Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Bu prosedürün genel amacı, gerçek zamanlı görüntü dizilerini iki renkte aynı anda kaydetmek için çift kameralı bir emisyon bölme sistemi kullanarak paralel bir plaka akış odası yapışma testi gerçekleştirmektir. Bunu yapmak için, önce görüntüleme kurulumundaki iki kamera hizalanır. Daha sonra, hücreler ve reaktif substrat hazırlanır ve paralel plaka akış odası kurulur.

Kamera ayarları daha sonra iki renkli görüntü elde etmek için kalibre edilir ve kamera hizalamasında gerekli dijital düzeltmeler yapılır. Daha sonra, yüksek zamansal çözünürlüğe sahip çift renkli görüntülerin elde edildiğini gösteren görüntü dizileri yakalanır. Çift kamera emisyon bölme sistemlerinin tek kamera sistemlerine göre avantajı, her kameraya farklı pozlama sürelerinin atanabilmesi ve tam görüş alanının korunmasıdır.

Bu teknik, hücrelerin yüzeyindeki adezyon moleküllerinin lokalizasyonunun hücre göçü, iltihaplanma ve kanser metastazı gibi dinamik biyolojik süreçleri nasıl etkileyebileceği gibi hücre adezyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aşağıdaki prosedür, ters çevrilmiş bir epi floresan mikroskobu gerektirir. Bu, bir ışık kılavuzu, bir kombinasyon filtre küpü ve bir çift kamera emisyon bölme kamera sistemine bağlı yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile donatılmalıdır.

Mikroskop kurulumu, tek renkli CCD kameralar tarafından yakalanan görüntüleri toplayabilen ve birleştirebilen görüntüleme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlanmalıdır. Burada, akış seçimleri beş çoklu kamera yazılımı ile simul seçimler modülü kullanılır. Görev şeridinde beş akış seçimini açarak başlayın, çalışma alanını seçin.

Ardından ekranın en sağındaki çalışma alanı yöneticisini açın ve yeni çalışma alanını seçin. Kamerayı adlandırdıktan sonra, önceden doldurulmuş bir listeden seçim yapmak için yazılım komutlarını izleyin, kamera modeliyle eşleşen bir yakalayıcı, kamera beslemesinin alındığını belirtmek için çalışma alanında küçük bir kamera simgesi görünecektir. Mikroskopla görüntülenen nesneler artık ekranda görüntülenebilir.

Bu işlemi ikinci kamera çalışma alanı için tekrarlayın, ardından birleştirilmiş çalışma alanı için bunu bir kez daha tekrarlayın ve tüm kameralar kullanımdadır. Hata mesajı görünecektir. Bu mesaj, normal olarak birinci ve ikinci çalışma alanından kameraların, görüntüleme ekranının sağ tarafında bulunan yerleştirme panelindeki birleştirilmiş çalışma alanına atanmasıdır.

Birinci ve ikinci çalışma alanındaki görüntüler, birleştirilmiş çalışma alanında iki sahte renkli görüntü olarak üst üste bindirilir. Bu prosedürün en zor yönü kamera hizalamasıdır. Başarıyı sağlamak için, üreticinin talimatlarını titizlikle takip ederken üretici sürgüsünü kullanıyoruz.

Çift kameralı emisyon bölme sistemindeki kameraları hizalamak için mikroskop merceğine parlak alan veya faz kontrast ışığı gönderin. Üretici tarafından sağlanan metalik kaplı kalibrasyon ızgarasını mikroskop tablasına yerleştirin ve ızgarayı mikroskop tablasının karesini alın. Izgarayı gruplama ve otomatik ölçeklendirme olmadan görüntüleyin ve odağa getirin, ardından yer değiştirin, ancak birinci kamerayı hizalamak için dikroik muhafazayı çıkarmayın.

