Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Bu protokol, kontrollü protein ekspresyonuna izin veren düzenlenebilir bir promotör kullanır. Bu deneyde, bir metiyonin bastırılabilir promotöründen N iki alanını ifade eden yüksek kopyalı iki mikronluk bir plazmit kullanıyoruz. Yabani tip maya hücreleri bununla dönüştürülür.

Plazmit ve transformantlar, uol içermeyen plakalarda seçilir. Bir gecede büyümeden sonra. Seçici ortamda, hücreler kortizol aracılı büyüme ile senkronize edilmez. Tutuklama.

Son olarak, zaman kursu deneyi sırasında hücrelerin metiyonin içermeyen ortama aktarılmasıyla ekspresyon indüklenir. Protein konsantrasyonu, mikroskopi ile western blotlama ve morfolojik fenotip gelişimi ile izlenir. Merhaba, ben Claudia, Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndenim.

Ben alar'da de Bari Muji'yim ve ayrıca AL laboratuvarındayım. Bugün size, vücut indüksiyonundaki protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak morfolojik bir fenotipin gelişiminin analizi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, iki eksik endositik adaptif proteinin N iki alanının aşırı ekspresyonu üzerine gözlemlenen bir hücre bölünmesi fenotipinin morfolojik ve moleküler yönlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu protokol, ilgilendiğiniz proteini ifade edecek bir maya türünün inşası ile başlar. Olgumuzda, yabani tip maya suşu W 3 0 3'ü, metiyonin baskılanabilir promotörün kontrolü altında n'inci iki içeren yüksek kopya plazma DNA'sı ile dönüştürdük, iki milimolar metiyonin baskılayıcı 25 promotör aktivitesini karşıladı.

Metiyonin içermeyen ortam maksimum ekspresyona izin verirken, yakın zamanda dönüştürülmüş hücreleri içeren bir plakadan altı koloni seçin ve 50 mililitre seçici ortam içinde 0.2 milimolar metiyonin ile konik bir şişede aşılayın, gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi sabah 200 RPM'de çalkalayın. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçerek hücre yoğunluğunu tahmin edin. Mililitre hücre başına 20 OD 600 nanometre eşdeğerini steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjleme ile hasat edin.

DMSO'da mililitre başına bir miligramlık bir stoktan hücre döngüsü aole'yi mililitre başına 15 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona senkronize etmek için girdaplama yoluyla hücreleri YPD ortamında yeniden askıya alın. 200 RPM'de çalkalayarak 30 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Dört saat sonra, mitozda tutuklanan hücrelerin yüzdesini kontrol edin.

Mikroskop altında görüntüleyerek ve eşit büyüklükte tomurcuklara sahip hücre sayısını sayarak bir sonraki adıma geçin. Sadece tutuklama %90'dan büyükseHücreleri beş dakika boyunca 2200 RPM'de santrifüjleme ile hasat edin. Buz gibi soğuk suyla üç yıkamadan sonra, resus, peleti mililitre başına yaklaşık 0.5 OD 600 nanometre hücre yoğunluğunda metiyonin içermeyen seçici ortamda askıya alın.

Hücre hacminin yarısını yeni bir steril tüpe aktarın ve 0.2 milimolar nihai konsantrasyona metiyonin ekleyin. Bu, bazal protein ekspresyonu seviyelerine bağlı etkiler için bir kontrol görevi görecektir. Her iki kültürü de 30 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

Hücreler, her seferinde altı saat boyunca her saat fenotip gelişimi için analiz edilir. Her kültürün bir mililitre hücre süspansiyonunu steril bir mikro füj tüpüne nokta transferi yapın ve hücreleri santrifüjleme ile hasat edin, süpernatanı aspire edin ve peleti 70 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra steril suda mililitre başına bir miligramlık bir stoktan 30 mikrolitre metilen mavisi ekleyin.

Ardından, bu süspansiyonun yaklaşık altı mikrolitresini temiz bir cam slayt üzerine pipetleyin ve damlanın üzerine bir kapak kayması. Cam arayüzler arasında ince, homojen bir hücre tabakası oluşturmak için kapak kızağına hafifçe bastırın. Kapak fişini dokuz çeyreğe bölün ve her kadranda üç görüntü çekin.

