Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Bu prosedürün genel amacı, doğal yapıyı, fonksiyon etkileşimlerini ve translasyon sonrası modifikasyonları korurken maya proteinlerini ekstrakte etmektir. Bu, ilgilenilen proteinin ekspresyonunu indüklemek için ilk büyüyen hücreler tarafından gerçekleştirilir. Daha sonra, hasat edilen maya hücreleri, proteinleri çıkarmak için uygun bir tampon içinde homojenize edilir.

Daha sonra ilgilenilen proteinler, bir reçine afinitesi kullanılarak arıtılmış tam hücre ekstraktından saflaştırılır. Prosedürün son adımı, daha ileri analiz veya sonraki uygulamalar için saflaştırılmış proteinleri afinite reçinesinden uzaklaştırmaktır. Sonuç olarak, western blot analizine dayalı olarak protein saflaştırma modifikasyonlarını ve etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Prosedürü göstermek, son birkaç yılını laboratuvarımda lisans araştırmacısı olarak geçiren William ve Mary mezunu Eva'nın Ky'si olacak. Boncuk boncuklamanın diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, protein fonksiyon etkileşimlerini ve translasyon sonrası modifikasyonları koruyan koşullar altında birden fazla numunenin hızlı işlenmesi ve parçalanmasıdır. Bir gal pozitif maya suşunun hücrelerini, bir galaktozla indüklenebilir altı kodlayan bir plazmid ile dönüştürmeye başlamak için, tercih ettiği etiketli protein, transformatörleri %2 sükroz içeren SD urasil gibi beş mililitre uygun seçici ortamda aşılar ve gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi gün rotasyonla gece boyunca kültürü seçici ortamda %2 sükroz ile 33 mililitrelik bir nihai hacme seyreltin, böylece optik yoğunluk 600'de olacak şekilde nanometre 0.3 ölçer, 30 santigrat derece ve 150 RPM'de çalkalama inkübatöründe büyür.

Kültür, 0.8 ila 1.5 arasında bir OD 600'e ulaştığında, 30 santigrat derecede çalkalama inkübatörüne yerleştirilen% 2 galaktozlu bir XYEP'in nihai konsantrasyonu için% 6 galaktozlu 17 mililitre üç XYEP ekleyerek istenen proteinin ekspresyonunu indükleyin. İndüklenmiş kültür santrifüjünün OD 600'ünü dört santigrat derecede 5.000 RPM'de beş dakika boyunca yaklaşık 150 ila 200 OD 600 birim hücreyi ölçtükten sonra, daha sonra hücre damağını yeniden askıya almak ve hücreleri 15'te bir dakika santrifüjlemek için iki mililitrelik vidalı kapaklı tüpe aktarmak için bir x proteaz inhibitör kokteyli ile bir mililitre buz gibi soğuk bir XPBS kullanın, 000 RPM ve dört santigrat derece. Süpernatan çıtçıtını boşalttıktan sonra, hücre peletini sıvı nitrojen içinde donmuş hücre peletine dondurun.

200 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk ve 500 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutmak. Dört santigrat derecede kısa bir süre yukarı ve aşağı pipetlemek için ucu kesik olan bir pipet ucu kullanın.

Hücre tüplerini boncuk değirmeni denge kilidine yerleştirin ve makineyi üreticinin talimatlarına göre 20 saniye boyunca saniyede 5.5 metre hızla çalıştırın. Ardından tüpleri bir dakika boyunca sulu buzun üzerine yerleştirin. Ekstrakte edilen protein santrifüjünü dört santigrat derecede 15.000 RPM'de 15 dakika boyunca temizlemek için toplam altı kez tekrarlayın.

Daha sonra, karıştırmak için 800 mikrolitre% 20 trikloroasetik asit veya TCA girdabına karşılık gelen iki OD 600 birim hücreye karşılık gelen western blot ve WCE için tüm hücre ekstraktının veya WCE'nin bir örneğini hazırlamak için. 50 ila 100 mikrolitre afinite reçinesinde bir berrak WCE örneğini yeni bir mikro santrifüj tüpüne saflaştırmak için, bir mililitre yıkama tamponu ekleyerek reçineyi yıkayın ve dengeleyin ve reçine yeniden süspanse olana kadar yukarıdan aşağıya ters çevirin. 5.000 RPM ve dört santigrat derecede bir dakika döndürdükten sonra, yıkanmış boncuklara 100 ila 200 mikrolitre temizlenmiş lizatta afinite saflaştırması için proteini bağlamak üzere süpernatanı aspire edin ve toplam hacmi bir mililitreye getirmek için lizis tamponu kullanın.

