Name: Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de protein konsantrasyonuna bağlı morfolojik fenotip gelişimini analiz etme yöntemini. Bu protokol düzenlenebilir promotör kullanarak kontrollü protein ekspresyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Brian G. Coon ve Claudia B. Hanna yararlı tartışmalar ve destek için teşekkür ederiz. Bu proje, Dep start-up fonları tarafından desteklenen. Biyolojik Bilimler, Purdue Üniversitesi R. Claudio Aguilar ve R. Claudio Aguilar Purdue Kanser Merkezi aracılığıyla bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu.

A. Hücre Kültürü ve Protein İndüksiyon Bu bölümde, hücre kültürü, maya hücreleri bir ayarlanabilir organizatörü protein ifade indüksiyon takip koşulları, hücre döngüsü Nocodazole ile senkronizasyonu, açıklamaktadır. <ol><li> Yaban tip maya suşu W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) kontrolü altında ilgi bizim gen (ENTH2) içeren yüksek kopyasını (2μ) plazmid DNA ile dönüştürdü. metionin repressible organizatörü (MET25). Metionin 2mm metionin yoksun medya maksimum ifade sağlar promotor aktivitesi bastırmak için yeterli olacaktır. Bu nedenle, bir dizi metionin konsantrasyonları istenilen düzeyde protein ifade etmek için kullanılabilir. 1 W303 hücrelerinde plazmid DNA Dönüşüm standart prosedürlere göre LiAc-TE yöntemi kullanılarak yapılır. 2 Not: Bu deney, sadece arka plan düzeyde protein ekspresyonunu sağlamak için metionin 2mm varlığı gecede büyüyen hücreleri tarafından yapılmalıdır . Ertesi sabah, protein ekspresyonu metionin hemen sonra hücre döngüsü senkronizasyonu (yaklaşık 4 saat) yoksun medya hücreleri resuspending tarafından uyarılan olmalıdır. Ancak, tüm belirtilerin analizi için zaman ders verme ENTH2 bağımlı hücre bölünmesi fenotipi (genellikle protein indüksiyon 3 4-6h sonra) ENTH2 önemli bir konsantrasyon hücreleri inşa etti sonra tetiklenen olduğunu bulduk çok uzun fenotip (en azından 16h). Biz metionin 0.2mm varlığı gecede büyüyen hücrelerin morfolojik fenotip bastıran ama metionin yoksun medya transfer fenotip-indükleyici seviyeleri hızla artabilir kritik altı kütle protein konsantrasyonu sağlar bulduk. Bu zaman görece kısa bir süre içinde hücre bölünmesi kusurun ağır belirtileri ayrıntılı analizi izin verir . Biz bu nedenle, deneyci bir durumda ayrı ayrı fenotip indüksiyonu için alt eşik metionin konsantrasyonunu belirlemek öneririz. </li><li> Seçici medya metionin 0.2mm standart, steril teknikleri kullanılarak steril bir erlene 50 ml son dönüştürülmüş hücreleri ve inokülasyon içeren bir tabak altı koloniler seçin. 30 gece boyunca inkübe ° 200 rpm&#39;de sallayarak ile C (standart maya kültürü koşulları hakkında daha fazla bilgi için, bkz. Ref 4) </li><li> 600Nm kültürün optik yoğunluk ölçerek Ertesi sabah, hücre yoğunluğu tahmin. Oda sıcaklığında 5 dk 2200 rpm&#39;de dönüyor hücrelerin 20 OD 600Nm eşdeğer steril bir santrifüj tüpüne ve hasat içine aktarın. </li><li> 0,4 OD 600Nm / ml &#39;lik bir konsantrasyon içinde süspanse edin hücreleri YPD ve DMSO 1mg/ml, bir hisse senedi, 15μg/ml son bir konsantrasyon Nocodazole eklemek. 200rpm az titreme ile 30 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. Not: alfa-faktörü kullanarak G0 aşamasında ya da hidroksiüre kullanarak G1-S aşamasında tutuklama dahil olmak üzere alternatif tutuklama yöntemleri kullanılabilir. Mitoz tutuklanmaktan Nocodazole kullanarak amaçları için yeterince basit ve etkili olduğunu buldular. </li><li> 4 saat sonra, eşit büyüklükte tomurcukları olan hücreleri mikroskop altında inceleyen sayısını sayma mitoz tutuklandı hücre yüzdesi kontrol edin. Tutuklama% 90 daha fazla ise, sonraki adıma geçin. Mitotik tutuklanması