Name: Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin paralel plaka akış odası yapışma testi için çift kamera emisyon yarma sisteminin kullanımını. Bu yöntem, canlı hücre görüntülemede yüksek zamansal çözünürlüklü çift renkli görüntüleri eşzamanlı olarak yakalar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar anlayışlı tartışmalar ve el yazması inceleme için Dr Douglas Goetz (Bölümü Kimya ve Biyomoleküler Mühendisliği, Ohio Üniversitesi) ve Dr Fabian Benencia (Biyomedikal Bilimler Bölümü, Ohio Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Biz de yardımcı teknik tartışmalar (W. Nuhsbaum A.Ş.) Dr Christopher Huppenbauer teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1.106.118) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R15CA161830-01) hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Yazılım Yükleme <ol><li> StreamPix SimulPix modül veya toplama ve monokrom CCD kameraları tarafından çekilen görüntü birleştirme yeteneğine sahip diğer görüntüleme yazılımı ile 5 Çoklu-Kamera yazılımı satın. </li><li> StreamPix 5 için minimum gereksinimleri şunlardır: 2 GB RAM veya daha yüksek 2.4 GHz veya daha iyi olan Core 2 Duo ile donatılmış bir PC. Desteklenen bir IEEE dijital veya analog kamera ve uyumlu çerçeve kapmak. , Windows XP/7/Vista 32 veya 64 bit. Çözünürlüğü 1.024 x 768 veya daha yüksek destekleyen bir monitör. Iyi 2D performansı ile bir grafik adaptörü (OCU 16x veya daha iyi ifade önerilir) ve RAID-O yapılandırması ile kayıt için 7,200 RPM sabit disk sürücüsü. </li></ol> 2. İki Renk Eşzamanlı Gerçek zamanlı Görüntüleme Yetenekli Çift Kamera Sistemi Kurulumu <ol><li> MICR video portuna DC2 C-mount adaptör kaydırarak mikroskop DC2 Photometrics emisyon ayırıcı veya benzeri çift kamera emisyon bölme aygıtı bağlayıncihazda dikroik konut erişilebilir şekilde Oscope. </li><li> Kadın C-montaj 1 içine iki monokrom CCD kamera yerleştirin ve dişi 2 C-montaj. Özdeş kameralar tercih edilir. Benzer kameralar kullanılabilir, ancak uyumluluk iç donanım, en önemlisi CCD görüntü algılayıcı bağlıdır. </li><li> Her iki kameralardan gelen görüntüleri görüntülemek için görüntüleme yazılımı kullanın. Aşağıdaki adımlar, (2.3.1 - 2.3.4) SimulPix modülü ile StreamPix 5 uygulanır ve diğer çoklu kamera görüntüleme yazılımı için adapte edilmelidir. <ol><li> Açık StreamPix 5 ve görev şerit &quot;çalışma alanı&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Aç &quot;çalışma alanı yöneticisi&quot; Ekranın sağında bulunan ve &quot;yeni bir çalışma alanı&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Bir kamera adlandırma sonra, yazılım önceden doldurulmuş bir listeden bir gaspçı seçmenizi ister izleyin. Kamera modeli eşleşen kapmak seçin ve ikinci kamera çalışma alanı için tekrarlayın. Birleştirilmiş çalışma alanı için, bir kez daha tekrarlayın ancak hata m &quot;tüm kameralar kullanımda&quot;esajı görünecektir. Bu mesaj normaldir. </li><li> Birleştirilmiş çalışma yüklendikten sonra, çalışma alanı ve çalışma alanı 1 2 görüntüleme ekranın sağ tarafında bulunan yerleştirme panelinde birleştirilmiş çalışma alanına kamera atama. </li></ol></li><li> Çift kamera emisyon bölme sisteminde kameralar hizalayın. <ol><li> Parlak bir alan veya bir PlanApo 40X objektif (veya daha büyük) kullanarak