Name: Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Öğrenin, FPALM ile hücrelerdeki çoklu protein türlerini nanometre hassasiyetinde eş zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sabit ve canlı hücrelerde binlerce floresan proteinin lokalizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bilgisayar programlama, teknik yardım ve faydalı konuşmalar için Philip Andresen, Matthew Parent ve Sean Carter'a ve idari yardım için Pat Byard'a teşekkür eder. Bu çalışma NIH Kariyer Ödülü K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Teknoloji Enstitüsü MTAF 1106 ve 2061 ve Maine Ekonomik İyileştirme Fonu tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

STH ve MJM, süper çözünürlüklü mikroskopide patentlere sahiptir. S.T.H. Vutara, Inc.'in bilimsel danışma kurulunda görev yapmaktadır.

Lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü görüntüleme, biyolojik görüntüleme için birçok güçlü yetenek sağlar. Masaya yerleştirilen bireysel optik bileşenlerden, biyolojik bir numunedeki birden fazla floresan türünü aynı anda görüntüleyebilen işlevsel bir süper çözünürlüklü mikroskoba giden yol, bir dizi zorluğu beraberinde getirir. Hizalamanın bazı yönleri diğerlerinden daha kritiktir; Aşağıda, rotanın en zor yönleriyle uğraşan potansiyel kullanıcılara rehberlik sağlamaya çalışıyoruz.
Kritik Adıml...

Hücresel yapılar çok çeşitli uzamsal ölçeklerde bulunurken, ~250 nm'den daha küçük uzunluk ölçeklerinde hücresel organizasyonun floresan görüntülemesi, kırınım sınırının fiziksel kısıtlaması nedeniyle geleneksel mikroskopide sınırlıdır. Bu sınır, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM1) ve birkaç on nanometre çözünürlüğe sahip görüntüler oluşturmak için çok sayıda bireysel molekülü ~ 10 nm hassasiyetle lokalize edebilen benzer tekniklerin2,3 ortaya çıkmasıyla aşıldı. FPALM, moleküllerin alt kümelerini aktive etmek ve etkisiz hale getirmek için optik kontrolün kullanılmasına dayanır (FPALM'nin tam bir açıklaması ve bu görüntüleme sisteminin nasıl uygulanacağına ilişkin talimatlar için, bakınız Gould et al.4). Bu teknik, tek moleküllerin tüm popülasyonlarının mekansal dağılımlarının haritalanmasına izin verir, böylece onlarca nanometreden onlarca mikrona kadar uzanan uzunluk ölçeklerinde biyolojik yapıları aydınlatır. Lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi (bundan böyle lokalizasyon mikroskobu olarak anılacaktır), örneğin polarizasyon FPALM veya P-FPALM5 ile bireysel moleküler yönelimlerin görüntülenmesine, Biplane FPALM6 veya diğer teknikler7-9 ile üç boyutlu tek moleküllerin floresan görüntülemesine izin veren teknolojik gelişmelerle birlikte bir dizi biyolojik soruyu ele almak için uyarlanmıştırve canlı hücrelerde tek moleküllerin süper çözünürlüklü floresan görüntülemesi10-12. Lokalizasyon mikroskobu, sabit hücrelerde birden fazla türüngörüntülenmesine de uygulanmıştır 13-16. Son zamanlarda, hem sabit hem de canlı hücrelerde FPALM ile aynı anda üç protein türü görüntülenmiştir17. Lokalizasyon mikroskobu, çeşitli şekillerde etiketlenmiş örnekleri görüntüleyebilir: örnekler arasında PAFP veya PSFP füzyon etiketleri ile eksprese edilen proteinler, kafesli organik boyalarla etiketlenmiş antikorlar veya moleküller veya geleneksel organik boyalar bulunur. Konvansiyonel floresan boyaların kullanımı, bir füzyon-protein etiketinin yokluğunda proteinlerin etiketlenmesine izin verirken, süper çözünürlüklü görüntülemede kafessiz organik boyaların kullanımı için genellikle gerekli olan koşullar, numunelerin indirgeyici tamponlara daldırılmasını gerektirir2. Ek olarak, antikor-boya konjugatlarının hücre içi iletimi tipik olarak hücrelerin sabitlenmesini ve zarlarının geçirgen hale getirilmesini gerektirir, veya canlı hücrelerin elektroporasyon veya başka yollarla geçirgen hale getirilmesini gerektirir. Tampon koşullarının azaltılması ve membran geçirgenliği için gereklilikler, organik boyaların canlı hücre görüntüleme için uygunluğunu sınırlar, ancak son gelişmeler HaloTags ve FPALM'ın membran yapılarını görüntülemek için etkili bir şekilde kullanılmasına izin vermiştir18.
FPALM, canlı hücrelere uygulanan ilk lokalizasyon mikroskobu tekniğiydi10. Canlı hücrelerde, etiketli moleküllerin konumlarının zamana bağlı bir uzamsal haritasını sağlamanın yanı sıra, FPALM, tek molekülleri birden fazla çerçeve üzerinde ve milisaniye19 zaman ölçeklerinde belirlenen moleküler yörüngeleri izleyebilir. Böylece, FPALM oldukça kısa zaman ölçeklerine ve nano ölçekli çözünürlüğe erişim sağlar.
Çok renkli FPALM, fotoaktif proteinler ve organik kafesli veya kafessiz boyalar dahil olmak üzere çeşitli farklı problar için kullanılabilir. Burada, iki floresan protein türü olan Dendra2 ve PAmCherry'nin aynı anda görüntülenmesi için protokol ve kurulum hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz. NIH-3T3 fibroblastlarında beta aktin (PAmCherry-actin) ile konjuge PAmCherry ve influenza hemaglutinin (Dendra2-HA) ile konjuge Dendra2 görüntüleme sonuçlarını sunuyoruz. Kurulumda açıklanan bileşenler, diğer probların görüntülenmesi için daha uygun olan diğer donanımlarla değiştirilebilir. Bu durum söz konusu olduğunda, metinde açık olmaya çalıştık.
Çok renkli FPALM, canlı veya sabit hücrelerdeki çoklu protein türlerinin uzamsal dağılımlarını raporlamak için idealdir. Bu teknik, özellikle nanometre uzunluktaki uzamsal ölçeklerde uzamsal ve/veya dinamik ilişkileri araştırmak için uygundur, ancak görüntüler onlarca nanometreden onlarca mikrona kadar çeşitli uzunluk ölçeklerinde yerelleştirmeyi rapor edecektir. Çok renkli FPALM'ın en büyük avantajlarından biri, kurulumun nispeten ucuz olması ve çeşitli prob kombinasyonlarıyla kullanım için çok esnek olmasıdır. Sistemin bileşenlerden oluşturulması ve kalibre edilmesi süreci, verilerin kalitesini ve yorumlanabilirliğini ve dolayısıyla araştırma sonucunu tehlikeye atabilecek faktörlerin önemli ölçüde anlaşılmasını sağlar. Burada, FPALM kullanarak PSFP ve PAFP füzyon yapıları ile birden fazla protein türünün optik kurulumu, numune hazırlama ve veri toplama yöntemlerini detaylandırıyoruz. Bu protokol sabit hücrelerin analizini tanımlarken, bu prosedürler canlı hücrelerin görüntülenmesine kolayca uygulanabilir.
Burada açıklanan optik kurulum, PSFP Dendra2 ve PAFP PAmCherry'nin eş zamanlı görüntülenmesi için idealdir. Çok renkli görüntüleme için başka birçok prob kullanılabilir; Bununla birlikte, gerekli olan kesin bileşenler, seçilen probların uyarma ve emisyon spektrumlarına bağlı olarak değişebilir. Dikroik aynalar, filtreler ve lazer dalga boyları seçimleri bu hususlara göre yapılmalıdır.

<table><tbody><tr><td>LabTek II odaları</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Floresan boncuklar</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Kalibrasyon için boncuklar</td></tr><tr><td>Tetraspeck boncuklar</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Kalibrasyon için dört renkli boncuklar</td></tr><tr><td>Objektif daldırma yağı</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Yüksek NA hedefi için daldırma yağı (objektif seçimine bağlı olarak)</td></tr> <tr><td>HPLC su</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Medya</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Veya Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>serum</td><td>Termo Bilimsel</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofektamin</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>DİKKAT: Toksik</td></tr></tbody></table>

floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu ile biyolojik yapıların eş zamanlı Çok renkli görüntülenmesi

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Yerelleştirme tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi, onlarca nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip bir numune içindeki tek tek floresan etiketli tek moleküllerin dağılımının uzamsal bir haritasını (görüntüsünü) elde etmek için uygulanabilir. İlgilenilen proteinlere kaynaşmış fotoaktif (PAFP) veya foto değiştirilebilir (PSFP) floresan proteinleri veya antikorlara veya diğer ilgili moleküllere konjuge organik boyaları kullanarak, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (FPALM), tek hücreler içinde aynı anda birden fazla molekül türünü görüntüleyebilir. Aşağıdaki yaklaşımı kullanarak, çok sayıda (binlerce ila yüz binlerce) bireysel molekül popülasyonları tek hücrelerde görüntülenir ve ~ 10-30 nm hassasiyetle lokalize edilir. Elde edilen veriler, bir hücre içindeki çoklu protein türlerinin nano ölçekli uzamsal dağılımlarını anlamak için uygulanabilir. Bu tekniğin birincil avantajlarından biri, uzamsal çözünürlükteki dramatik artıştır: kırınım, geleneksel ışık mikroskobunda çözünürlüğü ~ 200-250 nm ile sınırlarken, FPALM, uzunluk ölçeklerini daha küçük bir büyüklük sırasından daha fazla görüntüleyebilir. Birçok biyolojik hipotez, farklı biyomoleküller arasındaki mekansal ilişkilerle ilgili olduğundan, FPALM'ın geliştirilmiş çözünürlüğü, daha önce geleneksel floresan mikroskobu tarafından erişilemeyen hücresel organizasyon sorularına ışık tutabilir. Numune hazırlama ve veri toplama yöntemlerini detaylandırmanın yanı sıra, burada FPALM için optik kurulumu açıklıyoruz. Süper çözünürlüklü mikroskopi yapmak isteyen araştırmacılar için ek bir husus da maliyettir: şirket içi kurulumlar, ticari olarak mevcut görüntüleme makinelerinin çoğundan önemli ölçüde daha ucuzdur. Bu tekniğin sınırlamaları arasında, hücre numuneleri içindeki ilgili moleküllerin etiketlenmesinin optimize edilmesi ihtiyacı ve sonuçları görselleştirmek için son işlem yazılımına duyulan ihtiyaç yer alır. Burada, sabit hücrelerde iki protein türünü görüntülemek için PAFP ve PSFP ekspresyonunun kullanımını açıklıyoruz. Tekniğin canlı hücrelere genişletilmesi de açıklanmaktadır.

İnfluenza hemaglütinin (HA), on nanometreden mikrometrelere kadar boyutlarda kümeler oluşturur ve bu kümeler aktin ile değişken oranlarda kolokalize olur (Şekil 5). Bu uzamsal dağılımlar, bu iki proteine yönelik daha kaba ölçekli görüntülemeleri28 ve HA uzamsal dağılımlarının aktine olan bağımlılığını19 doğrulamaktadır. Çok renkli FPALM görüntüleri ayrıca bu kümelerin yoğunluğunu, alanını ve çevresini, ayrıca nano ve mikro ölçekte iki tür arasındaki kolokalizasyon derecesini tanımla...

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Bu prosedürün genel amacı, fikse edilmiş veya canlı hücrelerde birden fazla protein türünü nanometre hassasiyetinde eş zamanlı olarak görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle mikroskoptan gelen odaklanmış bir görüntünün kamera çipi üzerine yansıtılmasına kadar kamera ve optiklerin konumunun ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, lazer ışınlarının mikroskop tablasındaki bir örnekle doğrudan hizalanacak şekilde düzenlenmesidir.Ardından, hazırlanan hücre örneği aydınlatılır ve istenen proteinleri eksprese eden bir hücre seçilir. Son adım, örneğin lazerlerle aydınlatılması ve ardından hücre floresansının bir veri seti elde etmek için kamera çipine yönlendirilmesi yoluyla floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobisi ile hücrenin görüntülenmesidir. Nihayetinde, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobisi, sabitlenmiş veya canlı hücrelerde, geniş alanla veya örneğin ince bir bölgesini izole etmek için toplam internal yansıma floresansı kullanıldığında, birden fazla protein türünün nanometre uzamsal ölçekteki lokalizasyonunu göstermek için kullanılır.Bu tekniğin konfokal veya elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sabitlenmiş veya canlı hücrelerde

simultaneous-multicolor-imaging-biological-structures-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bimoleküler Floresan Tamamlama-Birleştirilmiş Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskobu

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Iki renkli floresan mikroskop için çift kamera emisyon bölme sistemleri olağanüstü optik ve zamansal çözünürlük, paralel plaka akış odası yapışma deneyleri dahil olmak üzere bazı canlı hücre deneyleri bir şartı ile gerçek-zamanlı görüntü dizileri oluşturmak. Yazılım aynı anda kazanılmış emisyon kanalları görüntüleri birleştirmek için kullanıldığı zaman, yalancı görüntü dizileri üretilir.

Eşzamanlı Dual Kamera Emisyon Yarma Sisteminin Kullanılması İki Emisyon Kanallarda Gerçek zamanlı yakalama Görüntüleri: Uygulamalar Yapışma Hücre

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Floro etiketli antikorların ardışık bağlanması ve elüsyonunu kullanarak heterojen nano yapılardaki çoklu molekülleri tek molekül doğruluğu ile görüntüleme yöntemi gösteriyoruz.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu protokol, lazer ışık kaynağının nasıl oluşturulacağı, bir doku örneğinin nasıl hazırlanacağı, görüntüleme yapılacağı ve verilerin nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılar da dahil olmak üzere Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobik teknik için adım adım bir kılavuz sunar. SLAM, doku mikro ortamını araştırmak için dört tamamlayıcı etiketsiz kontrastı ölçerek doğrusal olmayan mikroskobu geliştirir.

Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

Öğrenin, FPALM ile hücrelerdeki çoklu protein türlerini nanometre hassasiyetinde eş zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sabit ve canlı hücrelerde binlerce floresan proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet