpteki nihai hücre konsantrasyonu, mililitre başına beşinci hücrelerin beş katı 10 olmalıdır.

Tüm çözeltileri mikroakışkan cihazdan çıkarın ve ön ısıtma mikroskobuna yerleştirin. % 0 F-B-S-D-M-E-M'de yeniden süspanse edilmiş 70 mikrolitre hücreyi bir rezervuara yükleyin. % 10 F-B-S-D-M-E-M içinde yeniden süspanse edilmiş 70 mikrolitre hücreyi başka bir rezervuara yükleyin.

Buharlaşmayı önlemek için rezervuarların üzerine gevşek bir şekilde yerleştirilmiş bant. Mikroakışkan cihazın kanalının görüş alanında olduğundan ve hücrelerin odakta olduğundan emin olun. Pozlama süreleri ve floresan filtreler gibi görüntü alma parametrelerini seçin.

Hücrelerin ve izlerin yanı sıra zaman noktaları ve kayıt uzunluğu olan parlak alan ve floresan görüntü dizisi, görüntü alma programını başlatır. Bu video, rekabet eden yapışkan ve çözünür gradyanlara sahip bir ortamda göç eden hücrelerin canlı hücre görüntülemesi için bir yöntemi göstermektedir. Floresan strippin ve biyotinile RGD içeren yapışkan izler, mikro kontakt baskı veya daldırma kalem litografi ile oluşturulmuştur.

Başarılı mikro kontakt baskı, yapışkan izlerin ve zehirli boya bölgelerinin net bir şekilde ayırt edilebildiği raylar boyunca floresan yoğunluğunun çizgi profili ile gösterilir. Daldırma kalem litografi ile basılan noktalar yuvarlatılmış görünür, yırtılma şeklinde görünmez ve bu da başarılı bir baskı işleminin olduğunu gösterir. Bu örnekte, noktalar satır ve sütun ayrımı 10 ila 15 mikrometre olarak ayarlanmış bir satırda yazdırılmıştır.

Bu mesafe, noktaların birbiriyle birleşmesini önlemek için yeterlidir, ancak tek bir görüş alanında birden çok noktanın görüntülenmesine izin verir. Çoğu mikroskop ayarında, basit mikroakışkan cihazı ile basılı parça üzerinde bir Grady yapışkan ipucu oluşturuldu. Biyotin, dört floresein ve biyotin RGD'yi bir mikroakışkan oda panelinin karşı taraflarına yükleyerek.

Toplam görüntü uzunluğu 3072 mikrometre olan 60 mozaik görüntü gösterisi. Panel B'de, floresan yoğunluğu tüm mozaiğin uzunluğu boyunca ölçüldü. Kanaldaki RGD gradyanını belirtmek için floresan yoğunluğuna doğrusal eğilim çizgileri takıldı.

Biotin, biotin RGD çözeltisini çıkardıktan sonra, çözünür bir gradyan eklemek için aynı oda kullanılabilir. Panel A, PBS ve floresein dolgulu rezervuarların yakınında ve T'de kanal boyunca floresein boyasının floresan yoğunluğunu sıfıra eşittir. Panel B, çözünür ipuçlarının floresan yoğunluğunu gösterir.

16 saatlik bir inkübasyondan sonra, karşılaştırılabilir sonuçlar gradyanın en az 16 saat boyunca stabil olduğunu göstermektedir. O, bu yöntem kullanılarak karşıt gradyanlara sahip bir mikroakışkan odada bir hücre göçü gözlendi ve burada temsili bir film gösterildi. Adeziv gradyan, strep avidan izleri üzerinde RGD olarak immobilize edildi ve çözünür gradyan sıfır ila %10 FBS idi.

Görüntüler toplam 20 saat boyunca her 15 dakikada bir çekildi. Gösterilen görüntü geçişi saniyede sekiz karedir. Bu ikinci film, FBS kaynağına doğru göç eden tek bir sarmal hücresini gösteriyor.

Gösterilen görüntü geçişi saniyede sekiz karedir. Hücre yörüngesini temsil eden mavi çizgi, bir hücre izleme yazılımı aracılığıyla elde edildi. Bu son grafik, ilk filmdeki görüntülerdeki hücre yörüngelerini göstermektedir.

Daha yüksek çözünür FPS konsantrasyonuna doğru göç eden hücre yörüngeleri, daha yüksek yapışık RGD konsantrasyonlarına doğru göç eden kırmızı hücre yörüngelerinde siyah olarak gösterilir. Bu yörüngeler, daha fazla hela hücresinin, daha yüksek konsantrasyonlarda yapışık RGD'ye göre kemoterapi cezbedici kaynağına doğru göç ettiğini gösterdi. Bu prosedürü denerken, yapışkan gradyan hazırlığı ve yaşam tarzı görüntüleme sırasında mikroakışkan cihazdaki PBS veya ortamın buharlaşmasını önlemeyi hatırlamak önemlidir, bu prosedürü takiben mikroakışkan cihazın tüm girişlerini kaplamak için gerekirse yapışkan bant kullanın.

Transfeksiyon ve hibrit çözelti mikroskobu gibi diğer yöntemler, hücre göçü sırasında protein, fokal adezyon proteinleri ve reseptörler tarafından etki eden hücre iskeletinin biyomekaniği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.