Ardından, birinci deniz dağı bağlantı noktasındaki odak ayar kadranını kullanarak görüntüyü tekrar odaklayın. Ardından, dikroik muhafazayı çift kanallı toplama cihazına tam olarak itin, böylece görüntü dikroik tarafından her iki kameraya da bölünür. 3 5 60 dördüncü inç ayar vidalarını gevşetin ve ikinci kamerayı dişi CM montaj bağlantı noktası ikide ızgaranın yönü aynı olana kadar döndürün, C montaj bağlantı noktası ikideki odak ayar kadranını kullanarak, görüntüyü kamera ikiden odak noktasına getirin.

Hizalamayı sonlandırmak için, sağ kaldırma gelene kadar birleştirilmiş görüntü konumlarını ayarlamak için DC iki'nin sağ tarafındaki RL düğmesini kullanın. Görüntülerin dikey sınırı, birleştirilen çalışma alanında tam olarak hizalanır. Ardından, yatay ızgara çubukları düzgün şekilde hizalanana kadar ikinci görüntünün yukarı, aşağı hizalamasını ayarlamak için UD düğmesini kullanın.

Yukarı aşağı hizalama sırasında hafif bir kamera dönüşü meydana gelirse, ikinci kamera için 3 5 60 dördüncü inç vidaları gevşeterek ve görüntülenen görüntü düzgün şekilde hizalanana kadar döndürerek bu sorunu düzeltin. BET 20 meme kanseri hücrelerini, ekteki belgede açıklandığı gibi LOR 5 68 ve 4 88 sekonderleri kullanarak anti CD 24 ve TECA 4 5 2 ile boyayarak paralel plaka akış odası yapışma testi için hazırlayın, uygun tek renk kontrollerini hazırladığınızdan emin olun. Akış odasının giriş ve çıkış portlarına iki ayrı uzunlukta boru bağlayın.

Bir tüp, DPBS'de askıya alınan etiketli hücreleri içeren rezervuara bağlanacak ve %0.1 PSA içerecektir. Diğer tüpü, sıvıyı belirli bir akış hızında çekecek olan şırınga pompasına bağlayın. Akış odasına bir vakum hattı bağlayın ve akış odasını, lektin veya cho e hücrelerini eksprese eden tek katmanlı Çin hamster yumurtalık hücreleri içeren 35 milimetrelik doku kültürü kabının üzerine yerleştirin.

Yeterli bir vakum sızdırmazlığı sağlamak için akış haznesini ve akış haznesi contasını ayarlayın. Uygun sızdırmazlık için akış odası tertibatını izleyerek rezervuardan sıvıyı çekin. Son olarak, akış odası düzeneğini ışık kaynağındaki mikroskop gücüne ve manuel inceleme ile mikroskop kurulumuna yerleştirin.

Dikroik muhafazanın doğru basınçlı çalışma konumunda olduğundan ve baypas modunda olmadığından emin olun. Manuel olarak floresan moduna geçin ve pozlama süresini ve kazancı ayrı ayrı belirlemek için yeşil kırmızı floresan filtre küpünü seçin. Birinci kamerada kırmızı floresan ve ikinci kamerada yeşil floresan kullanarak hücreleri görüntüleyin.

Görüntüleri elde etmek için dikroiği gerektiği gibi manuel olarak bastırın. Daha sonra, sadece kırmızı flora ile boyanmış BT 20 hücrelerinin bir süspansiyonunu yatırın. Paralel plakalı akış odasının giriş portuna bağlı rezervuardaki dört konjuge antikor.

BT 20 hücrelerini paralel plaka akış odasındaki choi tek tabakası üzerine perfüze etmek için şırınga pompasını kullanın. Görüntüleme yazılımının canlı ayarlarında, kırmızı kanalda bir görüntü elde etmek için birinci kameranın pozlama süresini ayarlayın. İkinci kameranın pozlama süresini birinci kameranın pozlama süresiyle eşleştirin.