üretici tarafından sağlanan kalibrasyon ızgara ile faz kontrast kameralar hizalayın. </li><li> Mikroskop sahnede üretici tarafından sağlanan metalik kaplamalı kalibrasyon ızgara yerleştirin, mikroskop okülerlerinde ışık göndermek, ve mikroskop sahnede ızgara kare. </li><li> Odak haline ızgara getirin. </li><li> Yerinden, ama kamera 1 (bypass kamera) hizalamak için, dikroik konut çıkarmayın. Binning olmadan ve autoscaling olmadan ızgara görüntüler. C-mount port 1 odak ayarlama düğmesini kullanarak görüntüyü odaklanın. </li><li> Çift kanalını içine dikroik konut itinl toplama cihazı tamamen, görüntü iki kamera için dikroik tarafından bölünmüş şekilde. </li><li> Gevşetin üç adet 5/64 &quot;vidalarını ayarlayın ve ızgara yönelim C-montaj port 2 Odak ayar düğmesini kullanarak. Hem görüntü aynıdır kadar kadın C-montaj 2 on ikinci kamerayı döndürmek, kameradan gelen görüntüyü getirmek odak haline 2. </li><li> Görüntüleme yazılımı birleştirilmiş çalışma alanında kombine görüntü kullanılarak hizalama tamamlayın. Bu bir kalibrasyon ızgarasının iki görüntülerin gerçek zamanlı Pseudocolor bindirmeyi görmenizi sağlar. DC2 sağ tarafında, sadece R / L düğmesi kullanılarak birleştirilmiş görüntü konumları ayarlayın. Görüntülerin sol / sağ düşey sınır tam hizaya gelene kadar bu düğmeyi ayarlayın. </li><li> Yatay ızgara çubukları düzgün hizalanmış kadar ikinci resimdeki yukarı / aşağı hizalamasını ayarlamak için U / D düğmesini kullanın. </li><li> Yukarı / aşağı hizalama sırasında hafif bir kamera dönme üç 5/64 &quot;inç scre gevşeterek, doğru bu sorunu ortaya çıkarsaws kamera 2 ve döndürmek için görüntülenen görüntü düzgün hizaya gelene kadar. </li></ol></li></ol> 3. Paralel Plaka Akış odası Yapışma deneyi için Kanser Hücrelerinin Hazırlanması <ol><li> En az temel ortam (MEM) in kültür BT-20 göğüs kanseri hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin, 37 ° C&#39;de ve CO2 gibi, daha önce tarif edildiği 2 ile% 5.0 &#39;orta tamamlamak için desteklenmiştir. </li><li> Hasat kanser seyreltilmiş bir tripsin tedavi ile hücreleri ve bir hemositometreyle hücreleri saymak. </li><li> Yıkama ve kalsiyum ve magnezyum (DPBS +) ile DPBS sığır serumu (BSA)% 0.1 albümin, 10 7 hücre / ml &#39;de hücrelerin süspansiyonu. </li><li> % 0.1 BSA DPBS + içinde önceden belirlenmiş bir optimum konsantrasyona kadar, birincil antikor, arıtılmış fare anti-insan CD24 ve saflaştırılmış sıçan HECA-452 (anti-sialofucosylated antijenler) seyreltin. 30 dakika 9, 10 hücreleri inkübe edin. </li><li> 1,200 rpm&#39;de santrifüj hücreleri, bir hücre tanesinin elde edildi. AspiBirincil antikor oranı ve% 0.1 BSA DBPS + ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> % 0.1 BSA DPBS + içinde önceden belirlenmiş bir optimum konsantrasyona kadar sekonder antikor, keçi anti-fare IgG AlexaFluor 568 (Emisyon max, 603 nm) ve keçi anti-fare IgM AlexaFluor 488 (Emisyon max, 519 nm) seyreltin. 