Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Bu prosedürün genel amacı, iki renkte gerçek zamanlı görüntü dizilerini eş zamanlı olarak kaydetmek için çift kameralı emisyon ayırma sistemi kullanarak bir paralel plaka akış odası adezyon testi gerçekleştirmektir. Bunu yapmak için, öncelikle görüntüleme düzeneğindeki iki kamera hizalanır. Ardından, hücreler ve reaktif substrat hazırlanır ve paralel plaka akış odası kurulur.

Ardından, iki renkli görüntü elde etmek için kamera ayarları kalibre edilir ve kamera hizalamasında gereken tüm dijital düzeltmeler yapılır. Daha sonra, yüksek zamansal çözünürlükle çift renkli görüntülerin elde edildiğini gösteren görüntü dizileri kaydedilir. Çift kameralı emisyon ayırma sistemlerinin tek kameralı sistemlere göre avantajı, her kameraya farklı pozlama süreleri atanabilmesi ve görüş alanının tamamının korunmasıdır.

Bu teknik, hücre yüzeyindeki adhezyon moleküllerinin lokalizasyonunun; hücre migrasyonu, inflamasyon ve kanser metastazı gibi dinamik biyolojik süreçleri nasıl etkileyebileceği gibi hücre adhezyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aşağıdaki prosedür için ters epi floresan mikroskobu gereklidir. Bu mikroskop; bir ışık kılavuzuna bağlı yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı, kombinasyon filtre küpü ve çift kameralı emisyon ayırma kamera sistemi ile donatılmış olmalıdır.

Mikroskop düzeneği, monokrom CCD kameralar tarafından yakalanan görüntüleri toplayabilen ve birleştirebilen görüntüleme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlanmalıdır. Burada, simul picks modülü ile birlikte stream picks five multi-camera yazılımı kullanılmıştır. Görev şeridinden stream picks five uygulamasını açarak başlayın ve çalışma alanını seçin.

Ardından ekranın en sağında, çalışma alanı yöneticisini açın ve yeni çalışma alanı seçeneğini belirleyin. Kameraya isim verdikten sonra, yazılım istemlerini takip ederek önceden doldurulmuş bir listeden kamera modeline uygun bir yakalayıcı seçin; kamera akışının alındığını belirtmek için çalışma alanında küçük bir kamera simgesi görünecektir. Mikroskopla görüntülenen nesneler artık ekranda izlenebilir.

Bu işlemi ikinci kamera çalışma alanı için tekrarlayın, ardından birleştirilmiş çalışma alanı için bir kez daha tekrarlayın; böylece tüm kameralar kullanıma hazır hale gelir. Bir hata mesajı görünecektir. Bu mesaj normaldir; görüntüleme ekranının sağ tarafında bulunan kenetlenme panelinden, birinci ve ikinci çalışma alanındaki atanmış kameraları birleştirilmiş çalışma alanına aktarın.

Birinci ve ikinci çalışma alanındaki görüntüler, birleştirilmiş çalışma alanında iki psödo renkli görüntü olarak üst üste bindirilecektir. Bu prosedürün en zor kısmı kamera hizalamasıdır. Başarıyı sağlamak için, üreticinin talimatlarını titizlikle takip ederek üretici lamını kullanıyoruz.

Çift kameralı emisyon ayırma sistemindeki kameraları hizalamak için, mikroskop okülerine parlak alan veya faz kontrast ışığı gönderin. Üretici tarafından sağlanan metal kaplı kalibrasyon ızgarasını mikroskop tablasına yerleştirin ve ızgarayı mikroskop tablası üzerinde hizalayın. Izgarayı binning yapmadan ve otomatik ölçeklendirme kullanmadan görüntüleyin, netleyin ve ardından birinci kamerayı hizalamak için dikroik yuvayı yerinden oynatın ancak çıkarmayın.

