Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Bu gösteri, floresan etiketli proteinleri canlı hücrelerde bir 3D matriste görüntülemeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, floresan etiketli proteinleri ifade eden kararlı hücre hatları oluşturun. Bu hücreleri bir 3D kollajen matrisine yerleştirin, ardından konfokal bir mikroskop kullanarak göç eden hücrelerin hızlandırılmış görüntülerini elde edin.

Sonuç olarak, sonuçlar, hızlandırılmış görüntüleme ve FP analizi yoluyla göç eden hücrelerdeki protein lokalizasyonunu ve dinamiklerini aydınlatır, Protein dinamiklerini ve lokalizasyonunu 3D ve gerçek zamanlı olarak gözlemler. Hücre göçündeki temel soruları ele almak için bir yol sunar. Örneğin, yapışkan kontaklar sitoplazmik proteinler tarafından nasıl düzenlenir?

Ve ayrıca bu temaslar spesifik inhibitörler tarafından nasıl bozulur. % 80 ila 90 co akıcılığına sahip bir P 35 çanak kültür hücrelerinde, üreticinin talimatlarına göre lipo 2000 kullanarak hücreleri ilgilenilen plazmid ile transfekte eder. Sonra hücreleri bir inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, hücreleri iki P one 50 Petri kabına bölün ve gece boyunca inkübe edin. G four 18'in mililitresine 50 mikrogram eklemek için ortamı doldurun. İki hafta boyunca antibiyotik seçimi altında kültüre devam edin.

G dört 18 dirençli koloni için kültürü inceleyin. Sonra ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanarak. GFP pozitif kolonileri tanımlayın ve işaretleyin.

Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, işaretlenmiş her koloni için hücrelerin kurumasını önlemek için ince bir sıvı tabakası bırakın. Sterilize edilmiş bir pamuklu çubukla kenardan mümkün olduğunca yakın silin ve koloninin üzerine 10 mikrolitre tripsin pipetleyin.

Her koloni için hızlı bir şekilde tekrarlayın. Daha sonra hücre ayrılması için plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Mikroskop altında yuvarlak görünümü doğrulayın.

Her koloniye 10 mikrolitre tripsin ekleyin, hücreleri plakadan tamamen ayırmak için pipetleyin. Daha sonra, stabil kolonileri çoğaltmak için her bir hücre kolonisini 24 kuyulu bir çanak kültürün tek bir kuyusuna aktarın. Daha sonra, standart western blot ve immünofloresan kullanarak kolonilerin protein ekspresyonunu değerlendirin.

Seçilen hücre çizgilerini genişletin, camın yüzey modifikasyonu. Alt tabak optimum kollajen bağlanması sağlar. 300 milimetre açıklığı olan her bir P 35 kabının cam kısmına 10 mikrolitre silolama solüsyonu pipetleyin.

Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Solüsyonu aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca üç kez filtrelenmiş suyla yıkayın. Suyu çıkarın ve bulaşıkları 1,5 saat boyunca 50 santigrat derece sıcak bir tabağa koyun.

Kurumasını sağlamak için bulaşıkların üst kısımlarını tabaktan biraz uzağa yerleştirin. Kuru bulaşıklar soğuduktan sonra, her bir kabın cam kısmına 300 mikrolitre% 2 glutaraldehit çözeltisi pipetleyin. Bir saat inkübe edin, ardından PB S3 ile her biri 10 dakika yıkayın.

Bir saat boyunca UV ışığına maruz bırakarak bulaşıkları sterilize etmeye devam edin. İlk pelet 100 mikrolitre santrifüjleme ile floresan izleyici parçacıkları. Sıvıyı atın ve parçacıkları 500 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin.

Beş yıkama yapın, ardından parçacıkları 30 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, tripsin kullanarak GFP eksprese eden hücreleri hasat edin ve mililitrede 2 milyon hücrelik bir süspansiyonu bir einor tüpüne hazırlayın 240 mikrolitre büyüme ortamını pipetleyin. 12.6 mikrolitre bir molar yığın, 20 mikrolitre filtrelenmiş su, 50 mikrolitre hücre çözeltisi ve 10 mikrolitre floresan parçacık ekleyin.

Son olarak, 167 mikrolitre sığır dermis kollajeni ekleyin, bir çözelti çözeltiyi iyice karıştırın. Şimdi 80 mikrolitreyi hazırlanan silolanmış kabın cam kısmına aktarın. Jelin polimerize olması için 37 santigrat derecede 50 dakika inkübe edin.