istenen yüzdesi elde edilene kadar Aksi takdirde, Nocodazole hücreler korumak. </li><li> Hasat hücreler santrifüj 2200 5min rpm ve buz gibi su ile üç defa yıkamak. En son yıkama aşamasından sonra, seçici besiyerleri ~ 0.5 OD 600Nm / ml bir hücre yoğunluğu metionin eksik pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Yarım hücre hacmi yeni bir steril tüpe aktarın ve nihai bir 0.2mm konsantrasyonu metionin eklemek. Bu etkileri için protein ekspresyonu bazal düzeylere nedeniyle kontrol olarak görev yapacak. Bu, (zaman = 0h) deney noktası ilk işaretler. 6h hücreleri her saat başı analiz edin. </li></ol> Fenotip Geliştirme B. Analizi Not: Aşağıda açıklanan tüm analiz yöntemleri aynı anda yapılması gerekmez . Batı Blot protein ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi <ol><li> Her zaman noktada, 2200 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj kültür ve hasat 2 OD 600Nm hücrelerin benzerleri OD 600Nm ölçer. </li><li> 1ml steril su pelletini tekrar süspansiyon 1.5ml Eppendorf tüp transferi. Bir pelet almak için santrifüj tekrarlayın. Süpernatant aspire. </li><li> 50μl SDS-PAGE Laemmli örnek tamponu (50mm Tris, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol,% 2 oranında β-mercaptoethanol ve% 0.006 Bromophenol Mavi) pelletini tekrar. Asitle yıkanmış cam boncuklar (0.2-0.4 mikron çaplı) ve 1 dakika için vorteks 50μl ekleyin. </li><li> 95 ° C ısıya blo kaynatın tüplerck, 2 dakika 30 saniye boyunca tekrar vortex ve 5 dakika kaynatmaya devam edin. -20 ° C&#39;de protein örnek Freeze </li><li> Nitroselüloz membran üzerine% 12 SDS-PAGE jel, transfer protein örneklerinin çalıştırın ve Batı ilgi protein tespit etmek için uygun antikorlar ile blot gerçekleştirmek. Bu örnekte, 1:2000 dilüsyon (1XPBS,% 5 yağsız süt kuru dut-Tween fare anti-HA antikor (Covance, Princeton, NJ) ile inkübe ENTH etki alanları etiketli hemaglutinin (HA) varlığı prob ,% 0.1 Tween). HRP, dut-Tween, keçi 1:2500 titrede anti-fare sekonder antikoru (Pierce) etiketli oda sıcaklığında 1s membran üzerindeki birincil antikor bağlamak için izin verilir. Supersignal Batı Pico Chemiluminescent Yüzey HRP etiketli anti-fare antikor tespit etmek için kullanılır. </li><li> Dansitometrisi protein ekspresyon düzeyleri sayısal olmalıdır. </li></ol> Bu bölümde iki yöntem anlatılmaktadır artan protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak izleme fenotipi geliştirme. İlk yöntem hücre nüfus tabanlı bir tek hücre düzeyinde ikinci çalışmalar. Kantitasyonu, hücre bölünmesi fenotip ve hücre ölümü <ol><li> Her zaman noktada, 5 dakika 2200 rpm&#39;de santrifüj yoluyla, steril teknikleri ve hasat hücreleri kullanarak steril Eppendorf tüpüne 1 ml hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Süpernatantı aspire ve mavi 30μl Metilen steril su 1mg/ml bir stok takip 70μl medya pelet, tekrar süspansiyon haline getirin. Metilen mavisi, dolayısıyla ölü hücreler, mavi renk tarafından tespit edilebilir sitoplazmada indirgeyici bir ortamda renksiz olur, mavi bir hayati boya. </li><li> Pipet ~ 6μl temiz bir cam slayt bu süspansiyon ve açılan üzerinde lamel yerleştirin. Ince bir cam arayüzler arasındaki hücreler, düzgün bir tabaka oluşturur lamel yavaşça basınız. </li><li> 9 parçaya bölünür lamel Böl ve Şekil gösterilen kadran başına 3 fotoğraf çekmek. 2. Hücre / alan sayısı doğru kantifikasyon izin vermek için 30 hücre daha büyük olmalıdır. Hava kabarcıkları hazırlık zarar Her lamel önce yaklaşık 15 dakika boyunca görüntülenebilir. </li><li> Altında çalışma fenotip gösteren hücrelerin sayısını. ENTH2 aşırı ekspresyonu üzerine indüklenen hücre bölünmesi kusur, hücre ölümüne yol açan ve bu yüzden, biz de kendi mavi renk tarafından belirlenen ölü hücrelerin sayısını saymak. </li><li> Fenotipik hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. </li><li> Şekil gösterildiği gibi veri çizilir. 