Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Bu demonstrasyonun amacı, 3 boyutlu bir matriks içindeki canlı hücrelerde floresan işaretli proteinleri görüntülemektir. İlk olarak, floresan işaretli proteinler eksprese eden stabil hücre hatları oluşturun. Bu hücreleri 3 boyutlu bir kolajen matrise ekleyin ve ardından konfokal mikroskop kullanarak göç eden hücrelerin zaman ayarlı (time-lapse) görüntülerini elde edin.

Sonuç olarak, zamanla seyreden görüntüleme ve FP analizi aracılığıyla göç eden hücrelerdeki protein lokalizasyonu ve dinamikleri aydınlatılmakta; protein dinamikleri ve lokalizasyonu 3 boyutlu ve gerçek zamanlı olarak gözlemlenmektedir. Bu yöntem, hücre göçündeki temel soruların yanıtlanması için bir yol sunar. Örneğin, yapışma temasları sitoplazmik proteinler tarafından nasıl düzenlenir?

Ve ayrıca bu temasların spesifik inhibitörlerle nasıl bozulduğu incelenir. P 35 kapta %80 ila %90 konfluensle kültüre edilen hücreler, üretici talimatlarına uygun olarak Lipofectamine 2000 kullanılarak ilgili plazmid ile transfekte edilir. Ardından hücreler bir inkübatöre yerleştirilir.

Ertesi gün, hücreleri iki adet P one 50 Petri kabına paylaştırın ve gece boyunca inkübe edin. Medyumu 50 µg/mL G four 18 eklemek üzere yenileyin. Kültüre iki hafta boyunca antibiyotik seçimi altında devam edin.

Kültürü G four 18 dirençli kolonlar açısından inceleyin. Ardından, ters floresan mikroskop kullanarak GFP pozitif kolonları tanımlayın ve işaretleyin.

Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, işaretlenmiş her koloni için hücrelerin kurumasını önlemek amacıyla ince bir sıvı tabakası bırakın. Sterilize edilmiş bir pamuklu çubukla kenarların mümkün olduğunca yakınını silin ve koloninin üzerine 10 µL tripsin pipetleyin.

Her koloni için işlemi hızla tekrarlayın. Ardından, hücrelerin ayrılması için plakayı 37 °C'de inkübe edin. Mikroskop altında yuvarlak görünümü doğrulayın.

Her koloni üzerine 10 µL tripsin ekleyin, hücreleri plakadan tamamen ayırmak için pipetleyin. Ardından, stabil kolonileri çoğaltmak için her bir hücre kolonisini 24 kuyucuklu bir kültür kabının tek bir kuyucuğuna aktarın. Sonrasında, standart western blot ve immunofloresans yöntemlerini kullanarak kolonilerin protein ekspresyonunu değerlendirin.

Seçilen hücre hatlarını genişletin; camın yüzey modifikasyonunu gerçekleştirin. Taban kısmı optimal kolajen bağlanmasını sağlar. 10 milimetre açıklığa sahip her bir P 35 tabağın cam kısmına 300 microliters silolanma çözeltisi pipetleyin.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Solüsyonu aspire ederek çekin ve her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez filtrelenmiş su ile yıkayın. Suyu uzaklaştırın ve kapları 1,5 saat boyunca 50 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin.

Kurumaya izin vermek için kapların üst kısımlarını hafifçe kaydırarak yerleştirin. Kuru kaplar soğuduktan sonra, her kabın cam kısmına 300 µL %2'lik glutaraldehit çözeltisi pipetleyin. Bir saat boyunca inkübe edin, ardından 10'ar dakikalık sürelerle 3 kez PBS ile yıkayın.

Kapları bir saat boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. İlk olarak, 100 µL floresan izleyici partikülü santrifüj ederek çöktürün. Sıvıyı dökün ve partikülleri 500 µL besiyerinde yeniden süspanse edin.

Beş kez yıkama işlemi gerçekleştirin, ardından partikülleri 30 µL medyumsun içinde yeniden süspande edin. Sonrasında, trypsin kullanarak GFP eksprese eden hücreleri hasat edin ve bir eppendorf tüpüne mililitre başına 2 milyon hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın. 240 µL büyüme medyumu pipetleyin. 12,6 µL bir molar HEPES, 20 µL filtrelemiş su, 50 µL hücre solüsyonu ve 10 µL floresan partikül ekleyin.

Son olarak, 167 µL sığır dermis kolajeni ekleyin ve çözeltiyi iyice karıştırın. Hazırlanmış silolanmış tabağın cam kısmına 80 µL aktarın. Jelin polimerize olması için 37 °C'de 50 dakika inkübe edin.