Doğru nicelemeye izin vermek için alan başına hücre sayısı 30 hücreden büyük olmamalıdır. İncelenen fenotipi gösteren, bu örnekte birbirinden ayrılamayan uzun ve/veya birleştirilmiş tomurcuklara sahip tomurcuklanan maya hücreleri olan hücrelerin sayısını sayın. Ayrıca, n'de indüklenen hücre bölünmesi kusurundan bu yana mavi renkleriyle tanımlanan ölü hücrelerin sayısını da sayıyoruz.

İki aşırı ekspresyon, her seferinde fenotipe özgü kusurları görselleştirmek için hücre ölümüne yol açar. Steril bir mikro füj tüpünde bir mililitre kültürü işaret edin ve hücreleri santrifüjleme reus ile hasat edin. Hücre peletini mililitre başına bir miligramın 100 mikrolitresinde, steril suda kalor beyazı çözeltisinde askıya alın ve karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Kalsiör beyazı ile boyama, e hücre duvarının görselleştirilmesini sağlar. Peleti bir XPBS ile üç kez yıkayın. Son peleti 100 mikrolitre PBS'de askıya alıyoruz.

Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve hücre duvarını görselleştirmek için UV optiklerini kullanarak 100 x büyütmede görüntüler elde edin. GFP etiketli septini görselleştirmek için bir FS E filtresi kullanarak görüntü elde edin, Kapak kaymasını dokuz çeyreğe bölerek ve TimeLapse videosunu saymak için kadran başına üç görüntü alarak daha önce gösterilen yöntemi kullanarak hücre duvarı kusurları ve septin mis lokalizasyonu olan hücrelerin yüzdesini ölçün. Tek maya hücrelerinin mikroskobu, bir agros yatağı yapmak için ortama gömülü agros yatakları gerektirir.

İlk olarak, %70 alkol içeren içbükey bir çöküntüye sahip bir cam slaytı temizleyin ve slayt havayla kururken kurumaya bırakın. Agros tamamen hızlı bir şekilde eriyene kadar bir mikrodalgada metiyonin içermeyen beş mililitre seçici ortamda 0.06 gram agros kaynatın. Slaytta ortam içeren agroslardan 200 mikrolitre pipetleyin.

Üzerine başka bir temiz cam kaydırağı bastırın ve ters çevirin, altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Jel katılaştığında, yüzeylerini her zaman paralel tutarak üstteki sürgüyü çöküntü kaydırağından düzgün bir şekilde uzaklaştırın. Bu, agros yatağının yüzeyinin çöküntü slaytının yüzeyi ile aynı hizada olmasını sağlar.

Agros yatağını çevreleyen sürgü bölgesini hassas bir doku ile temizleyin. Slayt artık dört saate eşit bir sürede kullanıma hazırdır. Kültürden bir mililitre hücreyi steril bir mikro füj tüpüne aktarın ve santrifüjleme ile hasat edin.

Süpernatanı aspire edin ve hücreleri metiyonin içermeyen 100 mikrolitre taze seçici ortamda yeniden süspanse edin. Kapak fişinin kenarlarına vazelin sürün. Ardından, agros yatağının ortasına bir damla hücre süspansiyonu yerleştirin ve üzerine bir örtü kızağını hafifçe bastırarak eşit şekilde yayın.

Kapak kaymasının kenarlarını kapatın ve kenarlarını oje ile kaplayarak konumunu sabitleyin. Oje kuruduktan sonra, slaytı bir mikroskobun ısıtılmış bir aşamasına yerleştirin. Alan zamanla kalabalıklaşacağı için yeterli aralıklarla 200'dan fazla hücre içermeyen bir alan seçmek için Zeiss Axio kamera, MRM monokrom dijital kamera ile donatılmış bir Zeiss Axio 10 M mikroskobu kullanıyoruz.

Hücreler bölünürken, yaklaşık beş saat boyunca her beş dakikada bir alanın görüntüsünü alın. Odağın tekrar tekrar ayarlanmasını önlemek için. Görüntü alma yazılımını, her zaman noktasında otomatik olarak birkaç Zack görüntüsü alacak şekilde programlıyoruz.

