Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Bu prosedürün genel amacı, sabit veya canlı hücrelerde birden fazla protein türünü aynı anda nanometre hassasiyetinde görüntülemektir. Bu, mikroskoptan odaklanmış bir görüntü kamera çipine yansıtılana kadar önce bir kameranın ve optiğin konumunu ayarlayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, lazer ışınlarını mikroskop sahnesinde bir numune üzerine doğrudan hizalanacak şekilde düzenlemektir.

Daha sonra hazırlanan hücre örneği aydınlatılır ve istenen proteinleri ifade eden bir hücre seçilir. Son adım, numuneyi lazerlerle aydınlatarak hücreyi floresan foto aktivasyon lokalizasyon mikroskobu ile görüntülemek ve ardından bir veri seti seti elde etmek için hücre floresansını kamera çipine yönlendirmektir. Sonuç olarak, floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu, sabit veya canlı hücrelerde ve her iki geniş alanda veya numunenin ince bir bölgesini izole etmek için toplam iç yansıma floresansı kullanıldığında, nanometre uzamsal ölçekte çoklu protein türlerinin lokalizasyonunu göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin konfokal veya elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, sabit veya canlı hücrelerde nanometre çözünürlüğü ile aynı anda birden fazla proteinin görüntülenebilmesidir. Aşağıdaki adımlar, burada gösterildiği gibi bir numaralandırma sistemine atıfta bulunur, bu, mikroskobu hizalamak için ekteki metin protokolünde şekil olarak verilen çok renkli F Om kurulumu için bir şema olup, mikroskop aşamasına 10 x objektif yerleştirilmiş ve iletilen ışık için lamba ayarlanmış olarak bir kalibrasyon ölçeği veya radikal yerleştirerek başlayın. Dikeyi görüş alanının merkezinde ortalayın.

Ardından, alan açıklığını kapatarak ve oküler kısımdan dikey olarak bakarak mikroskobu daha sert aydınlatma için ayarlayın. Alan açıklığının kenarları odak dışındaysa, hem alan açıklığı hem de kırmızı netleme olana kadar kondansatörün yüksekliğini ayarlayın. Ardından, alan açıklığının yanal konumunu, görüş alanına göre ortalanana kadar ayarlayın ve alan açıklığını, yalnızca kırmızı üzerindeki merkez ızgara yanana kadar kapatın.

Bu bileşenler ilk kez monte edildiğinde, her kanalın yol uzunluklarını eşit olacak şekilde ayarlayın. Bu projeyi gerçekleştirmek için, kamera çipi üzerindeki kırmızı ayna yedi ve dokuzuncu aynaları ayarlar ve iki kanal arasındaki uzamsal örtüşmeyi önlemek için algılama açıklığını kapatır. Ardından, radikalin görüntüsünü yansıyan ışık kanalına odaklayın ve iletilen ışık kanalında da odakta olup olmadığını kontrol edin.

İletilen ışık kanalındaki görüntü odakta değilse, radikal görüntü her iki kanalda aynı anda odakta olana kadar dokuzuncu aynayı çevirin. Birinci lensi lazer yolundan çıkararak ve aktivasyon ve okuma ışınlarını bloke ederek lazerleri hizalamaya başlayın. Ardından beyaz bir kartı dördüncü aynaya aynı hizada yerleştirin, mikroskop deklanşörünü açın ve radikal görüntü dördüncü aynanın önündeki karta yansıyana kadar odaklanın.

Ardından, okuma ışınının engelini kaldırın ve okuma lazerini dördüncü aynadaki radikal görüntünün artı işaretlerine ortalamak için ayna bir'i ayarlayın. Ortalandıktan sonra, radikal görüntüyü beşinci aynaya yansıtın ve ışın beşinci aynanın görüntü artı işaretlerine odaklanana kadar dördüncü aynayı ayarlayın. Okuma ışını şimdi hem M dörtte hem de M beşte ortalanmalıdır.

Ardından, birinci deklanşörü kapatarak okuma ışınını engelleyin. Ardından, radikal görüntüyü üçüncü aynaya yansıtın. Işın genişleticiyi lazer yolundan çıkarın ve aktivasyon lazerinin engelini kaldırın.

Şimdi, aktivasyon ışınını üçüncü aynadaki radikal görüntünün artı işaretlerine ortalamak için ayna iki'yi ayarlayın. Ortalandıktan sonra, ışın genişleticiyi iki ve üç aynalar arasına yerleştirin ve ışın genişleticinin konumunu, ışın radikal görüntünün artı işaretlerinde ortalanana kadar ayarlayın. Üçüncü aynada, radikal görüntüyü beşinci aynaya yansıtın ve odaklanın.

Mikroskobun odak düğmesini kullanarak, aktivasyon ışını kırmızı görüntü üzerinde ortalanana kadar bir numaralı dikroik aynanın açısını ayarlayın. Ardından, yerinde objektif yokken ve mikroskop deklanşörü açıkken ikinci deklanşörü kapatarak aktivasyon lazerini engelleyin. Okuma deklanşörü deklanşörünü bir açın ve lazeri mikroskobun arka açıklığından yansıtın.

Işın mikroskoptan çıkana kadar beşinci aynayı ayarlayın, böylece ışın mikroskoptan birinci mercek ve objektif tekrar yerinde olacak şekilde dikey olarak çıkar. 100 mikromolar brom B içeren bir numuneyi, aktivasyon lazeri bloke edilmiş olarak sahneye yerleştirin. Okuma lazerini 60 x'lik bir objektiften geçirip boyaya yansıtın.

Elektron çarpma kazancı devre dışı bırakıldığında. Bu görüntüyü kameraya gönderin. Ardından, hedefi örneğe odaklayın.

Diyaframı, tam huzme profilinin görüntülenmesine izin verecek kadar geniş açın. Ardından açıklığı yanal olarak çevirin, böylece ışın profilinin merkezi ve açıklık eş merkezli olur. Kamera yazılımını kullanarak, her iki kanalı da kapsayan en küçük kamera okuma bölgesine izin vermek için ilgilenilen bölgeyi seçin ve bu koordinatları kaydedin.

Bu noktada, okuma ışını profilini temsil etmek için tek bir anlık görüntü kaydedin. Ardından, birinci deklanşörü kapatarak ve ikinci deklanşörü açarak okuma lazerini engelleyin. Aktivasyon ışını profilini ölçmeye başlamak için, aktivasyon lazerini numuneye yansıtın, gerekirse, 100'den daha az bir elektron çarpma kazancı kullanın ve ışın her görüş alanında ortalanana kadar ilk dikroik aynayı ayarlayın.

Ardından, çok renkli F avuç içi görüntüleri elde etmeye başlamak için aktivasyon ışını profilinin bir anlık görüntüsünü kaydedin. Tüm oda aydınlatmasını ortadan kaldırın. Ardından, cıva lambasını çevirme yuvası aracılığıyla transfekte edilmiş hücrelere yansıtın ve filtre küpünü, ön fotoğraf anahtarının uygun uyarma dalga boyunu içeren bir küple değiştirin. Devlet.

Bir hücre seçildikten sonra, lazerlerin mikroskoba geçmesine izin vermek için çevirme yuvasını aşağı doğru hareket ettirin, filtre taretini, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüleme için uygun dikroik aynayı içeren taretle değiştirin. Ardından, transfekte edilmiş hücreleri arka plan floresansından ayırt etmek ve moleküllerin fotofik olduğunu doğrulamak için bu görüntüyü kameraya yansıtın. Aktivasyon lazerinden 10 mikro watt'tan daha düşük bir güçle numuneyi kısaca aydınlatın.

Ardından, elektron çarpma oyununu 200'e ve istenen kare sayısını beş ile 10.000 arasında ayarlayarak kamera yazılımını kinetik seri alımı için hazırlayın. Ayrıca pozlamayı 10 ila 30 milisaniye arasında ayarlayın. Ardından aktivasyon ışınını bloke edin, okuma ışınının engelini kaldırın ve aydınlatılmış hücrenin görüntüsünü kameraya yansıtın.

Tek tek moleküller artık görünmeyene kadar odağı aşağı kaydırarak alt hücre zarına yakın bir odak düzlemi seçin. Ardından, moleküller ilk görünür hale gelene kadar odağı kademeli olarak yukarı doğru hareket ettirin. Şimdi aktivasyon ışınının engelini kaldırın ve numuneyi santimetre kare yoğunluk başına bir watt'tan daha az bir miktarla aydınlatın.

