Name: Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Öğrenin mikro temas baskısı ve dip pen litografi kullanarak hücre göçünü incelemek için yapıştırıcı ve çözünür degradeler oluşturmayı. Bu yöntem rehberlik ipuçlarının hücre davranışı üzerindeki etkisini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Avustralya Araştırma Konseyi ve Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi fon kabul ve teşekkür Mikrokontak baskı için SU-8 master için Avustralya Ulusal İmalat Tesisi. SHN Yükseköğretim Malezya ve Universiti Sains Malezya Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.

1. PLL-PEG-biotin ile cam lameller arasında Pasivasyon Bu adım, hücreler microcontract baskı (Adım 2-3a) ya da daldırma kalem litografi (Adım 3b) ile oluşturulan cam lamel üzerinde belirli bölgeleri üzerine yapışır ve geçiş böylece yüzey etkisizleştirmek için tasarlanmıştır. Pasivasyon için, poli-L-lisin (PLL), ve polietilen glikol (PEG) arasında bir ko-polimer PEG moleküllerinin 20% biotin (-PEG-PLL biotin) ile aşılanmış olan kullanılır. <ol><li> Cam lameller (18 mm x 18 mm),% 100 etanol rafa daldırın onları temiz ve 30 dakika için bir sonicating banyo rafı yerleştirin. Hava ya da azot akışı altında cam lameller kurutun. </li><li> Daha sonra, 1 M NaOH içinde 30 dakika için cam lameller sonikasyon. Daha sonra dikkatli bir 1,5 L Milli-Q H 2 O ile dolu bir behere raf daldırma cam yüzeyleri durulama Durulama işlemi taze Milli-Q H 2 O her zaman kullanarak üç kez tekrarlayın. Içinde cam lameller kurutun60 ° C&#39;de bir fırında </li><li> Temiz bir cam il kısmen yarı H 2 O ile dolu bir 24 oyuklu plaka yapılmış bir nemli oda içinde ayrı ayrı lamelleri Her bir cam lamel üzerinde PBS-PEG-PLL biotin (1 mg / ml) 15 ul bırakın. Kalan temiz cam lamelleri diğer yarısını al ve dikkatlice sandviç PEG çözüm. Nemli oda içinde, 1 saat boyunca lamelleri bırakın. PEG-kaplı yüzey kazıma olmadan yavaşça Birbirlerinden uzakta bulunan sandviç lamelleri getirin ve Milli-Q H 2 O ile durulayın Su PEG-tedavi tarafında kolayca kapalı slayt gerekir. Gerekirse, tedavi edilen yüzey ile kağıt havlu üzerinde kurumaya cam lameller yukarı bakmaktadır. Daha fazla kullanıma kadar bir vakum desikatörde cam lameller saklayın. </li></ol> 2. Mikrokontak baskı için Pullar fabrikasyonu Biz pasifleştirilmiş cam lameller üzerine desen streptavidin parçaları iki süreç açıklanmaktadır. İlki, mikrofonrocontact baskı, genellikle bir PDMS damga artığını hangi bir silikon master imalat gerektirir. Bizim durumumuzda, PDMS damga üzerine desen 25 um bir özelliği yüksekliği ile 290 mikron merkez merkeze aralıklı 100 mikron çapında çizgilerdir. Aşağıda, biz uygun bir silikon master (Adım 2.1-2.3) ve PDMS damga (Adım 2.4) imal nasıl kısaca tanımlayınız. Bununla birlikte, cam lameller üzerine protein yapısı baskı için uygun olan literatür 19-23 &#39;de tarif mikrokontak baskı için çok protokol vardır. Ustalar da özel yapılmış ve ticari kaynaklardan satın alınabilir. <ol><li> MilliQ H 2 O ile iyice 10 kez, 20 dakika için gofret yıkayın.: İlk olarak, pirana çözeltisi (v sülfürik asit ve% 30 hidrojen peroksit 3:01 v) içinde inkübe edilerek silikon gofret (4 &quot;çapında) temiz 150 fırında gofret kurulayın ° CO / N. </li><li> 100% izopropil alkol izledi% 100 aseton ile temiz ve kuru silikon gofret, durulayın. Sonraki40 sn için 3,100 rpm&#39;de gofret üzerine GM1070 SU-8 fotorezist (Gersteltec Sarl) spin-kat 2 ml 25 mikron kalınlığında bir katman yaratmak için. Örnek sonra 95 daha 5 dk ardından 5 dakika ° C için 65 ° C&#39;de sıcak bir plaka üzerinde pişirilir </li><li> Istenilen desen (Bir Quintel Q6000 maske hizalama kullanarak örneğin) bir Fotoşablonlarda altında 60 sn süreyle UV ışığına SU-8 fotorezist Açığa ve pişirme işlemi 2.2 tarif tekrarlayın. Sonra örnek 100% izopropil alkol durulanır ve azot akışı altında kurutuldu 4 dk için SU-8 geliştirici (Gersteltec Sarl) olarak gofret daldırarak tarafından geliştirilmiştir. UV ışığa maruz değildi SU-8 fotorezist alanı böylece PDMS damga ters desen oluşturarak, kaldırılır. </li><li> Sonraki adım silikon usta