Ardından, dikkatlice iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Mikroskop haznesini 37 °C sabit sıcaklığa getirin ve hücre ortamını yenileyin. DIC görüntüleme için nötr pH'ı korumak amacıyla, kabın üst kısmını ince bir parafilm şeridi içeren cam bir kapakla değiştirin.

Yağ daldırma objektifi için buharlaşmayı önlemek amacıyla kabın yan tarafını kapatın. Objektif konumuna bir damla daldırma sıvısı damlatın. Kapla birlikte kolajen jeli, kap daldırma sıvısıyla temas edecek şekilde mikroskop tablasına yerleştirin.

Sahne kaymasını en aza indirmek için örneğe odaklanın ve görüntülemek istediğiniz hücreleri arayın. Kabın yaklaşık 45 dakika boyunca dinlenmesine izin verin. Uzun süreli bir görüntüleme işlemine başlamadan önce, inhibitör ekleme deneyleri için görüntü toplama parametrelerini belirleyin.

İstenilen çalışma konsantrasyonunda ilaç içeren takviyeli besiyerini hazırlayın. Nötr pH'ı korumak için hücre besiyerini yenileyin ancak perfilm ile kapatmayın. Örneği mikroskoba aktarın ve ilaç tedavisi sırasında görüntülemeye geçin.

Görüntüyü duraklatın, tabağı sarsmadan üst kapağını dikkatlice yakalayıp çıkarın. Besiyerini aspire edin ve ilaç içeren besiyerini pipetle tabağa aktarın. Ardından tabağın kapağını dikkatlice tekrar kapatın.

Top FRAP kurulumu sistemler arasında farklılık gösterir. Bu nedenle üretici talimatlarına başvurun. İlk olarak canlı hücre görüntüleme parametrelerini ayarlayın.

Fotobleyçleme (photobleaching) işlemi için. Hücreye zarar vermeden floresan sinyalini fotobleyçlemek için yeterli lazer gücünü elde etmek amacıyla bu parametreleri pratik hücreleri üzerinde test edin. Ardından, örnek üzerinden en az beş kare alacak şekilde görüntü yakalamayı başlatın.

Ardından, ilgi bölgesini fotobleykleme işlemine tabi tutun. Toparlanma süresi boyunca görüntü yakalamaya devam edin. Bir istatistiksel analiz yazılımı kullanarak, fotobleykleme öncesi ve sonrası fotobleyklenen alanın ortalama floresan yoğunluğunu zaman içinde ölçün.

Toparlanma eğrisini eksponansiyel denkleme uydurun. Yarım ömür ve final şiddeti parametrelerini eksponansiyel uyum eğrisinden elde edin. Ardından, final floresans şiddetinin başlangıç floresans şiddetine oranını alarak mobil fraksiyonu hesaplayın.

Bu 3D canlı hücre görüntüleri, GFP aktin eksprese eden sağlıklı epitelyal hücreleri göstermektedir. Dört günlük kültürün ardından, bu hücreler 3D kolajen matris içinde bir kist oluşturmuştur. Bazı hücreler kistin yüzeyi boyunca göç ederken, diğerleri kistin iç kısmında göç etmiştir.

Göç eden hücrelerin uyguladığı traksiyon kuvvetleri sonucunda meydana gelen matriks deformasyonu, çevreleyen matrikse yerleştirilmiş izleyici partiküllerin yer değiştirmesi yoluyla analiz edilir. RO kinaz inhibisyonunun traksiyon kuvveti üzerindeki etkisi burada gösterilmektedir. İzleyici partikül hareketleri, farklı zaman noktalarının maksimum projeksiyon görüntüsü olarak sergilenmiş ve her zaman noktası yalancı renklendirilmiştir.

Alternatif olarak, tek bir izleyici partikülün görüntüleri, partikülün hareketini göstermek amacıyla bir montaj şeklinde sunulmuştur. Zamanla bu izleyici partikül, sırasıyla Y 2 7 6 3 2 ilavesinden önce ve sonra, göç eden hücrenin arka kenarına doğru yaklaşmış ve ondan uzaklaşmıştır. FRAP analizi, üç boyutlu bir matris içinde göç eden GFP aktin eksprese eden hücreleri takip ederek tipik bir floresans geri kazanımını göstermektedir. Optimize edilmiş lazer ayarlarıyla gerçekleştirilen bir fotobleykleme deneyi sonrası, sağlıklı ve hasarsız hücreler korunurken, ilgi bölgesinin floresans yoğunluğu arka plan seviyesine kıyasla gözle görülür şekilde azalmıştır.

Bu grafik, geri kazanım eğrisinin üstel bir fonksiyonla uyumunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, hücrelerin matrise ekilmesi bir saat sürebilir. Üç amino propil trimetil ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, kimyasal çeker ocak kullanmak gibi önlemler alın. Ayrıca, 3D bir matris içinde hücrelerle çalışırken steril koşulları korumayı unutmayın.