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. </li><li> % 0.1 BSA DPBS + 10 6 hücre / ml &#39;de% 0.1 BSA DPBS + hücreler iki kez yıkayın ve askıya. </li></ol> 4. Paralel Plaka Akış odası Yapışma deneyi için reaktif alt-tabaka hazırlanması <ol><li> Bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde uygun, paralel plaka akış odacığının giriş ve çıkış bağlantı noktaları için bir boru iki ayrı uzunlukları bağlayın. Bir boru belirli bir akış oranında sıvı geri olan şırınga pompası, 0.1% BSA DPBS + ve diğer içinde süspansiyon haline işaretli hücrelerin rezervuar bağlanacaktır. </li><li> Akış odasına 1 bir vakum hattı bağlayın. </li><li> 35 mm doku kültürü di fazla akış odası yerleştirinsh E-selektin (CHO-E) ifade eden Çin hamsteri yumurtalık hücrelerinin bir tek tabaka ihtiva etmektedir. CHO-E hücreleri, 37 ° C&#39;de MEM tam ortam içinde büyütülmüş ve% 5.0 CO2 2. edilmiştir. </li><li> Yeterli bir vakum sızdırmazlık 1 sağlamak için akış odasına ve / veya akış odası conta ayarlayın. </li><li> Uygun mühür ve hava kabarcığı oluşumuna 1 hiçbir görsel kanıt akış odası takımını izleme, rezervuar sıvı çekin. </li><li> Mikroskobu (Leica DMI 6000B) üzerinde akış odası düzeneğini 1. </li></ol> 5. İki renkli Image Acquisition <ol><li> Bir ışık kılavuzu içine yüksek yoğunluklu ışık ve çift bunu oluşturmak için güç bir Leica EL-6000 kompakt ışık kaynağı, ya da benzer bir cihaz. İstediğiniz bir renk / yoğunluğu floroforları heyecanlandırmak için, bir kombinasyon filtre küp, yani G / R (yeşil / kırmızı) filtre küp ile bu ışık geçmek için ters bir mikroskop kullanın. </li><li> Dikroik konut (depresif) doğru çalışma pozisyonunda ve emin olunbypass modunda değil. </li><li> Floresan modunda mikroskobu İşlet ve (kırmızı / yeşil) uygun floresan filtre küpü seçin. </li><li> Kamera 1 pozlama süresini ve kazancını belirlemek (kırmızı; 620 ± 60 nm) ve kamera 2 (yeşil; 535 ± 40 nm). <ol><li> Hem kırmızı ve yeşil emisyon kanallarında görüntüler elde etmek için dikroik basınız. Sadece kırmızı flüorofor etiketli hücreleri ile bir akış odası deneyi kullanın ve görüntüleme yazılımı &quot;canlı ayarlarında&quot; kamera 1 pozlama süresini ayarlayarak kırmızı kanal bir görüntü elde. </li><li> Kameranın 1 pozlama süresi 2 kamerasının pozlama süresini Maç. Bir görüntü yeşil kanal görülürse, akmalarını eserler mevcuttur ve her iki fotoğraf makinesi pozlama süresi azaltılması gerekir. </li><li> Akmalarını eserdir artık yeşil kanalda görünür kadar pozlama süresini azaltmak, kamera 1 ve 2 kamerası eşdeğer pozlama süresini tutmak. Görüntü visibilit geliştirmek için kameranın 1 kazancını ayarlayınGerekirse kırmızı kanalda y. </li><li> Sadece yeşil floroforuyla etiketli hücreleri ile 5.4.3, ama kamera 1 tarafından toplanan kırmızı kanalda akmalarını eserler olmadan yeşil kanalda görüntü hücrelere kamera 2 ile pozlama süresini tanımlamak - Tekrar 5.4.1 adımları. </li><li> Retitrate antikorlar akmalarını eserler 11 elenirse veya kamera 1 ve 2 kamerasının pozlama süreleri önemli ölçüde farklı ise, bu tür görüntüler zamansal hatalı hizalanmış olabilir birleşti ki olamaz. </li></ol></li><li> Eş zamanlı akış odası deneyde iki monokrom CCD kameradan çekilen görüntüleri görüntülemek için görüntüleme yazılımı kullanın. </li><li> StreamPix 5 SimulPix modül veya alternatif bir yazılım paketi kullanarak hem kameralardan alınan görüntüleri birleştirmek. </li><li> Gerekirse mekansal, birleştirilmiş görüntüleri hizalamak SimulPix veya alternatif yazılım dijital düzeltme ayarlamaları kullanın. Görüntüler yatay, dikey SimulPix modülü ile düzeltilebilirVe dönme ayarlamaları. </li></ol>

