Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, tomurcuklanan maya kinetik çekirdek proteinleri olan NDC 10 ve NDC 80'in simülasyonunu ve her yerde bulunmalarını tespit etmektir. Bu, ilk olarak SMT üç etiketli SMT ve MT etiketli NDC 10 veya NDC 80 etiketli tıslama bayrağı ifade eden maya hücrelerinin hasat edilmesi ve bu hücrelerden protein ekstraktlarının yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, toplamın tespiti için tıslama bayrağı etiketli SMT üç konjugatını saflaştırmak veya ubikitinasyonun tespiti için mik tagg kinetik çekirdek proteinlerini immüno-çökeltmektir.

Daha sonra, western blot analizi ile toplama veya ubikitinasyon tespit edilir. Sonuç olarak, NDC 10 ve NDC 80 için bir merdiven modelinin varlığı, bu proteinlerin simüle edildiğini ve her yerde bulunduğunu doğrular. Tarif edilen protein saflaştırma yöntemi, tomurcuklanan maya sakrosunda konnik proteinler ND C 10 ve NDC 80'in hem simülasyonunun hem de ubikitinasyonunun tespit edilmesini sağlar.

Benim cci. Bu tekniğin temel avantajı, oluşturduğumuz suşun, biri test proteini üzerinde, diğeri ise simülasyonun tespitine izin veren iki epitop saldırısına sahip olmasıdır. Bu etiketlerin kullanımı, poliklonal serum kullanıldığında sıklıkla gözlenen çapraz reaktivite nedeniyle arka planı azaltır.

Bu prosedürün gösterimi, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Canero Uni tarafından yapılacaktır. İlgilenilen proteinler, daha önce hazırlanan ve eksi 20 santigrat derecede saklanan maya hücresi peletlerinden ekstrakte edilecektir. Resus, hücreleri 0.5 mililitre buz gibi soğuk tamponda askıya alır.

Ekstrakt, nikel nitril, tri asetik asit veya nikel NTA süper akış boncukları kullanılarak aşağı çekme testi içinse, gergi tamponu kullanın. Ekstrakt immünopresipitasyon içinse tampon A kullanın. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun.

Hücre süspansiyonlarını iki mililitreye aktarın. Kapağı her tüpe iki kez vidalayın. Hücre süspansiyon boncuğunun hacmine eşit bir hacimde cam boncuk ekleyin.

Hücreleri mini bir boncuk çırpıcıda oda sıcaklığında iki dakika çırpın ve ardından tüpleri iki ila üç dakika buzun üzerine koyun. Boncuk çırpma ve buzlanma işlemini üç kez tekrarlayın. 30 ila 60 dakika boyunca dört santigrat derecede yüksek hızda girdap.

Hücrelerin parçalandığından emin olmak için mikroskop altında görselleştirerek hücreleri kontrol edin. Parçalanmış hücreler karanlık hayaletler olarak görünecek ve bir sınır veya tanımlanmış bir şekle sahip olmayacaktır. Optimal olarak hücrelerin en az% 80'i yatmalıdır.

Ardından, tüpün dibinde bir delik açmak için bir itme pimi kullanın. Vidalı kapağı gevşek bir şekilde yerleştirin ve tüpü 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Bir dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin.

Lizatı toplamak için, ekstrakte edilen proteinleri toplamak için lizatı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 15.000 kez G'de bir mikro santrifüj tüp santrifüjüne aktarın. Bir protein tahlil kiti kullanarak ekstrakte edilen proteinlerin konsantrasyonunu ölçtükten sonra, tüm ekstraktları normalleştirin, böylece her biri aynı miktarda protein içerecektir. Uygun tampon ile toplam hacmi bir mililitreye getirin.

50 OD 600 hücresinden yaklaşık beş miligram toplam protein elde edilir. Ekstrakte edilen proteinin 50 mikrolitresini tüm hücre ekstraktı olarak saklayın. Kalan 950 mikrolitre protein özütü daha sonra MT etiketli proteinlerin protein saflaştırılması veya immünopresipitasyonu için kullanılacaktır.

50 mikrolitre tam hücre ekstraktına 50 mikrolitre iki x laly numune tamponu ekleyin. Numuneleri 100 santigrat derecede bir ısı bloğunda üç ila beş dakika inkübe edin ve ardından western blot ile analiz edin. Bu prosedüre, saflaştırma için gerekli nikel NTA süper akış boncuklarını hazırlayarak başlayın.

Bir dakika boyunca düşük hızlı santrifüjleme için gereken boncuk miktarını elde edin. Süpernatanı çıkarın ve boncukları PBS ile yıkayın. Bir mililitre PBS ekleyin ve boncuklar yeniden askıya alınana kadar tüpü yukarıdan aşağıya doğru ters çevirin.

Düşük hızlı santrifüjleme ile boncukları toplayın ve süpernatanı çıkarın. Boncukları bu şekilde toplam beş kez yıkayın. Boncukları bir mililitre gergi tamponunda askıya alın ve işlenecek numunelere karşılık gelen tüp sayısına ayırın.