bir PDMS damga döküm olduğunu. İlk olarak, iyice elastomer prepolimer 10 kısım (Sylgard 184) ile sertleştirme maddesi 1 kısmı (w / w) karıştırılır. Bir vakum hattında bağlı bir desikatör içinde gazdan arındırmak sonra, karışım hava kabarcıklarını çıkarmak için:1 saat için. Sonraki, yüksekliği yaklaşık 1 cm bir Petri kabı içine silikon ana üzerine PDMS elastomer dökün ve 1 saat boyunca 70 fırında ° C master ve PDMS karışımı kür. Son olarak, PDMS pul silikon kalıp çıkarılır ve ebatlara kesilir. </li></ol> 3. Pasifize Cam lameller üzerine desenlendirme Streptavidin veya Yapıştırıcı Cues Cam lameller pasivasyon sonra, protein modelleri mikrokontak baskı (Adım 3a) ya da dip-kalem litografi (Adım 3b) yazdırılır. Bizim durumumuzda, streptavidin RGD eğimleri (Adım 4) için temelini oluşturan çizgiler olarak yazdırılır. Aynı prosedür, aynı zamanda yapışkan desenler oluşturmak için matris proteinleri baskı için de kullanılabilir. Yüzeylere biyomoleküllerin desenlendirme için mikrokontak baskı için alternatif bir yöntem daldırma kalem litografi olduğunu. Daldırma kalem litografi, bir konsol yüzey üzerine çözelti küçük bir hacim transfer etmek için kullanılır. Sundurmalar boyutu, vÇözeltinin iscosity, yüzey üzerinde konsol temas süresi, baskı odasında yüzey hidrofobikliği ve nem basılı özellikleri boyutunu belirler. Bu yöntemin avantajı, usta ve pul üretmek için gerek yoktur gibi değişik şekilleri, her bir deney için basılabilir olmasıdır. Dezavantajı belirli bir desenini yazdırmak ve daldırma kalem litografi birçok laboratuvarda mevcut olmayabilir, bir uzman alet gerektiren uzun sürer olmasıdır. Biz kullanılan daldırma kalem litografi cihazı Bioforce Nanobilim gelen NanoeNabler oldu. Burada, biz Spt10 konsol kullanıldığı için, çapı &lt;10 mikron idi küçük noktalar yazdırılır. 3a. Mikrokontak Baskı (μCP) Tekniği <ol><li> Temizlemek ve PDMS damga daha fazla hidrofilik hale, 1.5 saat için bir UV ve ozon (Bioforce Nanobilim dan, örneğin, UV Ozon Procleaner) içinde PDMS pul desenli yan tedavi etmek için. Alternatif olarak, bir plazma kullanmakAynı amaç için daha kısa bir süre için temizleyici. Bu işlem, baskı işlemini geliştirir bir okside PDMS yüzey 24 oluşturur. </li><li> Ozon ya da plazma muamele, yer ve PDMS pul üzerine 10 ul streptavidin (PBS içinde 1 mg / ml) yayılır ve nemli oda (örneğin, kısmen doldurulmuş 6-plaka gibi, Aşama 1.3) içinde 1 saat boyunca izin hemen sonra . Parça floresan mikroskop altında görülebilir olmalıdır, örneğin streptavidin AlexaFluor350 olarak fluorofor bağlanmış olduğu streptavidin kullanın. </li><li> Kağıt mendil ve hava yaklaşık 1 dakika boyunca damga kuruması ile damga fazlalıklar streptavidin çıkarın. Hafifçe PLL-PEG-biotin-kaplamalı cam lamel üzerine damga basın. </li><li> Fluoresan streptavidin Adım 3.a2 olarak kullanıldığında ise, bir mikroskop altında Epifloresans kullanılarak desen incelemek. Bir desikatörde baskılı yüzeyleri saklayın. </li></ol> 3b. Dip Pen Litografi <ol><li> İlk olarak, 1 mg / ml streptavidin ya da stre 1 kısım karıştırma10 kısım gliserol (v / v) ile ptavidin-AlexaFluor350 ve dirsek üzerine karışım 5 ul yükleyin. Daldırma kalem litografi aracın kullanım kılavuzunda anlatıldığı gibi Sonra yazdırma işlemi başlar. Yaklaşık 5 um nokta boyutunu azaltmak için, yazdırma hızını ayarlamak, yüzeye konsol yüzeyinde veya dikey mesafeye konsol zaman başvurun. Şekil 2c &#39;de gösterilen örnekte, noktalar, satır ve 10-15 um sütun ayırma ayarlanmış olan bir çizgi halinde basıldı. Bu mesafe birbirine birleştirilmesi gelen noktalar önlemek için yeterli olduğunu ancak çoğu mikroskop ayarları ile görünümü tek bir alanda birden fazla nokta görüntülenmesini sağlar. </li><li> Bir desikatörde baskılı yüzeyleri saklayın. </li></ol> 4. Streptavidin desenli yüzeyler üzerine Yapıştırıcı Degradeler oluşturma Biz, streptavidin (Şekil 3) ya da işbirliği ile kaplanır cam lameller üzerine biyotin-RGD bölgesinin yapışkan gradyanları oluşturmakpasifleştirilmiş cam lameller üzerine ntain streptavidin desenleri (Şekil 5). Bir yüzey degrade oluşturmak için, biz pasif difüzyonla