<ol><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529(2012).</li>
<li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((carcinoma+cell+glycolipids%2C+integrins%2C+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li>
<li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li>
<li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion%3A+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li>
<li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow%3A+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li>
<li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells%3A+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?</a> Front. Oncol. 2, 103(2012).</li>
<li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+GE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li>
<li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li>
<li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li>
<li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%3A+a+custom+technology+platform+for+high-speed%2C+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li>
<li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li>
<li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+%28CXCL4%29+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Çift kamera emisyon bölme sistemi, hücre veya moleküler hareketin hızlı olduğu uygulamalarda yüksek kalitede görüntü yakalamak için gerekli mekansal zamansal ve optik çözünürlüğe sahip. Temsili sonuçlar üreten, yazılım ayarları ve kamera ayarları dahil çift kamera emisyon bölme sistemi, parametreler, haddeleme ve yapışan hücreler mekansal ve zamansal olarak hizalanmış olduğu bir birleştirilmiş görüntü dizisini elde etmek için optimize edilmiştir. Hiza hem yeşil ve kırmızı kanalları rulo görülen, tek bir hücre birleştiri...

Gibi immun boyama gibi hücre yüzeyi üzerinde moleküllerinin analizi için yöntemler, kimyasal olarak hedef moleküllerin saptanmasına olanak tanıyan, florofor konjuge edilir probları kullanır. Canlı hücre görüntüleme ve hidrodinamik akış tabanlı hücre yapışma deneyleri, tipik olarak, hücre ve / veya moleküler seviyede, 1, 2 fizyolojik süreçleri yakalamak için tasarlanmış tek renkli CCD kamera ile kaydedilir. Bu kameralar hızlı çerçeve oranları (saniyede 30&#39;dan fazla kare) teslim ve (nedeniyle hızlı çerçeve oranları ve kısa pozlama süreleri için) istisnai zamansal çözünürlük sağlayan, son derece duyarlıdır. Ancak, tek renkli kameralar, sadece görüntü toplamak için (bir tek flüorofor tespit) tek bir emisyon kanalı yakalayabilir. Tek kamera emisyon bölme sistemleri birden fazla emisyon kanalları yakalamak için kurulmuştur ama genellikle görüş alanını azaltmak ve tüm kanalları görüntüleme için aynı pozlama süresini gerektirirler. Multip ile etiketlenmiş hücrelerin tam renk spektrumu yakalamak içinle renkli bir kamera, bir alternatif olarak kullanılabilir, flüoroforlar. Bununla birlikte, renk Kameralar bazı uygulamalarda canlı hücre görüntüleme için arzu zamansal çözünürlüğü sağlama genellikle yeteneğine sahip değildir. Başka bir görüntüleme düzeni yüksek bir zamansal çözünürlüğü korurken, birden fazla dalga boyunda görüntü canlı hücre avantajlı olduğu uygulamalar için gereklidir. Bir ilk uygulama deneysel hücreleri, potansiyel olarak reaktif alt-tabaka 1, 3 den fazla fizyolojik olarak uygun koşullarda perfüze edildiği paralel plaka akış odası yapışma deneyi, bir. Spesifik hücre yüzey molekülleri ifade akışta hücreler uygun ve bu yapışma molekülleri ya da yüzey-adsorbe hücre dışı matris proteinleri 4, 5 eksprese eden bir hücre tek tabaka olarak alt-tabaka üzerinde rulo olabilir. Rolling hücreler saliseler içinde dönme ve öteleme hareketini tabi olabilir. Haddeleme ve bu hücre yüzeyi moleküllerinin kümeleri olarak yapışık hücreler, Moleküler özellikler, aynı zamanda var potentidiğerleri, hücre yüzeyinde aktif bir yeniden geçmesi. Böylece, görüntüleme sistemleri istisnai bir zamansal çözünürlük sağlamak zorundadır (ikinci veya daha yüksek başına 30 kare ve pozlama süreleri &quot;sıfıra yakın&quot;) hücre 6, 7 haddeleme adım adım ilerlemesini gösteren bir görüntü dizisi oluşturmak için. Çift kamera emisyon bölme sistemleri birden fluorophores etiketli görüntüleme hücreleri için bu talepleri karşılama yeteneğine sahiptirler. Çift kamera emisyon bölme sistemleri, görüş tam saha korurken aynı anda iki mekansal özdeş ama flüoroforla özel görüntüleri yakalamak için iki benzer kameralar içine filtre floresan kanal bölünmüş ve. Bu teknoloji her kanalda gerçek zamanlı olarak çekilen görüntünün doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan ve kullanıcı hızlı bir şekilde farklı görüntüleme yetenekleri ile kamera modelleri arasında geçiş yapmanızı sağlar. Bu özellik, daha iyi sistem yakalamak için izin bir kamera görüntü yakalama ayarları için ayarlamalar yapmak için yararlıdırFarklı yoğunluklarda, yaşamlar, ve sönme katsayıları 8 flüoroforlar. Görüntüleme yazılımı ile birleştiğinde, çift kamera emisyon bölme sistemleri, çoklu dalga boyları canlı hücre görüntüleme testlerinin gerçek-zamanlı kayıt izin ve hücre davranışlarını incelemek için floresan kullanmak in vitro deneyleri artırabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>BT-20 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E hücreleri</td><td>Dr. R. Sackstein'dan Hediye (Brigham ve Kadınlar' s Hastanesi, Harvard Tıp Okulu)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin / %0.1 EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Termo Bilimsel</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 monoklonal antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD24 monoklonal antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Anti-sıçan IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgG AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">equipment</td></tr><tr><td>EXi Mavi Floresan Mikroskobu Dijital CCD Kamera</td><td>Q Görüntüleme</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Dijital CCD Kamera</td><td>Q Görüntüleme</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Emisyon Bölücü</td><td>Fotometri</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Streampix 5 yazılımı</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eşzamanlı dual kamera emisyon yarma sisteminin kullanılması İki emisyon kanallarda gerçek zamanlı yakalama görüntüleri: uygulamalar yapışma hücre