Boncukları düşük hızlı santrifüjleme ile toplayın ve her numune için süpernatanı çıkarın. 950 mikrolitre tüm hücre ekstraktını ekleyin. Daha önce 100 mikrolitre boncuk hazırlanır.

Dört santigrat derecede sallanan bir platformda en az dört saat veya gece boyunca inkübe edin. Dört santigrat derecede bir dakika boyunca 800 ila 1500 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanın 50 mikrolitresinden tasarruf edin.

Bu süpernatana 50 mikrolitre iki x laly numune tamponu ekleyin ve 100 santigrat derecede bir ısı bloğunda üç ila beş dakika inkübe edin. Her numunenin 10 mikrolitresi daha sonra Western Blot ile analiz edilecektir. Nikel NTA süper akış boncuklarını bir mililitre guine tamponu ile oda sıcaklığında sallanan bir platformda beş ila 10 dakika yıkayın.

Daha sonra, boncukları bir mililitre kırma tamponu ile beş kez yıkayın, son yıkamadan sonra kırma tamponu ile boncukları 90 mikrolitre iki x laly numune tamponunda yeniden süspanse edin. Etiketli proteini nikel NT'den ayırmaya yardımcı olmak için 10 mikrolitre bir molar iole ekleyin. Bir boncuk, bir ısı bloğunda 100 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edilir. Vorteks daha sonra 30 saniye boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bu işleme başlamak için, düşük hızlı santrifüjleme ile gerekli miktarda anti cmic aero afinite jel antikoru elde edin. Süpernatanı çıkarın, reçineyi tampon A ile yıkayın Bir mililitre tampon A ekleyin ve reçine yeniden süspanse olana kadar yukarıdan aşağıya ters çevirin.

Reçineyi düşük hızlı santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın. Toplam beş kez yıkayın. Reçineyi bir mililitre tampon A içinde süspanse edin ve işlenecek numunelere karşılık gelen tüp sayısına alikot yapın.

Reçineyi düşük hızlı santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın. 25 mikrolitre reçineye 950 mikrolitre tam hücre özütü ekleyin: Ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platformda inkübe edin. Dört santigrat derecede bir dakika boyunca 800 ila 1500 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanın 50 mikrolitresinden tasarruf edin. Bu süpernatana 50 mikrolitre iki hafif numune tamponu ekleyin ve 100 santigrat derecede bir ısı bloğunda üç ila beş dakika inkübe edin. Reçineyi tampon ile yıkayın, bir mililitre tampon ekleyin, reçine yeniden süspanse olana kadar yukarıdan aşağıya ters çevirin.

Reçineyi düşük hızlı santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı son yıkamadan çıkardıktan sonra süpernatanı çıkarın. Reçineyi 100 mikrolitre sume numune tamponunda yeniden süspanse edin, 100 santigrat derecede bir ısı bloğunda üç ila beş dakika inkübe edin. Vorteks daha sonra 30 saniye boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Son olarak, bu protokolden toplanan tüm örnekleri yükleyin. Bir SDS sayfasında, Western blot analizi için jel, kinetik proteinlerin simülasyonunu tespit etmek için SMT üç veya HF SMT üç etiketli poli histamin bayrağı ve MT etiketli NDC 80 ve NDC 10 ifade eden maya suşları kullanıldı.

HF SMT üç substratı, nikel boncuklar kullanılarak afinite saflaştırıldı ve bir Anti-Flag antikoru ile tespit edildi. Toplam moated NDC 80, bir anti mic antikoru ile problandığında HF SMT üç substratında tespit edildi. HF SMT üç içermeyen kontrol suşlarında modifiye edilmiş proteinlerin olmaması, HF SMT üç ile hedef proteinleri arasındaki etkileşimin özgüllüğünü gösterir.

Ayrıca, NDC 80 ve NDC 10'un her yerde bulunmayı tespit etmek için NOCO desole ile muamele edilmiş hücrelerde NDC 80 ve NDC 10'un toplamı azaltılır. Mick etiketli ND C 80 veya ND C 10 immünoçökeldi ve western blot analizi anti mic ve anti ubikitin antikorlarla yapıldı, tüm hücre ekstraktı ve süpernatant analizi NDC 80 M ve NDC 10 M ekspresyonunu doğruladı, anti MIC ile incelenen immün çökeltilmiş numuneler, NDC 80 ve NDC 10'un translasyon sonrası modifikasyonlar içerdiğini düşündüren çoklu yüksek moleküler ağırlıklı bantlar gösterdi. Anti ubikuitin ile incelenen immüno-çökeltilmiş örneklerin bir merdiven paterni, ND C 80 ve ND C 10'un her yerde olduğunu gösterdi.

NDC 80 ve NDC 10'un merdiven paternleri, bir proteazom inhibitörü MG 1 32 ile muamele edilerek geliştirilmiştir. Bunların poli ubikitinasyonu temsil ettiğini daha da doğrulamak Bu videoyu izledikten sonra, yarasa NN'nin masyonunun tespitine ve aşılanmasına izin veren protein saflaştırma tekniğini iyi anlamış olmalısınız.