3. </li></ol> Fenotipe özgü kusurları floresan mikroskopi kullanılarak görselleştirilmesi Hücre bölünmesi arızalı hücreleri, ENTH2 aşırı ekspresyonu üzerine görüldüğü gibi, genellikle hücre duvarı defektleri ve septin mislocalization3 (GFP füzyon proteinleri olarak görüntülenebilmekte) ile karakterizedir. Maya hücre duvarı maya hücre duvarlarında kitin geri dönüşümsüz olarak bağlar Calcofluor Beyaz (CFW) ile boyanarak kolayca görüntülenebilmekte. <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 2200 rpm&#39;de santrifüj steril Eppendorf tüp ve hasat hücreleri kültür her zaman noktası, kısım 1 ml az. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle steril su ve inkübe 1mg/ml CFW çözüm 100μl hücre pelletini tekrar. </li><li> Santrifüj ve 1X PBS ile 3 kez yıkama Hasat hücreleri. </li><li> 100X büyütme 100μl 1X PBS pelet ve UV optik kullanarak mikroskop altında resim (hücre duvarı) ve FITC filtresi (GFP-septin) tekrar </li><li> B.2.1 bölümünde aşağıdaki adımları 4-6 hücre duvarı defekti ve septin mislocalization hücre yüzdesi niceliğini </li></ol> B.3. Tek hücre düzeyinde fenotip gelişimi Belirlenmesi: Time-lapse video mikroskopi. <ol><li> Bir bardak slayt içbükey bir depresyon ile% 70 alkol ile temizleyin ve kurumaya bırakın. </li><li> Agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada steril bir cam tüp içinde metionin eksik 5ml seçici medya 0.06g agaroz kaynatın. </li><li> Agaroz hızla pipet 200μl slayt depresyon medya içeren ve altında hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat, temiz bir cam üzerine başka bir slayt ters. </li><li> Jel katılaşır, yüzeyleri her zaman paralel tutarak, en sorunsuz uzak depresyon slayt slayt taşımak. Bu agaroz yatak yüzeyi depresyon slayt yüzeyi ile aynı hizada olmasını sağlar. Agaroz yatak çevresindeki hassas bir doku ile slayt bölgeyi temizleyin. Slayt artık kullanıma hazırdır. </li><li> Zamanda = 4 saat, oda sıcaklığında 5 dakika 2200 rpm&#39;de santrifüj steril Eppendorf tüp ve hasat kültür hücreleri transferi 1ml. Not: Bu daha sonraki bir zaman noktası, bu yüzden bu fenotip gelişimi garanti protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlamak için seçilecek tavsiye edilir . Pilot deneyler determin için gereklicase-by-case bazında e indüksiyon kez. </li><li> Metionin yoksun taze seçici medya 100μl supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. </li><li> Lamel kenarlarına vazelin uygulayın. Daha sonra agaroz yatak merkezinde hücre süspansiyonu bir damla koyun ve hafifçe üzerlerine lamel basarak eşit yaymak. </li><li> Vazelin ile lamel kenarlarında Seal ve oje ile kenarlarını kaplayan konumunu düzeltmek. Oje kuruyana kadar bekleyin. </li><li> Isıtılmış bir sahnede, mikroskop, slayt yerleştirin ve yeterince aralıklı en fazla 10 hücre içeren bir alan seçin. Hücre bölünmeleri, alan, zaman içinde kalabalık alacak. </li><li> Alanında ~ 5 saat boyunca her 5 dakikada bir görüntü çekin. Fenotip ilerlemesi ImageJ yazılımı (kullanarak bir film görüntüleri montaj tarafından incelenecektir <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri -2005</a> ) </li></ol> Not: Biz Zeiss Axiovert 200M mikroskop kullanımı, Zeiss Axiocam MRM monokrom dijital kamera ve Carl Zeiss Axiovision görüntü elde etme canlı hücre görüntüleme yazılımı (sürüm 4.4). Sıcaklık kontrolü Pecon Tempcontrol cihaz tarafından 37, 30 ° C&#39;de muhafaza ısıtılmış bir sahnede slaytlar koyarak elde edilir . Önlemek için tekrar tekrar odaklanmak yeniden ayarlayarak, otomatik