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Hücre zarında özel molekülleri tespit etmek için çok renkli, immünofloresan mikroskopi, dinamik akış koşulları altında hücre yapışması ilişkin mekanizmalar incelemektir paralel plaka akış odası deneyleri ile akuple edilebilir. Örneğin, birden fazla florofor ile işaretlenmiş kanser hücrelerinin, kanser metastazının mekanizmaları modellemek için bir potansiyel olarak reaktif alt-tabaka üzerinde perfüze edilebilir. Ancak, gerçek zamanlı canlı hücre analizi için görüntü edinimi çok kanallı tek kamera sistemleri ve renkli kameralar sergi eksiklikleri. Bu sınırlamaları aşmak için, biz aynı anda akış odasına floresan işaretli hücrelerin gerçek zamanlı görüntü dizileri yakalamak için bir çift kamera emisyon bölme sistemi kullanılır. Çift kamera emisyon bölme sistemleri filtre tanımlı dalgaboyu böylece aynı anda iki mekansal özdeş ama flüoroforla özel görüntüleri yakalayan iki monokrom CCD kamera, içine değişmektedir. Daha sonra, psuedocolored tek kanallı görüntüler tek bir birleştirilirGerçek-zamanlı hücreler ilgi bölgede hızla hareket eden birden fazla hedef moleküllerin ortaya çıkarabilir dizisi birleşti.