Ardından, seamount port bir üzerindeki odak ayar kadranını kullanarak görüntüyü tekrar odaklayın. Sonra, görüntünün dikroik tarafından her iki kameraya bölünmesi için dikroik yuvasını çift kanallı görüntüleme cihazının içine tamamen itin. 3/60 inçlik set vidalarını gevşetin ve C mount port iki üzerindeki ikinci kamerayı, ızgara yönü her iki görüntüde de aynı olana kadar döndürün; C mount port iki üzerindeki odak ayar kadranını kullanarak ikinci kameradan gelen görüntüyü odaklayın.

Hizalamayı tamamlamak için, görüntülerin sağ dikey sınırı birleştirilmiş çalışma alanında tam olarak hizalanana kadar birleşik görüntü konumlarını ayarlamak amacıyla DC two'nun sağ tarafındaki RL düğmesini kullanın. Ardından, yatay ızgara çubukları düzgün bir şekilde hizalanana kadar ikinci görüntünün yukarı-aşağı hizalamasını ayarlamak için UD düğmesini kullanın.

Yukarı-aşağı hizalama sırasında hafif bir kamera rotasyonu meydana gelirse, kamera iki için 3 5 60 dörtten bir inçlik vidaları gevşeterek ve görüntülenen imaj düzgün şekilde hizalanana kadar döndürerek bu sorunu düzeltin. BET 20 meme kanseri hücrelerini, beraberindeki belgede açıklandığı üzere LOR 5 68 ve 4 88 sekonderleri kullanarak anti CD 24 ve TECA 4 5 2 ile boyayarak paralel plaka akış odası adezyon analizi için hazırlayın; boyama sonrası uygun tek renk kontrollerini hazırladığınızdan emin olun, ardından hücreleri paralel plaka akış odasının rezervuarına aktarın. Akış odasının giriş ve çıkış portlarına iki ayrı boru parçası bağlayın.

Tüplerden biri, DPBS ve %0,1 PSA içeren, işaretli hücrelerin süspansiyon halinde bulunduğu rezervuara bağlanacaktır. Diğer tüp ise sıvıyı belirlenen bir akış hızında çekecek olan şırınga pompasına bağlanır. Akış hücresine bir vakum hattı bağlayın ve akış hücresini, lektin eksprese eden Çin hamster yumurtalığı hücreleri veya CHO hücrelerinin monokatmanını içeren 35 milimetrelik doku kültürü kabının üzerine yerleştirin.

Yeterli bir vakum sızdırmazlığı sağlamak için akış hücresini ve akış hücresi contasını ayarlayın. Akış hücresi düzeneğinin sızdırmazlığını izleyerek rezervuardan sıvı çekin. Son olarak, akış hücresi düzeneğini mikroskoba yerleştirin, ışık kaynağını açın ve mikroskop kurulumunu manuel kontrolle doğrulayın.

Dikroik yuvanın doğru basılı çalışma konumunda olduğundan ve bypass modunda olmadığından emin olun. Pozlama süresini ve kazancı ayrı ayrı belirlemek için manuel olarak floresan moduna geçin ve yeşil-kırmızı floresan filtre küpünü seçin. Birinci kamerada kırmızı floresan, ikinci kamerada ise yeşil floresan kullanarak hücrelerin görüntülemesini yapın.

Görüntüleri elde etmek için dikroik filtre gerektiğinde manuel olarak aşağı bastırıldı. Ardından, sadece kırmızı flora ile boyanmış BT 20 hücreleri süspansiyonu, paralel plaka akış odasının giriş portuna bağlı olan rezervuara, dört konjuge antikor ile birlikte ekleyin.

Paralel plaka akış odasındaki choi tek tabakasının üzerine BT 20 hücrelerini perfüze etmek için şırınga pompasını kullanın. Görüntüleme yazılımının canlı ayarlarında, kırmızı kanalda bir görüntü elde etmek için birinci kameranın pozlama süresini ayarlayın. İkinci kameranın pozlama süresini, birinci kameranın pozlama süresiyle eşitleyin.