Sonra dikkatlice iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Mikroskop odasını 37 santigrat derece sabit bir durum sıcaklığına dengeleyin, hücre ortamını yenileyin. DIC görüntüleme için nötr bir pH değerini korumak için, çanağın üst kısmını ince bir paraform şeridi ile bir cam üst kısımla değiştirin.

Yağa daldırma hedefi için buharlaşmayı önlemek için tabağın yan tarafını örtün. Objektif konumuna bir damla daldırma sıvısı yerleştirin. Mikroskop aşamasında çanağı içeren kollajen jeli, böylece çanak daldırma sıvısı ile temas eder.

Örneğe odaklanın ve aşama kaymasını en aza indirmek için görüntüyle ilgilenen hücreleri arayın. Yemeğin yaklaşık 45 dakika oturmasına izin verin. Uzun bir yakalamaya başlamadan önce, inhibitör ekleme deneyleri için görüntü elde etme parametrelerini belirtin.

İstenilen çalışma konsantrasyonunda ilaçla takviye edilmiş ortamı hazırlayın. Nötr bir pH korumak için hücre ortamını yenileyin, ancak perfil ile kapatmayın. Numuneyi mikroskoba aktarın ve ilaç tedavisi sırasında görüntülemeye devam edin.

Görüntüyü duraklatın, tabağı rahatsız etmeden tabağın üstünü yakalayın ve dikkatlice çıkarın. Ortamı aspire edin ve ilaç içeren ortamı tabağa pipetleyin. Sonra tabağı dikkatlice değiştirin.

Üst frap kurulumu sistemler arasında farklılık gösterir. Bu yüzden üreticinin talimatına danışın. İlk olarak canlı hücre görüntüleme için parametreleri ayarlayın.

Foto ağartma için. Hücreye zarar vermeden floresan sinyalini foto-ağartmak için yeterli lazer gücü elde etmek için bu parametreleri uygulama hücreleri üzerinde test edin. Ardından, en az beş kare elde ederek örnek üzerinde görüntü yakalamaya başlayın.

Ardından ilgilenilen bölgeyi foto ağartın. Kurtarma süresi boyunca yakalamaya devam edin. İstatistiksel bir analiz yazılımı kullanarak, foto ağartma öncesi ve sonrası foto ağartılmış alanın zaman içindeki ortalama floresan yoğunluğunu ölçün.

Kurtarma eğrisini üstel denkleme sığdırın. Üstel uyum eğrisinden yarı devre ve son yoğunluk parametrelerini elde edin. Ardından, finalin ilk floresan yoğunluklarına oranını alarak mobil fraksiyonu hesaplayın.

Bu 3D canlı hücre görüntüleri, GFP aktin eksprese eden sağlıklı epitel hücrelerini gösterir. Dört günlük kültürden sonra, bu hücreler bir 3D kollajen matrisinde bir kist oluşturdu. Bazı hücreler kistin yüzeyi boyunca göç ederken, diğerleri kistin iç kısmı içinde göç etti.

Göç eden hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerinin bir sonucu olarak matris deformasyonu, çevreleyen matrise gömülü izleyici parçacıkların yer değiştirmesi yoluyla analiz edilir. RO kinaz inhibisyonunun çekiş kuvveti üzerindeki etkisi burada gösterilmiştir. İzleyici parçacık hareketleri, farklı zaman noktalarının maksimum projeksiyon görüntüsü olarak görüntülenir ve her zaman noktası sahte renklidir.

Alternatif olarak, tek bir izleyici parçacığın görüntüleri, izleyici parçacığın hareketini göstermek için bir montaj olarak görüntülenir. Zamanla, bu izleyici parçacık, sırasıyla Y 2 7 6 3 2'nin eklenmesinden önce ve sonra göç eden hücrenin arka kenarına doğru ve ondan uzaklaştı. Frap analizi, tipik floresan geri kazanımını gösteren üç boyutlu bir matriste göç ederken GFP aktin eksprese eden hücreleri takip eder Optimize edilmiş lazer ayarlarında bir foto ağartma deneyinden sonra, sağlıklı ve hasarsız hücreleri korurken, ilgilenilen bölgenin floresan yoğunluğu arka plan seviyesine kıyasla gözle görülür şekilde azalır.

Bu grafik, kurtarma eğrisinin üstel bir fonksiyonla uyumunu gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, matristeki hücrelerin tohumlanması bir saat sürebilir. Üç amino propil trimetil ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu yüzden kimyasal davlumbazda çalışmak gibi önlemler alın. Ayrıca, bir 3D matristeki hücrelerle çalışırken steril koşulları korumayı unutmayın.