istikrarlı bir çözüm degrade oluşturur piyasada mevcut mikroakışkan cihazı (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D denir) kullanılır. Streptavidin bağlanma yerleri için rekabet için, (bkz. Şekil 1) RGD konjuge değildi biotin RGD ve biyotin iki zıt degradeler istihdam. <ol><li> Yapışkan-Slide Kemotaksis 3D cihazın yapışkan yüzüne streptavidin kaplı ya da desenli bir cam lameller dikkate alınmalıdır. Birkaç saat süreyle hiçbir sızıntı olmamasını sağlamak için, cihazın kenarları ısıtılan vazelin ince bir tabaka ile ve parafin mum, 1 kısım (w / w) ile vazelin 1 kısım bir karışımın bir ikinci tabaka ile kapatılır. </li><li> Kanal içinde 6 ul PBS ile cihazın kanal doldurun. Sonra, PBS ve 70 ve m de 0.03 mg / ml &#39;den biyotin-4-florosin 70 ul ile iki rezervuar doldurmaku; 0.03 mg l / ul biotin RGD sırasıyla PBS içinde. 1 saat için karanlıkta oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin. </li><li> Biyotin çözüm çıkarın ve yine PBS ile iki kez mikroakışkan cihaza takılıyken dikkatlice yüzeyin durulanması. Yapışkan eğim yönü işaretleyin ve eğer gerekirse, 4 ° C&#39;de PBS ile doldurulmuş cihaz depolamak ancak aygıt, kurumanın emin olun. Gerekirse, bir floresan mikroskop ile yapışkan degrade analiz. </li></ol> 5. Canlı Hücre Görüntüleme için fluorophores ile Hücrelerinin Etiketleme Hücreler floresan mikroskopta hücre izleme yardımcı floresan boyalar ile etiketlenir. Ortak problar floresan organel belirteçleri, hücre çekirdeği etiketler gibi syto 64 Kırmızı vardır. Bunu yapmak için, hücreler ilk önce 45 dakika için kültür ortamı olarak 1 uM syto Red 64 ile inkübe edilir, PBS ile üç kez yıkanır ve son olarak PBS ile üç kez daha yıkanır. Hücrelerin olmaması gerektiğini unutmayınuzun süre için PBS içinde tutulur. Hücre izleme için alternatif boyalar sitoplazma leke CellTracker serisi ve hücre göçü ve bölünme sırasında korunur. Floresan füzyon proteini ile hücrelerinin transfeksiyonu geçişi sırasında ilgi çekici bir proteinin hücre altı dağılımı kaydetmek için özellikle yararlıdır. Ancak, organik boyalar genellikle daha foto-ağartma hızlı floresan proteinleri, uzun süreli gözlemler için mümkün olmayabilir. 6. Mikroakiskan Cihaz içine Çözünür Gradient Hücrelerinin yükleniyor <ol><li> Eşit hücre sayıları iki tüpler içine floresan etiketli hücreleri ve split sayın. Bu tür% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile düşük glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) gibi kemoatraktan içeren bir ortam ile birlikte bir hücre tüp yıkanır ve tekrar süspansiyon. Yıkama ve kemoatraktan,% 0 FBS ile, yani DMEM olmadan ortam içinde hücreler diğer tüp tekrar süspansiyon. Nihai konsantrasyonHer bir tüp içinde hücrelerin 5 x 10 5 hücre / ml olmalıdır. </li><li> Mikroakışkan cihaz (Adım 4.3) gelen tüm çözümler çıkarın ve (Adım 7) mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Bir rezervuar ve başka içine HeLa hücreleri 70 ul (% 10 FCS DMEM içinde 5 x 10 5 hücre / ml) içine hücre 70 ul (% 0 FBS DMEM içinde 5 x 10 5 hücre / ml) yerleştirin. Gevşekçe buharlaşma önlemek için rezervuar üzerinde bir kaset yerleştirin. Yüzey hücreleri önce görüntüleme için ön kuluçkaya bırakılır, bu hücrelerin gradyan olmadan büyüme ortamı olarak cihazın içine yüklenmiş olması tavsiye edilir. Cihaz daha sonra mikroskop sahne üzerine yerleştirilen ve medya diğer% 10 FBS ile bir rezervuar ve DMEM FBS olmadan degrade medya yani DMEM ile değiştirilir. </li></ol> 7. Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi Canlı <ol><li> Mikroskobu (Nikon Ti-E) açın ve deneme başlamadan önce en az 1 saat sahnede ısınmak. </li><li> Emin olun MICR kanalofluidic cihaz görüş alanında yer almaktadır ve hücreler odak noktası vardır. Böyle pozlama süreleri ve floresan filtreler, hücre ve parçaları yakalar parlak alan ve floresan görüntü sırası yanı sıra zaman noktaları ve kayıt uzunluğu (örneğin 16 saat boyunca her 15 dakika) olarak görüntü alma parametresini seçin. </li><li> Böyle ImageJ Manuel İzleme veya Ibidi Kemotaksis ve Geçiş Aracı uygun yazılımları ile verileri analiz. </li></ol>