İki ila beş saat boyunca dört santigrat derecede mutasyon veya sallanma ile kuluçkaya yatırın. Kalan berrak WCE'nin alikotlarını dondurmak için sıvı nitrojen kullanın ve lizat pancarı çözeltisi buz üzerinde WCE Western blot numunesi için inkübe edilirken daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dört santigrat derecede 15.000 RPM'de iki buçuk dakika döndürdükten sonra, peleti tutmaya özen göstererek süpernatanı boşaltın, pelete 800 mikrolitre %2 TCA ekleyin ve iki buçuk dakikalık dönüşü tekrarlamadan önce tüpü girdaplayın.

Süpernatanı dikkatlice boşalttıktan sonra, numuneyi inkübe etmeden önce peleti çözmek için 100 mikrolitre TCA numune tamponu ve girdap ekleyin. 100 santigrat derecelik bir ısı bloğunda iki ila beş dakika boyunca, pelet kalıntılarını tamamen çözmek için ikinci kez sürer, bu da kullanıma hazır olana kadar çözülmesi ve eksi 80 santigrat derecede saklanması zor olabilir. Lizat boncuk numunesi inkübe edildikten sonra, bir dakika boyunca 5.000 RPM ve dört santigrat derecede döndürüldükten sonra, proteinleri elüte etmek için reçineyi beş kez yıkamak için yıkama tamponu kullanın.

Reçine mutatına dört santigrat derecede beş dakika boyunca 150 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. 5.000 RPM ve dört santigrat derecede bir dakika döndürün ve süpernatanı yeni bir tüpte saklayın. Son olarak, iki mikrolitre BME ila 25 mikrolitre UD protein örneği ile 25 mikrolitre iki x lityum moleküler sülfat numune tamponunda western blot için bir numune hazırlamak için.

Bu şekilde gösterildiği gibi, maya hücrelerinden çok çeşitli proteinler tekrarlanabilir şekilde ekstrakte edilebilir. Bir dizi moleküler ağırlıktaki ayrık bantlar, yüksek kaliteli protein ekstraktlarının göstergesidir. Ekstraktların kalitesi, spesifik epitop etiketli proteinler için western blotlama ile doğrulanabilir.

İşte aşırı eksprese edilen V için temsili bir sonuç: Beş etiketli Sumo Ligase, yaklaşık 120 kilodaltonda göç eden bir sonuçtur. Genel olarak, kısmen bozulmuş proteinler, beklenen ağırlığın altında birden fazla parça olarak çalışır, ancak burada sadece tam uzunlukta protein gözlenir. Ek olarak, belirli bir proteinin yüksek moleküler ağırlıklı ilaveleri, translasyon sonrası modifikasyonları gösterebilir.

Örneğin, burada eksprese edilen sumo ile ilgili S bir delta dört 40 ve tam uzunlukta SIS bir üzerinde laktoz görebilirsiniz. Bu Western blot'ta gösterildiği gibi, endojen olarak eksprese edilen S bir üzerinde modifikasyonlar da korunabilir. Bu şekil, iki nükleer zenginleştirilmiş protein SLX beş ve CS bir delta dört 40'ın ws'mizden başarıyla saflaştırıldığını göstermektedir.

Özellikle, altı tıslama etiketli bir protein, hem doğal hem de denatüre edici koşullar altında W'S'den afinite saflaştırılabilir. Buna karşılık, SLX 5G ST ve CS bir delta dört 40 hektar, altı tıslama epitopundan yoksundur, ancak doğal koşullar altında hala metal afinite reçinesi ile ole duyarlı bir şekilde etkileşime girer. CIS bir ve daha az ölçüde SLX beş'in metal afinite reçinesini metal koordinasyon halkası alanı aracılığıyla bağlayabildiğini öneriyoruz.

Bildiğimiz kadarıyla, bu özel fenomen henüz bildirilmemiş olsa da, kole toksini B alt biriminin, doğal histamin kalıntılarının aracılık ettiği bir şekilde Nicola afinite reçinesini bağladığı benzer bir durum tanımlanmıştır. Bu gözlem, WCER'deki proteinlerin, en azından kısmen, protein fonksiyonunun incelenmesi için doğal olarak katlandığını göstermektedir. Protein komplekslerinin tüm hücre ekstraktlarında bozulmadan kaldığını göstermek önemlidir.

Temsili bir veri, CS bir, delta dört, 40 SLX, beş ve P GK'nin, yükleme kontrolü olarak görev yapan bir sitozolik proteinin WS cis bir'de bulunduğunu ortaya koydu. Delta four 40, metal afinite reçinelerine doğal olarak bağlanma kabiliyetine bağlı olarak bu ekstraktlardan saflaştırıldı. Ek olarak, maya hücrelerinde SLX beş ve SIS bir birlikte eksprese edildiğinde, EIT'lerdeki SLX beş seviyeleri artmıştır ve bu da SLX beşin SIS ile etkileşime girme olasılığını artırmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, maya proteinlerini doğal koşullar altında ekstrakte etmek, saflaştırmak ve görselleştirmek için maya hücrelerinin nasıl büyütüleceğini ve işleneceğini iyi anlamış olmalısınız.