olarak, her zaman noktada birkaç z yığın görüntüleri kazanmak ve daha sonra film montaj, en iyi odak görüntü seçebilirsiniz görüntü elde etme yazılım programına uygundur. Bazı görüntü elde etme yazılımlar zaman ders deneyler için otofokus seçeneği var. Bu, ne zaman kullanılabilir bu seçeneği kullanmak için uygundur. Vahşi tip maya hücreleri 30 en iyi büyümeye ° C dolayısıyla sıcaklık kontrolü kritik öneme sahiptir. Yeterli ısı sağlamak amacıyla, ısıtmalı aşamaya ek olarak harici bir ısı kaynağı sağlamak için yardımcı olur. Örneğin, görüntüleme süresi boyunca iletilen beyaz ışık mikroskop bırakın. Ayrıca agaroz yatak ve hücre sandviç hazırlarken hava kabarcıklarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Hava kabarcıkları arasına sıkışan zamanla ısıtıldığında genişler ve görüntülü alanında uzak hücreleri itmek eğilimindedir. Alanı içinde bireysel hücre pozisyonları sağlamak için de önemlidir, özellikle yeniden odaklama girişimleri sırasında, görüntüleme işlemi süresi boyunca kayda değer değişikliği yoktur . Görüntü sabitleme eklentileri film monte edildikten sonra ImageJ hücre konumundaki küçük değişiklikler düzeltmek için mevcuttur. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / kod / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol><li>Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22High+efficiency+transformation+with+lithium+acetate+in+Molecular+Genetics+of+Yeast%3A+A+Practical+Approach%22">High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).</li>
<li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Getting+started+with+yeast+in+Guide+to+Yeats+genetics+and+Molecular+Biology%22">Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</a>. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).</li>
</ol>

Bu protokol, protein aşırı ekspresyonu üzerine morfolojik bir fenotip (uygun hücre bölünmesi geçmesi mümkün maya hücresi) gelişimini izlemek anlatılmaktadır. Bu işlemi yaparken, daha hızlı ve belirsiz sonuçlar hücreleri zarar verebilir olarak tavsiye santrifüj hızda peletleme maya hücreleri hasat hatırlamak önemlidir. Metilen mavisi ve Calcofluor beyaz toksik olarak hemen önce görüntüleme hücreleri yaşamak için ilave edilmelidir. Bu işlem aynı zamanda kolayca hedef kontrollü bir organizatörü ifade edilir, protein baskı ...

<table><tbody><tr><td>Nokodazol</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Metilen Mavisi %1 (a/h)</td><td>Reaktif</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>Kalsoflor Beyaz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td>Vazelin</td><td>Reaktif</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

geliştirici maya protein konsantrasyonu bir işlev olarak morfolojik fenotip kalkınma analizi

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bu protokol bir proteinin aşırı ekspresyonu dayalı olmasına rağmen, protein ekspresyonu baskılanması bağlı morfolojik fenotipleri için kolayca adapte olabilir. Bizim laboratuvar endositik adaptör protein epsin sinyal özelliklerini inceleyerek ilgileniyor. Bu amaç için korunmuş fazla dile getirdiği baskın bir olumsuz yaklaşım kullanıldı<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) etki alanı endojen epsin-2 (Ent2 veya YLR206W) fonksiyonları ile müdahale edebilmek için. Biz iskele proteinler, septins bir ailenin mislocalization bağımlı bir hücre bölünmesi kusur yol açan vahşi tip hücrelerde Ent2 (ENTH2) ENTH etki bu aşırı ekspresyonu gözlemledi.

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gen silinmesi ve protein aşırı ekspresyonu, proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, ... analizine yönelik bir protokol tanımlıyoruz.