Yeşil kanalda bir görüntü gözlemlenirse, artefaktlar arasında kanama mevcuttur. Böyle bir durumda, pozlama süresini birinci ve ikinci kamerada eşdeğer tutun ve maruz kalma süresini, yapaylıktan geçen taşma artık yeşil kanalda görünmeyene kadar azaltın. Gerekirse kırmızı kanaldaki görüntü görünürlüğünü iyileştirmek için birinci kameranın kazancını ayarlayın.

Ardından, rezervuardan kalan BT 20 hücreli süspansiyonu çıkarın ve süspansiyonu DPBS ile değiştirin. BT 20 hücreleri tek tabaka üzerinde artık görünmeyene kadar solüsyonu choi tek tabakası üzerine perfüze etmek için şırınga pompasını kullanın. Rezervuarı, sadece yeşil floro dört konjuge antikor ile boyanmış BT 20 hücrelerinin süspansiyonu ile doldurun.

Yeşil tek renk kontrollerini kullanarak kamera kalibrasyon işlemini tekrarlayın. Bu kez, birinci kamera tarafından toplanan kırmızı kanaldaki artefaktlar arasında sızıntı olmadan yeşil kanaldaki görüntü hücrelerine ikinci kamera ile pozlama süresini tanımlayın. Akış odasındaki iki monokrom CCD kameradan yakalanan görüntüleri aynı anda görüntülemek için görüntüleme yazılımını kullanın. Deney.

Akış seçimlerinin simul pics modülünü kullanarak her iki kameradan toplanan görüntüleri birleştirin. Birleştirilen görüntüleri uzamsal olarak hizalamak için simul pic veya alternatif yazılımda dijital düzeltme ayarlamalarını kullanın. İhtiyaç duyulması halinde yatay, düşey ve rotasyonel ayarlamalar için simul PIC modülü ile görüntüler düzeltilebilir.

Sistem artık aynı anda iki renkli görüntü yakalamak için kullanılmaya hazırdır. Bu videoda açıklanan çift kameralı emisyon bölme sistemini göstermek için paralel bir plaka akış odası yapışma testi kullanıldı. Burada gösterildiği gibi, sistem, kırmızı ile gösterilen anti-insan CD 24 ve yeşil ile gösterilen SCO'larla ilgili moleküllere bağlanan HECA 4 52 ile floresan olarak etiketlenmiş BT 20 hücrelerini tespit etti.

Bazı yuvarlanan hücreler kırmızı sinyaller gösterdi ancak yeşil sinyaller göstermedi. Diğerleri yeşil sinyaller gösterdi, ancak kırmızı sinyaller göstermedi ve yine de diğer hücreler hem kırmızı hem de yeşil sinyaller gösterdi. Burada. Kameralar, reaktif substrat üzerinde akış yönünde yuvarlanırken yuvarlanan ve üst uca yuvarlanan bir hücre üzerindeki hücre özelliklerini izlemek için optik ve zamansal çözünürlüğü korudu, birleştirilmiş emisyon kanalları, CD 24 ve doymuş moleküllerin yüzeyindeki dağılımını ve kolokalizasyonunu ortaya çıkardı

Bu görüntüler, CD 24 ve doymuş moleküllerin birlikte lokalize olduğu ve kırmızı ve yeşil sözde renkli emisyon kanalları birleştirildiğinde sarı ila turuncu lekeler olarak göründüğü tek bir BT 20 hücresinin yakınlaştırmasını göstermektedir. Birlikte ele alındığında. Bu bilgi, çift kameralı emisyon bölme sisteminin, hücrelerin görüş alanı boyunca hızla hareket ettiği akış odası yapışma testleri gibi uygulamalarda hücresel ve moleküler özellikleri ortaya çıkarmak için gereken mekansal, zamansal ve optik çözünürlüğe sahip olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, çift kameralı bir emisyon bölme sisteminin nasıl kurulacağını ve kalibre edileceğini veya bir paralel plaka akış odası yapışma testini gerçek zamanlı olarak iki renkte nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu yöntem, hücre davranışını incelemek için floresan kullanan diğer in vitro tahlillere uygulanabilir.