Name: Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Öğrenin tomurcuklanan maya hücrelerinden protein ekstraksiyonu ve saflaştırma yöntemini. Bu protokol, protein etkileşimlerini ve post-translasyonel modifikasyonları koruyarak biyokimya ve proteomik araştırmaları için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyeleri teşekkür ederiz. Biz maya suşu MHY3765 Mark Hochstrasser teşekkür ederim. Bu çalışma, NSF hibe 1051970 (OK) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Seyahat hibe ve Monroe Alimler Programı Hibe (ES) tarafından desteklenmiştir.

Doğal koşullar altında tomurcuklanma maya hücrelerinde ifade 6xHis-etiketli proteinlerin saflaştırılması 1. Protein İfade Maya Hücreleri ve İndüksiyon Büyüme (2 Modifiye) İSTEĞE BAĞLI: İlgi yerine aşağıda tarif edilen galaktoz ile indüklenen kültürlerin proteini ifade logaritmik olarak artan maya kültürleri kullanın. <ol><li> Bir plazmid kodlama bir galaktoz-indüklenebilir tercih protein 6xHis-etiketli bir Gal + maya suşu hücreleri dönüştürmek. Örneğin, reaktif listesine bakın. </li><li> % 2 sukroz içeren uygun seçici medya 5 ml (örneğin SD-urasil) in transformantlar aşılamak. 30 ° CO / N, dönen inkübe edin. </li><li> 600 nm&#39;de optik yoğunluk% 2 sukroz ile seçici ortam 33 ml 0.3 (= 0.3 OD 600) ölçer, böylece O / N kültür seyreltilir. (Δ150 rpm) sallayarak, 30 ° C de büyür. </li><li> Kültür OD = 600 0.8 eriştiğinde-1.5,% 2 galaktoz ile 1x YEP bir son konsantrasyon için,% 6 galaktoz (Tablo 1 &#39;de tarifi) ile 3 kez YEP 17 ml ilave edilerek istenen proteinin ekspresyonunu. Toplam kültür hacmi şimdi 50 ml. Inkübe, ek bir 5-6 saat için 30 ° C&#39;de, sallayarak. Not: kültür hacmi değiştirilebilir. Arzu edilen nihai hacim üçte ikisi içine adım 1.3, seyreltik olarak. Adım 1.4, 3x YEP / 6% galaktoz üçte biri son hacim ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5,000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca uyandırılan kültürü ve santrifüj hücre Δ150-200 OD 600 birimlerinin OD 600 ölçün </li><li> 1x proteaz inhibitörü kokteyli ve 2 ml&#39;lik vidalı somunlu bir tüpe transfer 1 ml buz gibi soğuk PBS ile süspanse 1x hücre pelletini. </li><li> 4 de 15.000 rpm&#39;de 1 dakika santrifüj hücreleri ° C Durusu süpernatant. </li><li> -80 Hemen hücre parçalama veya depolama ° C daha sonra kullanmak kadar takip, sıvı nitrojen içinde dondurularak hücre pelet çekin. </li></ol><ol><li> Bir önceki adımda dondurulmuş hücre pelletini için, asitle yıkanmış cam boncuk ve 200 ul buz gibi soğuk lizis tamponu ile 500 ul (Tablo 1 ya da tercih edilen hücre parçalama tamponu kullanımda tarifi) ekleyin. </li><li> Kısaca ve aşağı yukarı pipetle. Bu, tam olarak hücre pelletini için gerekli değildir. Her zaman buz üzerinde tüpler tutun. Not: pipet sonu ve aşağı yukarı pipetleme önce kesilebilir. </li><li> 4 ° C, yer boncuk değirmeni, denge, kilit, ve başına üreticinin talimatlarına olarak makine çalıştırmak içine hücreleri ile tüp (ler). </li><li> 5.5 az 20 saniye boyunca tüp (ler) içeren boncuk çırpıcı m / sn, daha sonra 1 dakika sulu buz üzerinde yer çalıştırın. Toplam 6x tekrarlayın. </li><li> 4 ile 15,000 rpm&#39;de 15 dakika için santrifüjleme ile ekstre protein Temizle ° C İSTEĞE BAĞLI: Bir SPINX filtreden santrifüj