Bu protokol, kontrollü protein ekspresyonuna olanak tanıyan regüle edilebilir bir promotör kullanmaktadır. Bu deneyde, metiyonin ile baskılanabilen bir promotörden N iki domainini eksprese eden yüksek kopya sayılı iki mikron plazmid kullanıyoruz. Yaban tip maya hücreleri bununla transforme edilir.Plazmid ve transformantlar, uol içermeyen plaklarda seçilir. Gece boyu büyümenin ardından, seçici ortamdaki hücreler kortizol aracılı büyüme durdurması ile senkronize edilir.Son olarak, zaman seyri deneyi sırasında hücrelerin metiyonin içermeyen ortama aktarılmasıyla ekspresyon indüklenir. Protein konsantrasyonu western blotting ile, morfolojik fenotip gelişimi ise mikroskopi ile takip edilir. Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Claudia.Ben, AL laboratuvarındaki Bari Muji. Bugün size, vücut indüktünün protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak morfolojik fenotip gelişiminin analizi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, endositik adaptör protein absent two'nun N iki domaininin aşırı ekspresyonu üzerine gözlemlenen bir hücre bölünmesi fenotipinin morfolojik ve moleküler yönlerini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Bu protokol, ilgilendiğiniz proteini eksprese edecek bir maya suşunun oluşturulmasıyla başlar. Bizim durumumuzda, metiyonin ile baskılanabilen promotör kontrolü altındaki nth two içeren yüksek kopya plazmit DNA'sı ile vahşi tip W 3 0 3 maya suşunu transforme ettik; 2 millimolar metiyonin, met 25 promotör aktivitesini baskılar.Metiyonin içermeyen besiyeri maksimum ekspresyona izin verse de, yakın zamanda transforme edilmiş hücreler içeren bir plakadan altı koloni seçin ve 0,2 millimolar metiyonin içeren 50 mililitre seçici besiyeri ile bir konik erlene inoküle ederek, ertesi sabaha kadar 30 degrees Celsius'ta 200 RPM sarsıntıyla inkübe edin. Kültürün 600 nanometredeki optik yoğunluğunu ölçerek hücre yoğunluğunu tahmin edin. Mililitre başına 20 OD 600 nanometre eşdeğeri hücreyi steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjleme yoluyla hasat edin.Hücre döngüsünü senkronize etmek için hücreleri YPD besiyerinde vorteksleyerek yeniden süspansiyon haline getirin; DMSO içindeki 1 mg/mL'lik stoktan 15 µg/mL final konsantrasyonuna ulaşın. 30 °C'de, 200 RPM çalkalamalı inkübatörde dört saat boyunca inkübe edin. Dört saat sonra, mitozda duraklayan hücrelerin yüzdesini kontrol edin.Mikroskop altında inceleme yaparak eşit büyüklükte tomurcuklara sahip hücreleri sayın ve bir sonraki adıma geçin. Yalnızca duraklama %90'tan fazla olduğunda, hücreleri 2200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek hasat edin. Buz gibi soğuk su ile üç kez yıkadıktan sonra, peleti mililitre başına yaklaşık 0,5 OD 600 nanometre hücre yoğunluğunda, metiyonin içermeyen seçici besiyerinde süspande edin.Hücre hacminin yarısını yeni bir steril tüpe aktarın ve final konsantrasyonu 0.2 millimolar olacak şekilde metiyonin ekleyin. Bu işlem, bazal protein ekspresyon seviyelerinden kaynaklanan etkiler için kontrol olarak hizmet edecektir. Her iki kültürü de 30 derece Celsius'luk inkübatöre geri yerleştirin.Hücreler, her bir zaman noktasında altı saat boyunca her saat başı fenotip gelişimi açısından analiz edilir. Her kültürden bir mililitre hücre süspansiyonu steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve hücreler santrifüjleme ile toplanır, süpernatan aspire edilir ve pelet 70 µL besiyerinde yeniden süspande edilir. Ardından, steril su içerisinde bir mg/mL'lik stoktan 30 µL metilen mavisi eklenir.Ardından, bu süspansiyondan yaklaşık altı µL'yi temiz bir lam üzerine pipetleyin ve damlanın üzerine bir lamel yerleştirin. Cam yüzeyler arasında ince ve homojen bir hücre tabakası oluşturmak için lamele hafifçe bastırın. Lameli dokuz kadrana bölün ve her kadran başına üç görüntü