Bir paralel plaka akış odası yapışma deneyi aynı anda iki emisyon kanallarda gerçek zamanlı görüntü dizileri yakalanan bir çift kamera emisyon bölme sistemi (Şekil 1) göstermek için kullanılmıştır. Çift kamera emisyon bölme sistemi flüoresan anti-insan CD24 ve HECA-452 (sialofucosylated antijenleri tespit) monoklonal antikorlar ve uygun ikincil antikorlar (Şekil 2) ile etiketlenmiş BT-20 hücreleri tespit edildi. Bazı haddeleme hücreler kırmızı sinyaller (CD24) henüz belirlenemeyen yeşil...

Iki renkli floresan mikroskop için çift kamera emisyon bölme sistemleri olağanüstü optik ve zamansal çözünürlük, paralel plaka akış odası yapışma deneyleri dahil olmak üzere bazı canlı hücre deneyleri bir şartı ile gerçek-zamanlı görüntü dizileri oluşturmak. Yazılım aynı anda kazanılmış emisyon kanalları görüntüleri birleştirmek için kullanıldığı zaman, yalancı görüntü dizileri üretilir.

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Bu prosedürün genel amacı, iki renkte gerçek zamanlı görüntü dizilerini eş zamanlı olarak kaydetmek için çift kameralı emisyon ayırma sistemi kullanarak bir paralel plaka akış odası adezyon testi gerçekleştirmektir. Bunu yapmak için, öncelikle görüntüleme düzeneğindeki iki kamera hizalanır. Ardından, hücreler ve reaktif substrat hazırlanır ve paralel plaka akış odası kurulur.Ardından, iki renkli görüntü elde etmek için kamera ayarları kalibre edilir ve kamera hizalamasında gereken tüm dijital düzeltmeler yapılır. Daha sonra, yüksek zamansal çözünürlükle çift renkli görüntülerin elde edildiğini gösteren görüntü dizileri kaydedilir. Çift kameralı emisyon ayırma sistemlerinin tek kameralı sistemlere göre avantajı, her kameraya farklı pozlama süreleri atanabilmesi ve görüş alanının tamamının korunmasıdır.Bu teknik, hücre yüzeyindeki adhezyon moleküllerinin lokalizasyonunun; hücre migrasyonu, inflamasyon ve kanser metastazı gibi dinamik biyolojik süreçleri nasıl etkileyebileceği gibi hücre adhezyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aşağıdaki prosedür için ters epi floresan mikroskobu gereklidir. Bu mikroskop; bir ışık kılavuzuna bağlı yüksek yoğunluklu bir ış

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Kaynak: Bello-Gamboa, A. et al., İnsan İmmünolojik Sinapsını Görüntüleme.J. Vis. Uzm.(2019) Bu video, bir floresan mikroskobu kullanılarak antijen sunan bir hücre ile yardımcı T lenfositleri arasındaki immünolojik sinaps oluşumunun in vitro çalışmasını göstermektedir. Yardımcı T lenfositlerinin T hücresi reseptörleri, antijen sunan hücrelerde bir antijen-MHC-II kompleksi ile etkileşime girer ve immünolojik sinapslar oluşturur, ardından floresan mikroskobu ile görüntülenen sinapsa doğru salgı...

Yardımcı T Hücreleri ile Antijen Sunan Hücreler Arasında İmmünolojik Sinaps Oluşumu

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca2+ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana...

Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&amp;B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Bu protokol, aktif olarak kasıtlı bir kardiyak trabecula ex vivo'dansarkom, kalsiyum ve makroskopik geometrik verilerin bir koleksiyonunu sunar. Bu eşzamanlı ölçümler üç görüntüleme yönteminin entegrasyonu ile mümkün olmaktadır.

Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

Öğrenin paralel plaka akış odası yapışma testi için çift kamera emisyon yarma sisteminin kullanımını. Bu yöntem, canlı hücre görüntülemede yüksek zamansal çözünürlüklü çift renkli görüntüleri eşzamanlı olarak yakalar.

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre (Video) | JoVE Journal

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Daha fazla video keşfet