<ol><li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+BioChem%22%5BJournal%5D)">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sensing+through+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li>
<li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+cells+make+decisions%3A+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).</li>
<li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li>
<li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+%28GPCR%29-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).</li>
<li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271(2007).</li>
<li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients%3A+role+of+intracellular+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li>
<li>Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.ibidi.com/service/faq.html">http://www.ibidi.com/service/faq.html</a> (2010).</li>
<li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li>
<li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+micropatterns+for+cells%3A+a+microcontact+printing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).</li>
<li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li>
<li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin%2C+VEGF%2C+or+Both+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leukocyte+response+to+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li>
<li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li>
<li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing%3A+Limitations+and+Achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li>
<li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+dip-pen+nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li>
<li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithography+and+nanochemistry%3A+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li>
<li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li>
<li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek hiçbir ticari çıkarları var.

Bu protokol, hücre göçü üzerine kimyasal olarak modifiye yüzeyler ve kemoatraktan degradelerin etkilerini incelemek için (Ibidi gelen yapışkan-Slayt Kemotaksis 3D) piyasada satılan bir mikroakışkan cihaz kullanılır. Gradyan kanalın uzunluğu boyunca difüzyon ile kurulmuş olmasıdır mikroakış ayar akış gerektirmez. Akış ayirt kararlı gibi fokal adezyon ve küçük odak kompleksleri ve sinapsların 26 oluşturacak en lökositler gibi hızlı göç hücreleri oluşturmak fibroblastlar gibi yavaş yavaş göç hücreleri...