Yeşil kanalda bir görüntü gözlemleniyorsa, sızıntı (bleed through) artefaktları mevcuttur. Bu durum gerçekleştiğinde, birinci kamera ve ikinci kameradaki pozlama sürelerini eşdeğer tutun ve sızıntı artefaktı yeşil kanalda görünmez olana kadar pozlama süresini azaltın. Gerekirse, kırmızı kanaldaki görüntü görünürlüğünü artırmak için birinci kameranın kazancını (gain) ayarlayın.

Ardından, rezervuardaki kalan tüm BT 20 hücre süspansiyonunu uzaklaştırın ve süspansiyonu DPBS ile değiştirin. BT 20 hücreleri monolayer üzerinde artık görülmeyene kadar çözeltiyi monolayer üzerinden perfüze etmek için şırınga pompasını kullanın. Rezervuarı, yalnızca yeşil fluoro four konjuge antikor ile boyanmış BT 20 hücre süspansiyonu ile yeniden doldurun.

Yeşil tek renk kontrollerini kullanarak kamera kalibrasyon işlemini tekrarlayın. Bu kez, kamera bir tarafından toplanan kırmızı kanalda sızıntı (bleed-through) artefaktları oluşmadan, hücreleri yeşil kanalda görüntülemek için kamera iki ile pozlama süresini belirleyin. Akış hücresindeki iki monokrom CCD kameradan yakalanan görüntüleri eş zamanlı olarak görüntülemek için görüntüleme yazılımını kullanın. Deney.

Stream pics yazılımının simul pics modülünü kullanarak her iki kameradan toplanan görüntüleri birleştirin. Birleştirilen görüntüleri mekansal olarak hizalamak için simul pic veya alternatif bir yazılımdaki dijital düzeltme ayarlamalarını kullanın. Gerekirse görüntüler, yatay, dikey ve dönsel ayarlamalar için simul PIC modülü ile düzeltilebilir.

Sistem artık iki renkli görüntüyü eş zamanlı olarak yakalamak için kullanılmaya hazırdır. Bu videoda açıklanan çift kameralı emisyon ayırma sistemini göstermek için paralel plaka akış odası adezyon testi kullanılmıştır. Burada gösterildiği gibi sistem, kırmızıyla gösterilen anti-human CD 24 ile floresan olarak işaretlenmiş BT 20 hücrelerini ve yeşille gösterilen SCO ile ilişkili moleküllere bağlanan HECA 4 52'yi tespit etmiştir.

Yuvarlanan bazı hücreler kırmızı sinyaller verdi ancak yeşil sinyaller vermedi. Diğerleri yeşil sinyaller verdi ancak kırmızı sinyaller vermedi ve bazı diğer hücreler ise hem kırmızı hem de yeşil sinyaller verdi. Kameralar, reaktif alt tabaka üzerinde akış yönünde yuvarlanan ve takla atan hücrelerin özelliklerini izlemek için gerekli optik ve zamansal çözünürlüğü korudu; birleştirilmiş emisyon kanalları, CHO e monokatmanlarına yuvarlanan ve yapışan BT 20 hücrelerinin yüzeyindeki CD 24 ve sated moleküllerinin dağılımını ve kolokalizasyonunu ortaya çıkardı.

Bu görüntüler, CD 24 ve sated moleküllerinin birlikte yerleştiği ve kırmızı ile yeşil yalancı renkli emisyon kanalları birleştirildiğinde sarıdan turuncuya doğru lekeler şeklinde göründüğü tek bir BT 20 hücresinin yakınlaştırmasını göstermektedir. Bir bütün olarak bu bilgiler, çift kameralı emisyon ayırma sisteminin, hücrelerin görüş alanı boyunca hızla hareket ettiği akış odası adezyon deneyleri gibi uygulamalarda hücresel ve moleküler özellikleri ortaya çıkarmak için gereken uzamsal, zamansal ve optik çözünürlüğe sahip olduğunu kanıtlamaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, çift kameralı emisyon ayırma sisteminin nasıl kurulacağı ve kalibre edileceği veya paralel plaka akış odası adezyon analizinin iki renkte gerçek zamanlı olarak nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, hücre davranışlarını incelemek için floresan kullanan diğer in vitro analizlere de uygulanabilir.