Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Bu prosedürün genel amacı, doğal yapı fonksiyon etkileşimlerini ve translasyon sonrası modifikasyonları koruyarak maya proteinlerini ekstrakte etmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili proteinin ekspresyonunu indüklemek için hücrelerin büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hasat edilen maya hücreleri proteinleri ekstrakte etmek için uygun bir tampon çözelti içinde homojenize edilir.

Ardından, ilgilenilen proteinler bir afinite reçinesi kullanılarak berraklaştırılmış tüm hücre özütünden saflaştırılır. Prosedürün son adımı, saflaştırılan proteinlerin ileri analizler veya sonraki uygulamalar için afinite reçinesinden elüe edilmesidir. Nihayetinde, western blot analizi temelinde protein saflaştırma modifikasyonlarını ve etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Prosedürü, laboratuvarımda lisans araştırmacısı olarak son birkaç yılını geçiren bir William and Mary mezunu olan Eva's Ky uygulamalı olarak gösterecek. Boncukla parçalama yönteminin diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein fonksiyon etkileşimlerini vele çeviri sonrası modifikasyonları koruyan koşullar altında çok sayıda örneğin hızla işlenmesi ve lizisidir. Başlamak için, gal pozitif bir maya suşunun hücrelerini, galaktozla indüklenebilir altı his-etiketli seçili bir proteini kodlayan bir plazmit ile transforme edin; transformantları %2 sükroz içeren SD urasil gibi 5 ml uygun seçici besiyerine ekleyin ve 30 °C'de rotasyonla gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyunca büyütülen kültürü, 600 nm'deki optik yoğunluk 0,3 olacak şekilde %2 sükroz içeren seçici besiyerinde 33 ml nihai hacme seyrelterek 30 °C'de ve 150 RPM'de çalkalamalı inkübatörde büyütün.

Kültür OD 600 değeri 0,8 ile 1,5 arasına ulaştığında, final konsantrasyonu 1X EP ile %2 galaktoz olacak şekilde %6 galaktoz içeren 3X YEP'den 17 mililitre ekleyerek istenen proteinin ekspresyonunu indükleyin ve 30 °C'deki çalkalamalı inkübatörde beş ila altı saat daha bekletin. İndüklenmiş kültürün OD 600 değerini ölçtükten sonra, yaklaşık 150 ila 200 OD 600 birim hücreyi 4 °C'de 5.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin; ardından hücre peletini yeniden süspand etmek için 1 ml buz gibi soğuk 1X PBS ve 1X proteaz inhibitör kokteyli kullanın ve bunu 2 ml'lik vidalı kapaklı bir santrifüj tüpüne aktarın; hücreleri 4 °C'de 15.000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dekante ettikten sonra, hücre peletini sıvı azot içinde şok dondurarak dondurulmuş hücre peleti elde edin.

200 µL asitle yıkanmış cam boncuk ve 500 µL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun. Ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak 4 °C'de kısa süreliğine yukarı-aşağı pipetleme yapın.

Hücre tüplerini boncuk değirmeni terazi kilidine yerleştirin ve makineyi üretici talimatlarına uygun olarak saniyede 5,5 metre hızda 20 saniye boyunca çalıştırın. Ardından tüpleri bir dakika boyunca buzlu kar karışımına yerleştirin. Ekstrakt proteinleri temizlemek için bu işlemi toplam altı kez tekrarlayın ve ardından 4 °C'de 15.000 RPM hızda 15 dakika boyunca santrifüj edin.

Ardından, western blot için tüm hücre ekstraktı (WCE) örneği hazırlamak amacıyla, iki OD 600 birim hücreye karşılık gelen WCE'ye 800 µL %20 trikloroasetik asit (TCA) ekleyin ve karıştırmak için vortekslleyin. Berrak WCE örneğini saflaştırmak için 50 ila 100 µL afinite rezinini yeni bir mikro santrifüj tüpüne alın; bir mL yıkama tamponu ekleyerek rezini yıkayın ve dengeleyin, ardından rezin yeniden süspanse olana kadar tüpü alt üst ederek karıştırın. 4 °C'de 5.000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjledikten sonra süpernatantı aspire edin; afinite saflaştırması için proteini bağlamak amacıyla 100 ila 200 µL berrak lizatı yıkanmış boncuklara ekleyin ve toplam hacmi bir mL'ye tamamlamak için lizis tamponu kullanın.

Dört derece Celsius'ta iki ila beş saat boyunca mutasyonla veya sallanarak inkübe edin. Lizat beet çözeltisi, WCE Western blot örneği için buz üzerinde inkübe edilirken, geri kalan berrak WCE alikotlarını sıvı azot kullanarak şok dondurun ve daha sonra kullanana kadar eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Dört derece Celsius'ta 15.000 RPM'de iki buçuk dakika santrifüjlemeden sonra, peleti tutmaya dikkat ederek süpernatantı dökün, pelete 800 mikrolitre %2 TCA ekleyin ve iki buçuk dakikalık santrifüj işlemini tekrarlamadan önce tüpü vorteksleyin.

Süpernatant dikkatlice dekante edildikten sonra, numuneyi inkübe etmeden önce peleti çözmek için 100 µL TCA örnek tamponu ekleyin ve vorteksleyin. Pelet kalıntılarının tamamen çözülmesi için 100 °C'lik bir ısıtma bloğunda iki ila beş dakika boyunca ikinci kez inkübasyon yapın; bu kalıntıların çözülmesi zor olabilir. Hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Lizat boncuklu numune inkübe edildikten sonra, 5.000 RPM ve 4 °C'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve proteinleri elüye etmek için reçineyi beş kez yıkama tamponu ile yıkayın.

Reçineye 150 µL elüsyon tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin. 4 °C'de 5.000 RPM hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarıp saklayın. Son olarak, western blot örneği hazırlamak için 25 µL UD protein örneğine, 2 µL BME içeren 25 µL 2x lityum dodesil sülfat örnek tamponu ekleyin.

Bu şekilde gösterildiği üzere, maya hücrelerinden geniş bir protein yelpazesi tekrarlanabilir şekilde ekstrakte edilebilir. Farklı moleküler ağırlıklarda görülen belirgin bantlar, yüksek kaliteli protein ekstraktlarının göstergesidir. Ekstraktların kalitesi, spesifik epitop etiketli proteinler için western blotting ile doğrulanabilir.

Galaktoz ile aşırı ifade edilen V beş etiketli Sumo Ligaz için temsili sonuç, yaklaşık 120 kilodaltonda göç eden banttır. Genellikle, kısmen degrade olmuş proteinler beklenen ağırlığın altında birden fazla fragman olarak görülür, ancak burada yalnızca tam uzunluktaki protein gözlemlenmiştir. Ayrıca, belirli bir proteinin yüksek moleküler ağırlıklı ekleri, post-translasyonel modifikasyonlara işaret edebilir.

Örneğin, burada laktozla aşırı eksprese edilmiş sumo ile ilişkili S1 delta 440 ve tam uzunluktaki SIS1'i görebilirsiniz. Bu Western blot'ta gösterildiği üzere, modifikasyonlar endojen olarak eksprese edilen S1 üzerinde de korunabilmektedir. Bu şekil, nükleusta zenginleşen iki protein olan SLX5 ve CS1 delta 440'ın ws'mizden başarıyla saflaştırıldığını göstermektedir.

Özellikle, altı histidin etiketli bir protein, hem doğal hem de denatüre koşullar altında W'S'den afinite yöntemiyle saflaştırılabilir. Buna karşılık, SLX 5G ST ve CS one delta four 40 ha altı histidin epitopuna sahip değildir, ancak doğal koşullar altında metal afinite reçinesi ile hala nikel duyarlı bir şekilde etkileşime girerler. CIS one'ın ve daha az ölçüde SLX five'ın, metal koordinasyon halka domainleri aracılığıyla metal afinite reçinesine bağlanabildiğini öne sürüyoruz.

Bildiğimiz kadarıyla, bu özel fenomen henüz rapor edilmemiş olsa da, kolera toksini B alt biriminin doğal histidin kalıntıları aracılığıyla Ni-NTA afinite rezinine bağlandığı benzer bir durum tanımlanmıştır. Bu gözlem, WCER içindeki proteinlerin, en azından kısmen, protein fonksiyonu çalışmalarına uygun şekilde doğal olarak katlandığını göstermektedir. Protein komplekslerinin tüm hücre ekstrelerinde bozulmadan kaldığını göstermek önemlidir.

Temsili bir veri, WS cis one içerisinde CS one delta dört 40, SLX beş ve yükleme kontrolü olarak hizmet eden sitozolik bir protein olan P GK bir'in mevcut olduğunu ortaya koymuştur. Delta dört 40, metal afinite rezinlerine bağlanma içsel yeteneğine dayanarak bu ekstraktlardan saflaştırılmıştır. Ek olarak, SLX beş ve SIS one maya hücrelerinde birlikte eksprese edildiğinde, EIT'lerdeki SLX beş seviyeleri artmış ve bu durum SLX beş'in SIS one ile etkileşime girebileceği olasılığını artırmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, mayaları doğal koşullar altında proteinlerini ekstrakte etmek, saflaştırmak ve görselleştirmek amacıyla nasıl büyütüp işleyeceğiniz konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.