Yönetmen hücre göçü birçok hücre temel bir özelliğidir ve embriyonik gelişim, enfeksiyona karşı savunma ve yara iyileşmesi gibi birçok normal fizyolojik süreçlerin, önemli bir yönüdür. Buna ek olarak, hücre göçü aynı zamanda damar hastalığı, tümör hücre metastazları ve kronik inflamasyon 1,2 gibi pek çok hastalıkta önemli bir rol oynar. Hücreleri klasik göç ülkeleri iken - polarizasyon, protrüzyon genişleme, adhezyon, kuvvet oluşturma ve arka retraksiyon oluşumu - genellikle 3,4 kabul edilir, sinyal entegrasyon koordine edildiği zamanmekansal mekanizmalarının aydınlatılmasında daha zor olmuştur. Ekstrasellüler matriks (ECM) hücre yapışması için bir substrat olarak hizmet verir ve doğal kimyasal ve fiziksel 5 6 çeşitliliği ile, cep navigasyon 7,8 için directional kuyruklarını sağlar. Bu yapışkan işaretler 9, çözünür faktörlerin 10-12 ek olarak &lt;/ Sup&gt; gibi kemokin ve büyüme faktörleri gibi olabilir kemoatraktan reseptörleri ve onların aşağı motogenic sinyalizasyon yönlendiriliyor hücre göçü teşvik. Şu anda, nişan ve adezyon reseptörleri (yani integrinler) ya da reseptör tirozin kinaz (RTK) olarak kemoatraktan reseptörleri yoluyla sinyal, baskın olup olmadığı bilinmemektedir. Ne de reseptör sistemlerinin hiyerarşileri hücre tipine özgül olduğunu bilinmektedir. Canlı hücresi mikroskopi toplu tayinlerde erişilebilir değildir ve immobilize 13,14 ve çözünür ipuçları 15 16 degradeleri oluşturmak için mikroakışkan cihazlar ile kombine edilebilir bir bilgi zenginliği verir. Burada açıklanan yöntem kolayca bir hücre biyolojisi laboratuvar (Şekil 1) de uygulanabilir olması hücre göçü için bir görüntüleme tahlil oluşturmak için ticari olarak mevcut microfluidic bölme ile bağlantılı olarak yüzey modifikasyonu için basit ve köklü bir dizi adım kullanır. MonteMikroakışkan cihaz cam 17 ile karşılaştırılabilir ve dağılabilir molekül gradyanlar en az 16 saat boyunca stabil optik nitelikleri vardır. Sistem Epifloresans ve ileri mikroskopi için teknikler de kullanılabilir. Diğer kemotaksisi düzeneklerinin 18 farklı olarak, bu sistem yavaş yavaş göç eden, yapışık hücre kayıt için uygundur. Önemlisi, sistemin modüler ve kolaylıkla alternatif yapıştırıcı veya çözünebilir göç ipuçları ve çeşitli hücre tiplerinin incelenmesi giriş sağlar.

<table><tbody><tr><td>Kapak camı boyama kıyafetleri</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542 E40</td><td>Lamel rafı</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Bağlayıcı</td><td></td><td>ED 53 serisi</td></tr><tr><td>Silikon gofret</td><td>Silikon Quest</td><td>708-007</td><td>Bor katkılı < 100> gofret, 4" çap, 500 &mu; m, tek tarafı cilalı</td></tr><tr><td>GM1070 SU-8 fotorezist</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştirici</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kürleme maddesi</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer prepolimer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-biyotin (%20)</td><td>SuSos AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biyotin (%20)</td><td>1 mg/ PBS</td></tr><tr><td>Floresein</td><td>Sigma</td><td>46955'te</td> ml, PBS Streptavidin-AlexaFluor350 Invitrogen S-11249'da <td>1 mM</td></tr>, PBS Biotin-4-floresein Invitrogen B-1370 0.03 <tr><td></td><td></td><td></td> & <td>mu'da 1 mg / ml</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>; g/&mu; PBS</td></tr><tr><td>Biotin-RGD</td><td>GenScript</td><td>SC1208'de</td> l, PBS Syto 64 Kırmızı Invitrogen S-11346 1 & <td>mu'da 0.03 mg / ml</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>; PBS'de</td></tr><tr><td>M Yapışkan slayt kemotaksisi 3D</td><td>Ibidi</td><td>80328</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Greiner sarı eğimli uç</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739261</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>Parafin mumu, mp 55-57 &deg; C</td><td>Sigma</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Nano eNabler 10 & mu; m konsol </td><td>BioForce</td><td>SPT-SC-10s</td><td></td></tr><tr><td>Image J yazılımı</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>Manuel İzleme eklentisi</td><td>Fabrice Cordeli&#232; res</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td></tr><tr><td>Kemotaksis ve Taşıma Aracı</td><td>Ibidi GmbH</td><td></td><td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td></tr></tbody></table>

floresan mikroskobu ile görüntüleme hücre göç yapıştırıcı ve Çözünür degradeler oluşturma

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Hücreler gibi ekstrasellüler matriks ve bu büyüme faktörleri gibi çözünür ipuçlarının glikoproteinleri gibi yapışkan ipuçlarının yüksek konsantrasyonlarda doğru algılayıp geçirebilirsiniz. Burada, canlı hücre görüntüleme ile uyumlu bir mikroakışkan haznesi, yapışkan ve çözünebilir ipuçlarının karşıt degradeler oluşturmak için bir yöntem özetlemektedir. Poli-L-lisin ve polietilen glikol (PEG-PLL) bir kopolimerin cam lameller etkisizleştirmek ve biyomoleküller ve hücre spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için kullanılır. Daha sonra, mikrokontak baskı ya da daldırma kalem litografi yapıştırıcı işaret olarak biyotinile peptid arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) için bağlantı noktaları olarak görev yapan pasif yüzeyler üzerinde streptavidin üzerinden parçaları oluşturmak için kullanılır. Bir mikroakışkan cihaz modifiye edilmiş yüzeye yerleştirilir ve streptavidin parça üzerinde yapışkan işaretler (100% 0 ile% RGD RGD) ve gradyan oluşturmak için kullanılır. Son olarak, aynı mikroakışkan cihaz bir kemoatraktan Suc bir gradyan oluşturmak için kullanılıryapışkan ipuçlarının gradyanı ters yönde çözünür işaret olarak fetal bovin serumu (FBS), gibi h.