küçük partiküller kaldırın. </li><li> Bütün hücre e bir örnek hazırlamaWestern Blot tarafından ilgi protein varlığını doğrulamak için (BOA) Çkartlacak: <ol><li> 800 ul% 20 trikloroasetik asit (TCA) ile hücrelerin 2 OD 600 birim (temizlenir özü örneğin 5 ul hücre 200 OD 600 tane hasat edildi varsa) karşılık gelen WCE ekleyin. Karıştırmak için Vortex. </li><li> 4 ° C&#39;de 15,000 rpm&#39;de 2.5 dakika boyunca santrifüje Süpernatant Durusu, ancak pelet korumak için dikkatli olun. </li><li> 4 ile 15,000 rpm&#39;de 2.5 dakika süreyle santrifüj takip pelet ve vorteks tüp% 2 TCA 800 ul ° C&#39;de ekleme Süpernatant Durusu, ancak pelet korumak için dikkatli olun. </li><li> TCA Örnek Tampon 100 ul (Tablo 1&#39;de Tarif), pelet çözmek için vorteks ekleyin. Not: örnek tampon pelet ek sonra (sarıya döner) asidik hale gelirse, Δ10 ul Tris baz hacimde ekleyin [1M] örnek yine mavi olana kadar. </li><li> 2-5 dakika boyunca 100 ° C ısıya blok inkübe edin. </li><li> Vortex agpelet kalıntıları hala mevcut olup olmadığını ain tamamen çözmek için. Bu yöntemle hazırlanan granüller tam olarak çözünmesi için bilindiği gibi zordur. Bu tamamen pelet çözmek için vorteks bir Δ10 dakika sürebilir. </li><li> -80 Mağaza örnek ° C daha sonra kullanmak kadar. </li></ol></li><li> Daha sonra kullanmak kadar -80 sıvı azot ve mağaza kalan temizlenmiş BOA ° C alikotları dondurma oturtun. </li></ol> 3. Maya Hücre homojenatlar gelen Proteinlerin Toplu Arıtma Not: Bu saflaştırma yöntemi Co 2 + metal afinite reçinesi üzerinde 6xHis-etiketli proteinlerin saflaştırılması için optimize edilmiştir. <ol><li> Reçine Dengeleme <ol><li> Hücrelerin Δ20-40 OD 600 birim hazırlanan temizlenir WCE bir örnek, bir mikrosantrifüj tüpüne afinite reçinesi 50-100 ul ekleyin. , Arzu edilen bir proteini ya da amiloz olarak spesifik olmayan bir reçine, ifade etmedi hücrelerinden ekstre proteinleri kontrol olarak kullanılabilirSpesifik olmayan bağlanma için n. </li><li> Yıkama tamponu 1 ml ile 5x reçine yıkayın: üst-over-alt ters reçine bekletilir ve sonra 4 az 5000 rpm&#39;de 1 dakika dönmeye kadar ° C Süpernatant aspire. Not: Aynı gün ekstraksiyon ve saflaştırma yerine eğer reçine dengeleme ekstraksiyon öncesinde yapılabilir. </li></ol></li><li> Afinite saflaştırma için Protein Bağlanma <ol><li> 50-100 ul yıkanmış boncuk temizlenir lizat 100-200 ul (Δ20-40 OD 600 adet) ekleyin ve lizis tamponu ile 1 ml toplam hacmi getirmek. </li><li> 2-5 saat 4 de nütasyon veya sallanan ° C ile inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5000 rpm&#39;de 1 dakika için Spin </li><li> Eğer arzu edilirse, bağlanmamış proteinin bir sonraki analiz için kalan süpernatant bir örnek kaydedin. TCA BOA (adım 2.6) için yukarıda ayrıntılı olarak hızlandırabilir. </li><li> Az 5000 rpm&#39;de 1 dakika için bir spin ardından yıkama tamponu 1 ml 5x bağlı proteinler, reçine yıkayın4 ° C Yıkar esnasında numuneler soğuk tutun. </li></ol></li><li> Bağlı proteinler elüsyon <ol><li> 4 de, reçineye nutate 150 ul yıkama tamponu ekleyin ° C 5 dakika, 4 az 5000 rpm&#39;de 1 dakika için sıkma ° C ve yeni bir tüp süpernatant kaydedin. İSTEĞE BAĞLI: 2x ve havuz elutions tekrarlayın. </li><li> Western blot yıkandı, örnek hazırlayın: yıkandı, protein 25 ul, 25 ul 