Hücreler için yeterli ısıyı sağlamak amacıyla filmin montajı için en iyi odağa sahip görüntü daha sonra seçilecektir, mikroskobun iletilen beyaz ışığının tüm görüntüleme süresi boyunca açık bırakılmasıyla sağlanan ısıtılmış aşamalara ek olarak harici bir ısı kaynağı fenotip regresyonu Image J yazılımı kullanılarak görüntülerin bir filme birleştirilmesiyle incelenebilir. Burada, ilgilendiğimiz proteini aşırı ifade etmenin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Ninci iki.

İlk olarak, n'inci ikinin protein ekspresyonu. Deneyin seyri boyunca, HA n'yi eksprese eden hücrelerden lizatlar belirlendi, ikincisi, 0.2 milimolar metiyonin varlığında büyütülen immünoblo blot hücrelerinin minimal protein ekspresyonuna sahip olduğu gibi, bir monoklonal anti HA antikoru kullanılarak western blotlama ile analiz edildi. Bununla birlikte, metiyonin içermeyen ortamda yetiştirilen hücreler, deneyin süresi boyunca S iki konsantrasyonunda tutarlı bir artış gösterir.

Daha sonra, altı saat boyunca metiyonin varlığında veya yokluğunda büyütülen hücreler, düşük n'inci iki konsantrasyon sadece bir hücre bölünmesi fenotipini veya hücre ölümünü indükleyemediğinden analiz edildi. Hücrelerin düşük bir yüzdesi, metilen mavisi ile boyandıktan sonra mavi renkleriyle gösterildiği gibi ölüdür. Aynı şekilde, hücre başına düşen çekirdek sayısı, hücre duvarı ve septin organizasyonu beklendiği gibi normaldir.

Buna karşılık, M'nin aşırı ekspresyonu, metilen mavisi ile boyandığında mavi rengi koruyan uzun bağlı uzun tomurcuk zincirleri tarafından gösterildiği gibi, büyük bir hücre bölünmesi kusuruna ve hücre ölümüne yol açar. Fenotipik hücrelerin çoğu, DPI boyama ile belirtildiği gibi çok çekirdeklidir. Kalsior beyaz lekelenme, anormal hücre duvarı yamalarının birikimini gösterir.

Ek olarak, septin büyük ölçüde lokalize ve düzensizdir. Zamanın bir fonksiyonu olarak fenotip nicelemesi, açık dairelerin sıfır milimolar metiyonini ve kapalı dairelerin 0.2 milimolar metiyonini temsil ettiği bu grafikte gösterilmiştir. Burada, hücrelerde zamanla n'inci iki konsantrasyon oluştukça, hücre bölünmesi fenotipini gösteren hücrelerin yüzdesinin de arttığını görüyoruz.

0.2'de büyüyen kontrol hücreleri. Milli metiyonin, fenotip gelişiminin, hücre kültürü koşulları nedeniyle değil, yüksek protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olduğunu göstermektedir. Son olarak, n'inci iki aşırı ekspresyon üzerine fenotip gelişimi, hızlandırılmış video mikroskobu ile yakalanır.

Dört saatlik n'den sonra, iki aşırı ekspresyon hücresi hafif bir morfolojik hücre bölünmesi fenotipi gösterir. Film ilerledikçe, çok uzun tomurcuklara yol açan anormal ve uzun süreli apikal tomurcuk büyümesi dönemleri görüyoruz. Ayrıca, bir hücre ayrılması olayı gerçekleşmeden önce yeni tomurcuk ortaya çıkma olaylarını da görüyoruz.

Ek olarak, anne hücresinin çeşitli bölgelerinden tomurcukların çıktığı ve bir dalın ortaya çıkmasına neden olduğu gözlenir. Tomurcuklanma listesindeki protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak morfolojik bir fenotipin gelişimini nasıl karakterize edeceğinizi ve analiz edeceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürü uygulayarak, daha yüksek hızlar hücrelere zarar verebileceğinden, hücreleri önerilen santrifüjleme hızlarında okşamayı unutmamak önemlidir.

Hafif doğu hücreleri için toksik oldukları için görüntülemeden hemen önce metilen mavisi ve klorür eklemeyi unutmamak da önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.