alın.Doğru nicelleştirme yapabilmek için alan başına hücre sayısı 30 hücreden fazla olmamalıdır. Bu örnekte, birbirlerinden ayrılamayan, uzamış ve/veya birbirine eklenmiş tomurcuklara sahip tomurcuklanan maya hücreleri olan, incelenen fenotipi gösteren hücrelerin sayısını sayın. Hücre bölünme kusuru nth üzerinde indüklendiğinden, mavi renklerinden tanımlanan ölü hücrelerin sayısını da sayıyoruz.Fenotipe özgü defektleri her zaman diliminde görselleştirmek için iki aşırı ekspresyon hücre ölümüne yol açar. Steril bir mikro santrifüj tüpüne bir mililitre kültürden alikot alın ve hücreleri santrifüj ile hasat edin. Hücre peletini, steril su içinde hazırlanmış bir miligram/mililitre konsantrasyonundaki kalsiflores beyaz çözeltinin 100 mikrolitresi içinde süspanse edin ve oda sıcaklığında, karanlıkta beş dakika inkübe edin.Calcior white ile boyama, e hücre duvarının görüntülenmesini sağlar. Peleti üç kez 1x PBS ile yıkayın. Son peleti 100 µL PBS içinde süspande ediyoruz.Hücre duvarını görüntülemek için UV optikleri kullanarak hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve 100 x büyütmede görüntüler edinin. GFP etiketli septini görüntülemek için FS E filtresi kullanarak görüntüler edinin. Lamelini dokuz kadrana bölerek ve sayım için her kadranda üç görüntü alarak, daha önce gösterilen yöntemi kullanarak hücre duvarı defektleri ve septin hatalı yerleşimi olan hücrelerin yüzdesini belirleyin TimeLapse videosu. Tekil maya hücrelerinin mikroskopisi, agar yatakları oluşturmak için medya gömülü agar yatakları gerektirir.Öncelikle, konkav bir çukura sahip cam lamı %70 alkol ile temizleyin ve lamın havada kurumasına izin verin. Lam kururken, 0,06 gram agros'u metiyonin içermeyen beş mililitre seçici besiyerinde, agros tamamen ve hızla çözünene kadar mikrodalga fırında kaynatın. Agros içeren besiyerinden 200 µL'yi lamın üzerine pipetleyin.Çukurcuk üzerine başka bir temiz lamı ters şekilde yerleştirin ve altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Jel katılaştığında, üstteki lamı yüzeyleri her zaman paralel tutarak çukurcuk lamından yavaşça uzaklaştırın. Bu işlem, agar yatağının yüzeyinin çukurcuk lamının yüzeyiyle aynı hizada olmasını sağlar.Agros yatağını çevreleyen lam bölgesini hassas bir mendille temizleyin. Lam, dört saatlik sürenin sonunda kullanıma hazır hale gelir. Kültürden bir mililitre hücreyi steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüjle hasat edin.Süpernatantı aspire edin ve hücreleri metiyonin içermeyen 100 µL taze seçici besiyerinde yeniden süspande edin. Lamelin kenarlarına vazelin uygulayın. Ardından, hücre süspansiyonundan bir damlayı agros yatağının merkezine yerleştirin ve üzerine bir lameli hafifçe bastırarak homojen bir şekilde yayın.Kapak camının kenarlarını oje ile çevreleyerek kenarları mühürleyin ve konumunu sabitleyin. Oje kuruduktan sonra, lamı bir mikroskobun ısıtmalı tablasına yerleştirin. Zamanla görüş alanı kalabalıklaşacağı için, hücrelerin yeterince aralıklı olduğu ve sayısının 10'u geçmediği bir alan seçmek amacıyla Zeiss Axio camm, MRM monokrom dijital kamera ile donatılmış bir Zeiss Axio 200 M mikroskobu kullanıyoruz.Hücreler bölündükçe, yaklaşık beş saat boyunca her beş dakikada bir alanın görüntüsünü alın. Odağı tekrar tekrar ayarlamaktan kaçınmak için, görüntüleme yazılımını her zaman noktasında otomatik olarak birkaç Z-serisi görüntü alacak şekilde programlıyoruz.Hücreler için yeterli ısının sağlanması amacıyla, mikroskobun iletilen beyaz ışığının tüm görüntüleme süresi boyunca açık bırakılmasının yanı sıra, ısıtmalı sahnelere ek olarak harici bir ısı kaynağı kullanılacaktır; daha sonra movie oluşturmak için en iyi odaklamaya sahip görüntü seçilecektir. Fenotip regresyonu, görüntülerin Image J yazılımı kullanılarak bir movie haline getirilmesiyle incelenebilir. Burada, ilgilendiğimiz proteinin aşırı ekspresyonuna ilişkin temsili sonuçları gösteriyoruz. Nth two.