2x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tampon maddesi eklemek 2 ul β-merkaptoetanol (BME) ve 2 dakika boyunca 100 ° C ısıya blok inkübe edin. Not: Standart 2X Laemmli numune tamponu da kullanılabilir. </li><li> Sıvı nitrojen içinde dondurularak aşırı yıkandı, protein çekin. İSTEĞE BAĞLI: 65 2x LDS numune tamponu eşit hacmi ile reçineden şerit kalan proteinler ° C de 5 dakika süre ile, yeni bir tüpe LDS-yıkandı, proteinlerin uzaklaştırılması, daha sonra değil, reçine, yıkandı, proteinlere 2 ul BME ekleyin. Bu sipariş conjuga herhangi bir iyon ya da antikor kaldırılmasını önlemek içinboncuk Ted. </li><li> -80 ° C daha sonra kullanmak kadar mağaza örnekleri. </li></ol></li><li> Uygun antikorlar ile Western Blot ve prob proteinleri görselleştirmek için. <ol><li> Her bir numune, 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 birim) ve tercih edilen bir SDS-PAGE jeli bulunan bir protein merdivenin 3-10 ul yerleştirin. Bu protokol için rutin olarak kullanılan jeller,% 4-12 Bis-Tris ve% 8 Tris-Glisin içerir. </li><li> 50 dakika 200 V jel çalıştırın. </li><li> 20-30 dakika (Tablo 1&#39;de tarifi) için 19 V yarı-kuru transferi ile jel bir PVDF membran proteinleri aktarın. </li><li> % 4 milk/1x Tris Blok membran 4 ° C (Tablo 1 &#39;de tarif) oda ısısında veya O / N, 1 saat boyunca tuzlu su ara-(TBST) tamponlu. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında O / N az 1-3 saat boyunca 4% milk/1x TBST ilgi epitop etiketli protein birincil antikor ile inkübe membran </li><li> 5 dakika 1x TBST ile her biri için 3x membran yıkayın. </li><li> Uygun ile membran inkübeİkinci yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge edilmiş, oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca bir antikor. </li><li> 1x TBST büyük bir hacim içinde 15 dakika her biri için 3x membran yıkayın. </li><li> Saran wrap ECL substrat ve şal ile membran kapak. </li><li> Film membran Açığa ve protein görselleştirmek için gelişir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li>
<li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li>
<li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li>
<li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li>
<li>Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeutscher%2C+MP+%22Guide+to+protein+purification%22">Guide to protein purification</a>. , (1990).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233(1988).</li>
<li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2%2B+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li>
<li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li>
<li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74(2011).</li>
<li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol sağlam, yerli hazırlanması odaklanır, ve post-translationally aşağı akım uygulamaları için tomurcuklanan maya hücrelerinden protein değiştirilmiş. Bu protokol başlamadan önce, ilgi protein kolayca koşullar 12 denatüre hazırlanan protein özleri tespit edilebilir olmadığını belirlemek için önemlidir. Poliklonal antikorlar, mevcut değil ise bu füzyon proteininin Western lekeleri üzerinde tespit edilebilir, böylece etiket ilgi protein epitopa avantajlı olabilir. Bu protokol, HA, 6xHis-V5 veya myc epit...