Aktivasyon lazerinin önündeki nötr yoğunluk filtresini dinamik olarak ayarlayarak mikron kare başına 0,1 ila bir görünür fotoable molekül yoğunluğunu korurken bu verileri kamera yazılımı aracılığıyla elde etmeye başlayın. Toplam iç yansıma için, floresan görüntüleme, ayna beşi ve merceği mikroskobun girişinin hemen arkasına yanal olarak hareket ettirilecek tek bir çeviri aşamasına monte edin. Beşinci ayna ve birinci mercek çevrilirken, numuneden yukarı doğru objektiften çıkan lazerler yavaş yavaş bir tarafa eğilecek, lazerlerin açısı dikeyden 90 dereceye ulaşana kadar sahneyi çevirmeye devam edecektir.

Bu noktada, ortaya çıkan lazerin kendisi kaybolacak ve gelen lazer, gelen ışına paralel olarak hareket eden açıklığa geri yansıtılacak ve yana doğru yer değiştirecektir. Görüntü alımlarının tamamlanmasının ardından numune toplam iç yansıma floresansına girdiğinde arka planda bir azalma görmelisiniz, mikroskop deklanşörünü hemen kapatın ve her iki ışını da engelleyin. Elektron çarpma kazancını devre dışı bırakın.

Kamerayı bir kare kaydedecek şekilde ayarlayın ve kamera okuma bölgesini maksimum boyutuna ayarlayın. Son olarak, mikroskop lambasına monte edilmiş uzun geçiren bir filtre ile F üç veya F dört üzerine bir kart yerleştirerek bir kanalı bloke edin. Örneği aydınlatın ve bu görüntüyü kameraya yansıtın.

İletilen ışıkta tüm hücreyi temsil etmek için hücrenin anlık görüntüsünü kaydedin. Burada, hem DENDRA iki Hemaglutinin hem de PAM Kiraz aktinini eksprese eden bir NIH üç T üç hücrenin iki renkli F avuç içi ediniminin bir örneği gösterilmektedir. Soldaki iletilen kanal, sağdaki yansıyan kanaldan daha uzun dalga boyları içerir.

Burada, sol ve sağ kanalları kaplamak için arka plan, çıkarma ve dönüştürmeyi takip eden aynı iki renkli F OM alımından elde edilen anlık görüntüler gösterilmektedir. Bireysel moleküller tanımlanabilir ve lokalize edilebilir. Bazı moleküller iletilen kanalda daha parlak görünür ve bazıları iki kanal arasında daha eşit bir emisyon dağılımına sahiptir.

Bu, sırasıyla PAM kirazı ve DENDRA ikisi arasındaki emisyon spektrumlarındaki farkı gösterir ve bu iki türü tanımlamak için analizde kullanılır. Burada gösterilen histogram, toleranslar uygulandıktan sonra tüm lokalize moleküller için kırmızı iletilen kanal yoğunluğunun toplam yoğunluğa bölünme oranını gösterir. Pikseller sol alt görüntüde beyaz görünür ve sağ altta gösterilen son birleştirilmiş görüntüde kırmızı görünür, burada yeşil bölgedekiler sağ üst görüntüde beyaz olarak gösterilir ve sağ altta gösterilen son birleştirilmiş görüntüde yeşil görünür.

Render sırasında seçilen eşik seviyeleri, gürültü derecesini ve kolokalizasyonun görünümünü büyük ölçüde etkiler. Gösterilen. Burada, en muhafazakar eşik seviyelerinden farklı derecelerde taşma ile sonuçlanan işleme için üç farklı seçenek verilmiştir: alttaki iki yerde gösterilmiştir. Renkli F avuç içi alfa histogramları, görüntüde fark edilebilir iki tepe noktası olduğunda yorumlamak için en iyisidir.

Soldaki histogram daha fazla analiz için iyi bir aday olsa da, diğer iki histogramdan elde edilen görüntülerin bu prosedürü takiben yorumlanması çok daha zor olacaktır. Toplam iç yansıma, mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme gibi yöntemler, proteinlerin canlı hücre zarlarında nano ölçekte nasıl organize edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kendi FAR mikroskobunuzu nasıl kuracağınızı ve veri elde etmek için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü denemeden önce güvenlik eğitiminin tamamlanması gerektiğini unutmayın.