Hücre göçmen sinyalleri 25 entegre anlamak için, biz rakip yapıştırıcı ve çözünür eğimleri (Şekil 1) ile bir ortamda geçirmeniz floresan mikroskobu ile görüntü hücreleri için bir yöntem geliştirdik. Floresan streptavidin biotinlenmiş RGD içerdiği Yapıştırıcı şarkıları mikrokontak baskılı parçalar ve daldırma kalem litografi (Şekil 2) ile oluşturulmuştur. Başarılı mikrokontak baskı yapışkan parçalar ve anti-kirlenme bölgeleri açıkça (Şekil 2b) ayırt edilebilir...

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre göçünü incelemek için yapışkan ve çözünür gradyanlar oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle spesifik olmayan hücre yapışmasını önlemek amacıyla bir yüzeyin pasivasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım ise mikro temas baskılama yöntemiyle damgaların hazırlanmasıdır.Ardından, işlem görmüş yüzey, mikro temas baskılama yoluyla streptavidin çizgileriyle desenlenir. Streptavidin, bir mikroakışkan cihazın tabanına eklenmiş daldırma kalem litografisi kullanılarak noktalar şeklinde de basılabilir. Modifiye edilmiş yüzey, biyotin RGD'nin bir yapışma gradyanı için temel görevi görecektir.Son adım, hücrelerin çözünür bir kemoatraktan gradyanı varlığında yapışkan işaretçiye sahip yüzeye yüklenmesidir. Nihayetinde, hem yapışkan hem de çözünür işaretçilere yanıt olarak hücre göçünü göstermek için canlı hücre mikroskopisi kullanılır. Bu tekniğin transwell veya boşluk odacığı deneyi ve geleneksel mikroakışkan düzenek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüzey desenli mikroakışkan cihazın entegre sisteminin; hücrelerin mekansal olarak kontrol edilen yapışkan işaretçilere, yapışkan gradyana ve çözünür gradyana olan yanıtlarının aynı anda gözlemlenmesine olanak tan

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, iyi tanımlanmış mikroçevresinin mekansal ve zamansal degradeleri üretebilir degrade üreten mikroakışkan cihaz mikroimalat için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, degrade üreten mikroakışkan cihaz yönlendirilmiş hücre göçü, embriyogenez, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı çalışma için kullanılabilir.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Kimyasal ve oksijen gradyanlarının kontrolü hücre kültürleri için esastır. Bu makale, hücre göçü çalışmaları için kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonlarını güvenilir bir şekilde üretebilen ve karmaşık enstrümantasyon olmadan biyolojik laboratuvarlarda pratik olarak kullanılabilen bir polidimetilsiloksan-polikarbonat (PDMS-PC) mikroakışkan cihazını bildirmektedir.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Burada, kemotaktik kompleman C5a gradientinde fare yerleşik periton makrofajlarını görüntülemek için zaman atlamalı, faz-kontrast mikroskobu kullanan yöntemleri açıklıyoruz. Protokoller diğer bağışıklık hücrelerine genişletilebilir.

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Granül hidrojellerin arayüzü içinde ve içine 3D hücre göçünün kantitatif değerlendirmesi için bir protokol burada sunulmaktadır.

Granül Hidrojel Biyomalzemeler İçinde ve İçine Üç Boyutlu Hücre Migrasyonunun Ölçülmesi

Öğrenin mikro temas baskısı ve dip pen litografi kullanarak hücre göçünü incelemek için yapıştırıcı ve çözünür degradeler oluşturmayı. Bu yöntem rehberlik ipuçlarının hücre davranışı üzerindeki etkisini değerlendirir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Daha fazla video keşfet