Maya genetik üstün gücünü efsanedir, ama tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae, gelen yerli proteinlerin hazırlanması ve analiz genellikle sorunlarla doludur. İkinci önemli bir mekanik dayanımı ve maya hücre duvarı 1 elastisite kaynaklanmaktadır. Farklı vasıtasıyla enzimatik ve kimyasal, mekanik ve basınç tabanlı bütün hücre protein ekstresi 2-6 elde etmek için maya hücrelerinin bozulması için tarif edilmiştir. Bu teknikler, daha sonraki analizler ve arıtma aşamalarında kullanılabilir hücre Örnek, doğal protein özleri elde etmek için bu etkinliği açısından büyük farklılıklar gösterir. Örneğin, maya hücre duvarı litik enzimler (örneğin zymolyase) ve ortaya çıkan spheroblasts ile temizlenebilir makaslama, deterjanlar ya da protein serbest bırakmak için osmotik lizis ile bozulabilmektedir. Bu yaklaşım başarılı birçok hücre içi fraksiyonlar için başlangıç ​​noktası olarak istihdam ama uzun inkubasyon gerektirir edilmiştirbazı proteinlerin 7 istikrarı ile uyumlu değildir. Maya hücreleri proteinlerin kimyasal çıkarılması için tescilli maya lizis reaktifler (deterjanlar gibi), ticari olarak mevcuttur, ancak bu protein ekstraksiyon reaktifleri ve proteinlerin sonraki biyokimyasal karakterizasyonu üzerindeki etkisinin etkinliğini her 8 açık değildir. Genellikle Fransız presler olarak adlandırılan yüksek basınç homojenizatör, etkili ilk yüksek basınç onlara tabi ve daha sonra bir basınç hücre küçük bir açıklıktan onları ekstrüzyon tarafından maya hücreleri kırmak. Bu teknik, yüksek kaliteli özler üretir ama ekipman çok pahalı ve hücreleri veya birden fazla numune 9 küçük miktarlarda için uygun olmayabilir. Bu nedenle, bir boncuk değirmeni içinde maya hücrelerinin mekanik bozulması genellikle yerli maya protein preparatları 10 için tercih edilen bir yöntemdir. Bu teknik, asit-wa ile maya hücre duvarının mekanik bozulması içerirShakers, vortexers veya boncuk fabrikaları çeşitli yapılabilir cam boncuk, döken. Özellikle, bu yöntem, aynı zamanda, birden fazla küçük numuneleri (hücre ya da daha az, 1 ml) işlemek için kullanılabilir. Birçok farklı boncuklar ya da boncuk değirmeni bozulması matris hemen 2 ml tüpler içinde hücre tipi, hemen hemen her türlü bozmak için ticari olarak temin edilebilir. Diğer teknikler ve donanım göz önüne alındığında, bir boncuk değirmeni proteaz ve / veya proteazom inhibitörleri ile, uygun tamponlar kullanılmaktadır, özellikle maya hücrelerinin bozulması gibi sumoilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar korumaya yardımcı olan, çok hızlı oluşur avantajına sahiptir ve özleri sıcaklığı kontrol edilir. Bu protokol protein fonksiyonu, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için nihai hedefi ile yumuşak koşullarda endojen ve aşırı dile getirilen proteinlerin, hızlı, etkili ve güvenilir çıkarma odaklanır. Büyüme ortamı, hücre parçalama tamponukompozisyonlar, ve boncuk değirmen ayarları protein etkileşimleri ve bu sumoilasyon ve ubiquitylation gibi translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>GAL+ indüksiyon ve ekstraksiyon için kullanılabilen maya suşunda</td>Maya ORF suşu</tr><tr><td>pYES2.1 TOPO vektör</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ indüksiyon ve ekstraksiyon için kullanılabilen maya suşu; bir V5/6xHIS etiketi</td></tr><tr><td>içerir Halt Proteaz İnhibitörü Tek Kullanımlık Kokteyl ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Bağlı Vidalı Kapaklı Etekli Tüp</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Tüpün boncuk ruptörüne tam olarak oturduğundan emin olun</td></tr><tr><td>Cam boncuklar, asitle yıkanmış, 425-600 &; m (30-40 ABD elek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X santrifüj tüpü filtreleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Arıtılmış lizatın ek filtrelemesi için kullanın</td></tr><tr><td>TALON Metal Afinite Reçinesi</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>6xHIS etiketli proteinlerin saflaştırılması için</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>SDS-PAGE ve Western Blotting'den önce numuneleri hazırlamak ve/veya elüte etmek</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Jel</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0321BOX</td><td>Western Blotting'den önce SDS-PAGE için sıklıkla kullanılan prekast jeller</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Protein jel lekesi</td></tr><tr><td>Memeli Lizis Tamponu</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Alternatif ticari lizis tamponu</td></tr><tr><td>Anti-V5 agaroz</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>İmmünopresipitasyon yöntemi</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Millipore IPVH00010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS jelleri</td><td></td><td></td> Anti-mik antikor Covance mms-150R ikincil antikor NP0321BOX <td></td>Yaşam</tr><tr><td></td><td></td><td>Teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>Keçi pAb - fare IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