İlk olarak, nth two'nun protein ekspresyonu, deneyin zaman seyri boyunca belirlenmiştir. HA nth two eksprese eden hücrelerden alınan lizatlar, immünoblotta gösterildiği üzere monoklonal bir anti HA antikor kullanılarak western blotting ile analiz edilmiştir. 0.2 millimolar metiyonin varlığında büyütülen hücreler minimal protein ekspresyonu göstermektedir. Bununla birlikte, metiyonin içermeyen medyumlarda büyütülen hücreler, deneyin zaman seyri boyunca S two konsantrasyonunda tutarlı bir artış sergilemektedir.Düşük nth iki konsantrasyonunun hücre bölünmesi fenotipi veya sadece hücre ölümü tetikleyemediği nedeniyle, altı saat boyunca metiyonin varlığında veya yokluğunda büyütülen hücreler analiz edilmiştir. Metilen mavisi ile boyama sonrası mavi renkleri ile belirtildiği üzere, hücrelerin düşük bir yüzdesi ölüdür. Benzer şekilde, hücre başına çekirdek sayısı, hücre duvarı ve septin organizasyonu beklendiği gibi normaldir.Buna karşılık, M iki'nin aşırı ekspresyonu, metilen mavisi ile boyandığında mavi rengini koruyan, birbirine bağlı uzamış tomurcuklardan oluşan uzun zincirlerle kanıtlandığı üzere, ciddi bir hücre bölünmesi kusuruna ve hücre ölümüne yol açar. DPI boyamasının gösterdiği üzere, fenotipik hücrelerin çoğu çok çekirdeklidir. Calcofluor white boyaması ise anormal hücre duvarı yamalarının birikimlerini ortaya koymaktadır.Ek olarak, septin belirgin şekilde yanlış yerleşmiş ve düzensizdir. Fenotipin zamana bağlı nicelleştirilmesi bu grafikte gösterilmiştir; burada açık daireler 0 mM metiyonini, kapalı daireler ise 0,2 mM metiyonini temsil etmektedir. Burada, hücrelerde zamanla nth iki konsantrasyonu arttıkça, hücre bölünmesi fenotipi gösteren hücrelerin yüzdesinin de yükseldiğini görmekteyiz.0.2 mM metiyonin ile büyütülen kontrol hücreleri, fenotip gelişiminin hücre kültürü koşullarından değil, artan protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olduğunu göstermektedir. Son olarak, nth two aşırı ekspresyonu sonrası fenotip gelişimi, zaman ayarlı video mikroskopisi ile kaydedilmiştir.Dört saatlik nth sonrası, iki aşırı ekspresyon hücresi hafif bir morfolojik hücre bölünmesi fenotipi göstermektedir. Video ilerledikçe, çok uzamış tomurcuklara yol açan, anormal ve uzamış apikal tomurcuk büyüme dönemleri görülmektedir. Ayrıca, bir hücre ayrılma olayı gerçekleşmeden önce yeni tomurcuk oluşumu olayları da gözlemlenmektedir.Ek olarak, ana hücrenin birkaç bölgesinden tomurcukların çıktığı ve bunun dallanmış bir görünüme yol açtığı gözlemlenmektedir. Tomurcuklanma listesinde, bir morfolojik fenotipin gelişiminin protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak nasıl karakterize edileceğini ve analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, hücreleri önerilen santrifüj hızlarında döndürmeyi hatırlamak önemlidir; çünkü daha yüksek hızlar hücrelere zarar verebilir.Methylene blue ve klorürün ışığa duyarlı hücreler için toksik olması nedeniyle, bunları görüntülemeden hemen önce eklemeyi hatırlamak da önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Bu makalede, non-invaziv konfokal mikroskopi kullanılarak bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotipleri için orta büyüklükte Candida albicans mutant kütüphanelerinin taranması için bir yöntem anlatılmaktadır.

Bir Memeli Konağında Aktif Enfeksiyon Sırasında Candida albicans Mutant Suşlarında Morfogenez Fenotiplerini Taramak için In Vivo Görüntülemenin Kullanımı

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de protein konsantrasyonuna bağlı morfolojik fenotip gelişimini analiz etme yöntemini. Bu protokol düzenlenebilir promotör kullanarak kontrollü protein ekspresyonu sağlar.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Daha fazla video keşfet