Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Bu prosedürün genel amacı, fikse edilmiş veya canlı hücrelerde birden fazla protein türünü nanometre hassasiyetinde eş zamanlı olarak görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle mikroskoptan gelen odaklanmış bir görüntünün kamera çipi üzerine yansıtılmasına kadar kamera ve optiklerin konumunun ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, lazer ışınlarının mikroskop tablasındaki bir örnekle doğrudan hizalanacak şekilde düzenlenmesidir.

Ardından, hazırlanan hücre örneği aydınlatılır ve istenen proteinleri eksprese eden bir hücre seçilir. Son adım, örneğin lazerlerle aydınlatılması ve ardından hücre floresansının bir veri seti elde etmek için kamera çipine yönlendirilmesi yoluyla floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobisi ile hücrenin görüntülenmesidir. Nihayetinde, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobisi, sabitlenmiş veya canlı hücrelerde, geniş alanla veya örneğin ince bir bölgesini izole etmek için toplam internal yansıma floresansı kullanıldığında, birden fazla protein türünün nanometre uzamsal ölçekteki lokalizasyonunu göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin konfokal veya elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sabitlenmiş veya canlı hücrelerde birden fazla proteinin nanometre çözünürlükle eş zamanlı olarak görüntülenebilmesidir. Aşağıdaki adımlar, beraberindeki metin protokolünde şekil bir olarak sunulan çok renkli F Om düzeneğinin şeması olan buradaki numaralandırma sistemine atıfta bulunmaktadır; mikroskobu hizalamak için, 10 x objektif yerindeyken ve lamba geçirgen ışığa ayarlanmış haldeyken, mikroskop tablasına bir kalibrasyon ölçeği veya radyal yerleştirerek başlayın. Dikeyi görüş alanının merkezine ortalayın.

Ardından, alan diyaframını kapatıp okülerler aracılığıyla dikeye bakarak mikroskobu Koehler aydınlatması için ayarlayın. Alan diyaframının kenarları net değilse, hem alan diyaframı hem de cetvel netleşene kadar kondansatörün yüksekliğini ayarlayın. Daha sonra, alan diyaframının yanal konumunu görüş alanı ile merkezlenecek şekilde ayarlayın ve alan diyaframını, sadece cetvel üzerindeki merkez ızgarası aydınlanana kadar kapatın.

Bu bileşenler ilk kez birleştirildiğinde, her bir kanalın yol uzunluklarını eşit olacak şekilde ayarlayın. Bunu gerçekleştirmek için, kamera çipi üzerindeki kırmızılığı yedi ve dokuz numaralı aynaları ayarlayarak düzenleyin ve iki kanal arasında mekansal çakışmayı önlemek için tespit açıklığını kapatın. Ardından, yansıtılan ışık kanalındaki radikalin görüntüsünü odaklayın ve iletilen ışık kanalında da odağın doğru olup olmadığını kontrol edin.

Geçirgen ışık kanalındaki görüntü net değilse, radikal görüntüsü her iki kanalda aynı anda netleşene kadar dokuz numaralı aynayı kaydırın. Birinci merceği lazer yolundan çıkarıp aktivasyon ve okuma ışınlarını engelleyerek lazerleri hizalamaya başlayın. Ardından, dördüncü aynaya sıfır konumda beyaz bir kart yerleştirin, mikroskop kapağını açın ve radikal görüntüsü dördüncü aynanın önündeki karta yansıyana kadar odaklama yapın.

Ardından, okuma ışınının önündeki engeli kaldırın ve okuma lazerini dördüncü aynadaki radikal görüntüsünün artı işaretine merkezlemek için birinci aynayı ayarlayın. Merkezleme tamamlandığında, radikal görüntüsünü beşinci aynaya yansıtın ve ışın beşinci aynanın görüntü artı işaretine merkezlenene kadar dördüncü aynayı ayarlayın. Okuma ışını şu anda hem M dört hem de M beş üzerinde merkezlenmiş olmalıdır.

Ardından, birinci kepengi kapatarak okuma ışınını engelleyin. Daha sonra, radikal görüntüsünü üçüncü aynaya yansıtın. Işın genişleticiyi lazer yolundan çıkarın ve aktivasyon lazerinin önündeki engeli kaldırın.

Şimdi, aktivasyon ışınını üçüncü aynadaki radikal görüntüsünün artı işaretine ortalamak için ikinci aynayı ayarlayın. Ortalandıktan sonra, iki ve üçüncü aynalar arasındaki ışın genişleticiyi yerine yerleştirin ve ışın, radikal görüntüsünün artı işaretine ortalanana kadar ışın genişleticinin konumunu ayarlayın. Üçüncü aynada, radikal görüntüsünü beşinci aynaya yansıtın ve odaklayın.

Mikroskobun odaklama düğmesini kullanarak, aktivasyon ışını kırmızı görüntünün merkezine gelene kadar bir numaralı dikroik aynanın açısını ayarlayın. Ardından, objektif takılı değilken ve mikroskop panjuru açıkken, iki numaralı panjuru kapatarak aktivasyon lazerini engelleyin. Okuma panjuru olan bir numaralı panjuru açın ve lazeri mikroskobun arka açıklığından yansıtın.

Işın mikroskoptan çıkana kadar beş numaralı aynayı ayarlayın; böylece ışın, bir numaralı lens ve objektif tekrar yerindeyken mikroskoptan dikey olarak çıkar. Aktivasyon lazeri engellenmiş haldeyken, sahneye 100 µM brom bromin B içeren bir numune yerleştirin. Okuma lazerini 60 x objektif üzerinden boyanın içine yansıtın.

Elektron çarpan kazancı devre dışıyken bu görüntüyü kameraya gönderin. Ardından, objektifi numuneye odaklayın.

Tüm ışın profilinin görüntülenmesine izin verecek kadar açıklığı genişletin. Ardından, ışın profilinin merkezi ile açıklık merkezini çakıştıracak şekilde açıklığı yanal olarak kaydırın. Kamera yazılımını kullanarak, her iki kanalı da kapsayan en küçük kamera okuma bölgesini belirleyecek ilgi alanını seçin ve bu koordinatları kaydedin.

Bu noktada, okuma ışını profilini temsil eden tek bir anlık görüntü kaydedin. Ardından, birinci shutter'ı kapatarak okuma lazerini engelleyin ve ikinci shutter'ı açın. Aktivasyon ışını profilini ölçmeye başlamak için aktivasyon lazerini numuneye yönlendirin; gerekirse 100'den düşük bir elektron çarpan kazancı (gain) kullanın ve ışın her bir görüş alanında merkezlenene kadar ilk dikroik aynayı ayarlayın.

Ardından, çok renkli F palm görüntülerini elde etmeye başlamak için aktivasyon ışın profilinin bir anlık görüntüsünü kaydedin. Tüm oda aydınlatmasını kapatın. Daha sonra, cıva lambasını çevirme bağlantısı aracılığıyla transfekte edilmiş hücrelere yansıtın ve filtre küpünü, ön fotoğraf anahtarlama durumunun uygun uyarım dalga boyunu içeren küp ile değiştirin.

Bir hücre seçildikten sonra, lazerlerin mikroskoba girmesine izin vermek için flip mount'u aşağı indirin ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı üzere filtre taretini görüntüleme için uygun dikroik aynayı içeren konuma getirin. Ardından, transfekte edilen hücreleri arka plan floresanından ayırt etmek ve moleküllerin fotoğraflanabilir olduğunu onaylamak için bu görüntüyü kameraya yansıtın. Numuneyi, aktivasyon lazerinden gelen 10 micro watts değerinin altındaki düşük bir güçle kısa süreliğine aydınlatın.

Ardından, elektron çarpan kazancını 200 ve istenen kare sayısını 5 ile 10.000 arasında ayarlayarak kamera yazılımını kinetik seri alımına hazırlayın. Ayrıca pozlama süresini 10 ile 30 milisaniye arasına ayarlayın. Sonrasında aktivasyon ışınını engelleyin, okuma ışınındaki engeli kaldırın ve aydınlatılmış hücrenin görüntüsünü kameraya yansıtın.

Bireysel moleküller artık görünmeyene kadar odağı aşağı kaydırarak alt hücresel membrana yakın bir odak düzlemi seçin. Ardından, moleküller ilk kez görünene kadar odağı kademeli olarak yukarı taşıyın. Şimdi aktivasyon ışınındaki engeli kaldırın ve örneği santimetrekare başına bir watt'tan daha düşük bir yoğunlukla aydınlatın.

Aktivasyon lazerinin önündeki nötr yoğunluk filtresini dinamik olarak ayarlayarak, mikron kare başına 0,1 ila 1 görünür fotoğraflanabilir molekül yoğunluğunu korurken kamera yazılımı üzerinden bu verileri toplamaya başlayın. Total internal refleksiyon floresan görüntüleme için, ayna beşi ve lens biri, mikroskobun girişinin hemen arkasında yanal olarak hareket ettirilmek üzere tek bir translasyon tablasına monte edin. Ayna beşi ve lens biri yer değiştirirken, objektiften yukarıya, numunenin içinden çıkan lazerler kademeli olarak bir yana doğru eğilecektir; lazerlerin açısı dikeyden 90 dereceye ulaşana kadar tablayı kaydırmaya devam edin.

Bu noktada, çıkan lazerin kendisi yok olacak ve gelen lazer, gelen ışına antiparalel olarak hareket ederek ve yana kayarak açıklıktan geri yansıyacaktır. Görüntü alımları tamamlandığında, örnek toplam internal yansıma floresansı durumuna girdiğinde arka planda bir azalma görmelisiniz; mikroskop kapağını hemen kapatın ve her iki ışını da engelleyin. Elektron çarpan kazancını devre dışı bırakın.

Kamerayı tek kare kaydedecek şekilde ayarlayın ve kamera okuma bölgesini maksimum boyutuna getirin. Son olarak, mikroskop lambasına monte edilmiş uzun geçiren filtre ile F üç veya F dört üzerine bir kart yerleştirerek bir kanalı engelleyin. Numuneyi aydınlatın ve bu görüntüyü kameraya yansıtın.

Geçirgen ışıkta hücrenin tamamını temsil etmek üzere hücrenin bir anlık görüntüsünü kaydedin. Burada, hem DENDRA two Hemagglutinin hem de PAM Cherry aktin eksprese eden bir NIH three T three hücresinin iki renkli F palm görüntüleme örneği gösterilmiştir. Soldaki geçirgen kanal, sağdaki yansıtılan kanaldan daha uzun dalga boyları içerir.

Burada, arka plan çıkarımı ve sol ve sağ kanalları üst üste bindirmek için yapılan dönüşümün ardından, aynı iki renkli F OM görüntüsünden alınan anlık görüntüler gösterilmektedir. Münferit moleküller tanımlanabilir ve lokalize edilebilir. Bazı moleküller iletim kanalında daha parlak görünürken, bazılarında iki kanal arasındaki emisyonun daha dengeli bir dağılımı vardır.

Bu, PAM cherry ve DENDRA ikiyle olan emisyon spektrumları arasındaki farkı göstermektedir ve analizlerde bu iki türü tanımlamak için kullanılır. Burada gösterilen histogram, toleranslar uygulandıktan sonra tüm lokalize moleküller için toplam yoğunluğa bölünen kırmızı iletilen kanal yoğunluğu oranını belirtmektedir. Pikseler sol alt resimde beyaz görünürken, sağ alt köşede gösterilen nihai birleştirilmiş resimde kırmızı görünür; yeşil bölgedeki pikseller ise sağ üst resimde beyaz görünürken sağ alt köşedeki nihai birleştirilmiş resimde yeşil görünür.

Görüntüleme sırasında seçilen eşik değerleri, gürültü düzeyini ve kolokalizasyon görünümünü büyük ölçüde etkiler. Burada, farklı derecelerde sızıntı (bleed-through) ile sonuçlanan üç farklı görüntüleme seçeneği sunulmuştur; en ihtiyatlı eşik değerleri alttaki iki seçenekte gösterilmektedir. Renk F palm alfa histogramları, görüntüde iki belirgin pik olduğu durumlarda en iyi şekilde yorumlanır.

Soldaki histogram daha ayrıntılı analiz için uygun bir aday olsa da, diğer iki histogramdan elde edilen görüntüleri bu prosedürü takip ederek yorumlamak çok daha zor olacaktır. Proteinlerin canlı hücre membranlarında nanoklâvye ölçeğinde nasıl organize olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için total internal yansıma mikroskopisi ve canlı hücre görüntüleme gibi yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kendi FAR mikroskobunuzu nasıl kuracağınız ve veri toplamak için nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü denemeden önce güvenlik eğitiminin tamamlanmış olması gerekir.