fonksiyon Çalışma, etkileşimler, ve post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan maya protein ekstraksiyonu ve saflaştırılması

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Boncuk dayak ile homojenizasyon bozmaya herkesin bildiği zor tomurcuklanan maya hücreleri, DNA, RNA, protein, ve metabolitleri serbest bırakmak için hızlı ve etkili bir yoldur. Burada, işlevleri, etkileşimleri ve proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonlar korumak için optimize tamponlar içine proteinlerin çıkarılması için bir boncuk değirmeni homojenizatör kullanımını tarif eder. Ilgilenilen proteini ifade logaritmik büyüyen hücreler tercih edilen bir sıvı büyüme ortamında yetiştirilir. Büyüme ortamı uyarılabilir promotörler (örneğin, galaktoz), protein ekspresyonunu başlatmak için tepkin maddeler ile takviye edilebilir, (örneğin, Nokodazol) hücre döngüsü aşaması senkronize ya da (örneğin, MG132) proteazom fonksiyonunu inhibe eder. Hücreler daha sonra, topak haline getirilir ve proteaz ve / veya fosfataz inhibitörleri ihtiva eden uygun bir tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve ya hemen işleme ya da daha sonra kullanılmak için likit nitrojende dondurulmuştur. Homojenizasyon 20 sn bea altı döngüleri gerçekleştirilird-dayak (5.5 m / sn), buz üzerinde bir dakika kuluçka takip her. Elde edilen Homojenat santrifüj ile temizlendi ve küçük parçacık süzme ile kaldırılabilir. Elde edilen temizlenmiş tüm hücre ekstresi (WCE) Western lekeleme takiben SDS-PAGE ile toplam proteinlerin doğrudan analiz için% 20 TCA ile çöktürülür. Özütleri aynı zamanda spesifik protein afinite saflaştırma, post-translasyonel modifikasyonlar, ya da ko-temizleme proteinlerin analizi saptanması için uygundur. Çoğu protein arıtma protokolü için olduğu gibi, bazı enzimler ve proteinler, saflaştırma ve diğerleri için benzersiz koşullar ya da tampon bileşimler belirtilen koşullar altında kararsız veya çözünmez olabilir gerektirebilir. İkinci durumda, sunulan protokol deneysel olarak protein çıkarma ve arıtma için en iyi boncuk-dayak strateji belirlemek için yararlı bir başlangıç ​​noktası sağlayabilir. Biz epitop-etiketli SUMO E3 ligaz, Siz1, bir hücre döngüsü çıkarılması ve saflaştırma göstermekSlx5, sumoylated ve fosforile edilmiş, hem de bir SUMO hedefli bir ubikuitin ligaz alt birimi de olur proteini düzenlenir.

Bizim temsili sonuçlar tanımlanan boncuk dayak ve protein çıkarma protokolü alt uygulamalar (Tablo 2 içinde özetlenmektedir) çeşitli proteinlerin tekrarlanabilir hazırlanması için yararlı olduğunu ortaya koymaktadır. KKE Coomassie boyama takiben SDS-PAGE protein (~ 12&gt; 250 kDa), geniş bir yelpazede tekrarlanabilir maya hücreleri (Şekil 1 A) elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Moleküler ağırlık aralığı üzerinde farklı bantlar yüksek kaliteli protein ekstreleri göstergesidir. Özle...

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Bu prosedürün genel amacı, doğal yapı fonksiyon etkileşimlerini ve translasyon sonrası modifikasyonları koruyarak maya proteinlerini ekstrakte etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili proteinin ekspresyonunu indüklemek için hücrelerin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hasat edilen maya hücreleri proteinleri ekstrakte etmek için uygun bir tampon çözelti içinde homojenize edilir.Ardından, ilgilenilen proteinler bir afinite reçinesi kullanılarak berraklaştırılmış tüm hücre özütünden saflaştırılır. Prosedürün son adımı, saflaştırılan proteinlerin ileri analizler veya sonraki uygulamalar için afinite reçinesinden elüe edilmesidir. Nihayetinde, western blot analizi temelinde protein saflaştırma modifikasyonlarını ve etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Prosedürü, laboratuvarımda lisans araştırmacısı olarak son birkaç yılını geçiren bir William and Mary mezunu olan Eva's Ky uygulamalı olarak gösterecek. Boncukla parçalama yönteminin diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein fonksiyon etkileşimlerini vele çeviri sonrası modifikasyonları koruyan koşullar altında çok sayıda örneğin hızla işlenmesi ve lizisidir. Başlamak için, gal pozitif bir maya suşunun hücreler

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Burada, mayada SNX-BAR heterodimerlerinin ifade, saflaştırma ve lipozom bağlanması için bir iş akışı salıyoruz.

Tomurcuklanan Maya SNX-BAR Heterodimers İfade, Arınma ve Lipozom Bağlayıcı

Biz bozulma ve proteinlerin denatürasyonu en aza indirgeyen bir kriyojenik dondurucu değirmen kullanarak maya veya diğer hücrelerden tüm hücre özleri hazırlanması için güvenilir bir yöntem açıklar. Hücre ekstreleri fonksiyonel protein komplekslerinin saflaştırılması, proteomik analizler, ko-immünopresipite çalışmaları ve labile protein modifikasyonlarının saptanması için uygundur.

Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin tomurcuklanan maya hücrelerinden protein ekstraksiyonu ve saflaştırma yöntemini. Bu protokol, protein etkileşimlerini ve post-translasyonel modifikasyonları koruyarak biyokimya ve proteomik araştırmaları için güvenilir sonuçlar sağlar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet