Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Bu prosedürün genel amacı, hücre göçünü incelemek için yapışkan ve çözünür gradyanlar oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle spesifik olmayan hücre yapışmasını önlemek amacıyla bir yüzeyin pasivasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım ise mikro temas baskılama yöntemiyle damgaların hazırlanmasıdır.

Ardından, işlem görmüş yüzey, mikro temas baskılama yoluyla streptavidin çizgileriyle desenlenir. Streptavidin, bir mikroakışkan cihazın tabanına eklenmiş daldırma kalem litografisi kullanılarak noktalar şeklinde de basılabilir. Modifiye edilmiş yüzey, biyotin RGD'nin bir yapışma gradyanı için temel görevi görecektir.

Son adım, hücrelerin çözünür bir kemoatraktan gradyanı varlığında yapışkan işaretçiye sahip yüzeye yüklenmesidir. Nihayetinde, hem yapışkan hem de çözünür işaretçilere yanıt olarak hücre göçünü göstermek için canlı hücre mikroskopisi kullanılır. Bu tekniğin transwell veya boşluk odacığı deneyi ve geleneksel mikroakışkan düzenek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüzey desenli mikroakışkan cihazın entegre sisteminin; hücrelerin mekansal olarak kontrol edilen yapışkan işaretçilere, yapışkan gradyana ve çözünür gradyana olan yanıtlarının aynı anda gözlemlenmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, hücre yapışmasının önemi ile reseptör tirozin kinazlar, G-proteini kenetli reseptörler ve adezyon reseptörleri gibi kemotaktik reseptörler arasındaki etkileşim gibi hücre göçü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Öncelikle, lamel camlarını bir raf içinde %100 etanolün içine daldırarak ve rafı 30 dakika boyunca sonikatörlü bir su banyosuna yerleştirerek temizleyin. Lamel camlarını havada kurutun.

Ardından cam lamelcikleri, 1 M sodyum hidroksit içerisinde 30 dakika boyunca sonike edin. Sonrasında, rafı 1,5 litre milli cube su ile dolu bir beherin içine dikkatlice eğerek cam yüzeyleri durulayın. Durulama işlemini, her seferinde taze milli cube su kullanarak üç kez tekrarlayın.

Üçüncü durulamanın ardından, cam lamel ve kapakçıkları 60 °C'lik bir etüvde yaklaşık yarım saat boyunca kurutun. Temiz cam kapakçıkların yarısını, kısmen suyla doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakadan oluşturulan nem odasına tek tek yerleştirin. Kuyucuklar suyla doldurulur ve cam kapakçıklar, etkileşim için kuyucukların üzerine yerleştirilir. %20'lik PEG moleküllerinin biotinle aşılandığı, polilizin ve polietilen glikolün bir kopolimeri kullanılır.

PLL Peg biotin olarak kısaltılan PLL Peg biotin'ten, her bir cam lamel üzerine PBS içinde 15 µL damlatın. Kalan temiz cam lamellerin diğer yarısını alın ve PEG çözeltisini dikkatlice araya sıkıştırın. Lamelleri nemli oda içerisinde bir saat boyunca bekletin.

Bir saat sonra, sandviç şeklindeki lamlar, PEG kaplı yüzeyi kazımadan nazikçe birbirinden ayrılır ve UE suyu ile durulanır. Su, PEG işlem görmüş taraftan kolayca akıp gitmelidir. Gerekirse.

İşlem görmüş yüzeyleri yukarı bakacak şekilde cam lamelleri bir kağıt havlu üzerinde hava ile kurutun. Cam lamelleri, daha sonra kullanılana kadar vakumlu bir desikatörde saklayın. Bu prosedür için gerekli olan silikon master, fotolitografi yoluyla üretilmiştir; PDMS elastomerini dökerek A-P-D-M-S damgasını oluşturmak için silikon master'ı bir Petri kabı içine yaklaşık bir santimetre yüksekliğinde yerleştirin ve master ile PDMS karışımını bir fırında 70 °C'de bir saat boyunca kürleyin.

Ardından, PDMS damga Silikon kalıptan çıkarılır ve mikro temas baskılama tekniği kullanılarak protein desenleri basmak için uygun boyutta kesilir; önce PDMS damgaları, desen tarafı bir buçuk saat boyunca UV ve ozon temizleyicide işleme tabi tutularak daha hidrofilik hale getirilir. Ozon işleminin hemen ardından, PDMS damgaların üzerine 10 µL striptavidin yerleştirilir ve yayılır. Florasan mikroskop altında izlerin görünür olması gerekiyorsa, striptavidin-fluor 350 gibi bir florofora konjuge edilmiş striptavidin kullanın.

Nemli bir oda içerisinde bir saat boyunca bekletin. Damga üzerindeki fazla strep din'i peçete, kağıt ve hava ile temizleyin. Damgayı yaklaşık bir dakika boyunca kurutun.

Damgayı PLL pimi biyotin kaplı cam lameline hafifçe bastırın. Eğer floresan strep din kullanılmışsa, deseni bir epi-floresans mikroskobu altında inceleyin. Protein desenleri, daldırma kalem litografisi kullanılarak da basılabilir.

Öncelikle, 1 mg/mL konsantrasyondaki strippin veya stripped avidan elif Fluor three 50'in bir birimini, 10 birim gliserol ile karıştırın ve bu karışımdan 5 µL miktarını kantilevere yükleyin. Yazdırma hızını ayarlayın. Benek boyutunu küçültmek için kantileverin yüzey üzerindeki temas süresini veya kantileverin yüzeye olan dikey mesafesini düzenleyin.

Dip-pen litografi cihazı kullanım kılavuzunda belirtildiği şekilde, yaklaşık beş mikrometre ile yazdırma işlemine başlanır. Yazdırılmış tüm yüzeyler bir desikatörde saklanır. Yüzey gradyanları oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen bir mikroakışkan aygıt kullanılır.

Birkaç saat boyunca sızıntı olmadığından emin olmak için tritin kaplı veya desenli cam lamelini cihazın yapışkan tarafına yapıştırın. Cihazın kenarlarını ısıtılmış ince bir Vazelin tabakasıyla ve ardından bir ölçek Vazelin ile bir ölçek parafin mumunun karışımından oluşan ikinci bir tabakayla sızdırmaz hale getirin. İki karşıt gradyan oluşturmak için cihazın kanalını altı mikrolitre PBS ile doldurun.

İki rezervuardan birini 70 µL biotin-fluorescein ile, diğerini ise 70 µL biotinle konjuge biotinillenmiş peptid arginin glisin aspartik asit (RGD) ile doldurun; örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Mikroakışkan cihazdaki biotin, RGD ve biotinfitlerin durulanması, hava kabarcıklarının hapsolma ve mikro temas baskı ile oluşturulmuş izlerin bozulma riski nedeniyle bu prosedürün en zor kısmıdır. Başarıyı sağlamak için biotin ve PBS dikkatli ve yavaş bir şekilde uzaklaştırılmalıdır.

Biyotin solüsyonlarını uzaklaştırın ve yüzeyi, mikroakışkan cihaza hala bağlıyken PBS ile dikkatlice iki kez durulayın. Floresan işaretli hücreleri mikroakışkan cihaza yüklemeden önce yapışkan gradyanın yönünü işaretleyin. Hücreleri sayın ve eşit hücre sayılarına sahip iki tüpe bölün.

Yıkayın ve yeniden süspanse edin. Hücrelerin bir tüpünü, %10 FBS içeren düşük glikozlu DMEM gibi kemoatraktan içeren ortamla yıkayın ve diğer hücre tüpünü ise %0 FBS'li DMEM gibi kemoatraktan içermeyen ortamda süspanse edin; her tüpteki nihai hücre konsantrasyonu mililitre başına 5 × 10⁵ hücre olmalıdır.

Tüm çözeltileri mikroakışkan cihazdan uzaklaştırın ve cihazı önceden ısıtılmış mikroskop tablasına yerleştirin. %0 FBS DMEM içerisinde resüspande edilmiş 70 µL hücreyi bir rezervuara yükleyin. %10 FBS DMEM içerisinde resüspande edilmiş 70 µL hücreyi diğer rezervuara yükleyin.

Buharlaşmayı önlemek için rezervuarların üzerine gevşekçe bant yapıştırın. Mikroakışkan cihazın kanalının görüş alanında ve hücrelerin odakta olduğundan emin olun. Pozlama süreleri ve floresan filtreler gibi görüntüleme parametrelerini seçin.

Hücrelerin ve izlerin yanı sıra zaman noktalarının ve kayıt süresinin belirlendiği parlak alan ve floresan görüntü dizisini belirleyerek görüntüleme programını başlatın. Bu video, rakip adhezif ve çözünür gradyanların bulunduğu bir ortamda göç eden hücrelerin canlı hücre görüntülemesine yönelik bir yöntemi göstermektedir. Floresan işaretli strippin ve biyotinize RGD içeren adhezif izler, mikro temas baskılama veya daldırma kalem litografisi ile oluşturulmuştur.

Başarılı mikro temas baskı, yapışkan izlerin ve antifouling bölgelerin net bir şekilde ayırt edilebildiği izler boyunca floresan yoğunluğunun çizgi profilinin görülmesiyle belirlenir. Dip-pen litografisi ile basılan noktalar, gözyaşı şeklinde değil yuvarlak görünür; bu da baskı işleminin başarılı olduğunu gösterir. Bu örnekte noktalar, satır ve sütun arası mesafe 10 ile 15 mikrometre olarak ayarlanarak bir hat şeklinde basılmıştır.

Bu mesafe, noktaların birbirleriyle birleşmesini önlemek için yeterlidir, ancak tek bir görüş alanında birden fazla noktanın görüntülenmesine olanak tanır. Çoğu mikroskop ayarıyla, basit bir mikroakışkan cihaz kullanılarak basılı yol üzerinde yapışkan ipuçlarından oluşan bir gradyan oluşturulmuştur. Bunun için biotin florisresen ve biotin RGD, bir mikroakışkan oda panelinin karşıt taraflarına yüklenmiştir.

A, toplam görüntü uzunluğu 3072 mikrometre olan 60 mozaik görüntüyü göstermektedir. B panelinde, floresan yoğunluğu tüm mozaiğin uzunluğu boyunca ölçülmüştür. Kanaldaki RGD gradyanını belirtmek için floresan yoğunluğuna doğrusal trend çizgileri uygulanmıştır.

Biotin RGD çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra, aynı hazne çözünür bir gradyan oluşturmak için kullanılabilir. Panel A, T eşittir sıfır anında, PBS ve fluorescein dolu rezervuarların yakınındaki ve kanal boyunca fluorescein boyasının floresan yoğunluğunu göstermektedir. Panel B, çözünür uyaranların floresan yoğunluğunu göstermektedir.

16 saatlik inkübasyonun ardından, karşılaştırılabilir sonuçlar gradyanın en az 16 saat boyunca stabil kaldığını göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak, karşıt gradyanların bulunduğu bir mikroakışkan odacıkta hücre migrasyonu gözlemlenmiş olup temsili bir video burada gösterilmiştir. Adhezif gradyan, strep avidan izleri üzerine immobilize edilmiş RGD; çözünür gradyan ise %0 ile %10 FBS arasındaydı.

Görüntüler, toplam 20 saat boyunca her 15 dakikada bir alınmıştır. Gösterilen görüntü geçişi saniyede sekiz karedir. Bu ikinci video, FBS kaynağına doğru göç eden tek bir heli hücresine aittir.

Gösterilen görüntü geçişi saniyede sekiz karedir. Hücre yörüngesini temsil eden mavi hat, bir hücre izleme yazılımı aracılığıyla elde edilmiştir. Bu son grafik, ilk videodaki görüntülerden elde edilen hücre yörüngelerini göstermektedir.

Çözünür FPS'nin yüksek konsantrasyonuna doğru göç eden hücre yörüngeleri kırmızıyla, adherent RGD'nin yüksek konsantrasyonlarına doğru göç eden hücre yörüngeleri ise siyahla gösterilmiştir. Bu yörüngeler, HeLa hücrelerinin adherent RGD'nin yüksek konsantrasyonlarına kıyasla kemoatraktan kaynağına doğru daha fazla göç ettiğini göstermiştir. Bu prosedür uygulanırken, adeziv gradyan hazırlama ve zaman atlamalı görüntüleme sırasında mikroakışkan cihazdaki PBS veya medyumun buharlaşmasını önlemenin önemli olduğunu unutmayın; mikroakışkan cihazın tüm girişlerini kapatmak için gerekirse yapışkan bant kullanın.

Hücre göçü sırasında proteinler tarafından yürütülen hücre iskeletinin biyomekaniği, fokal adezyon proteinleri ve reseptörler gibi ek soruları yanıtlamak için transfeksiyon ve hibrit solüsyon mikroskobisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.