Name: Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Keşfedin Saccharomyces cerevisiae'de Ndc10 ve Ndc80 kinetokor proteinlerinin sumoylasyon ve ubikuitinasyon tespiti için protein saflaştırma yöntemini. Western blot analizi ile bu modifikasyonları doğrulayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Destek ve tavsiyeleri için Dr. Oliver Kerscher'e ve makale hakkındaki destekleri ve yorumları için Basrai laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Okul İçi Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Maya Hücreleri 1. Büyüme <ol><li> Küçük bir kap içinde YPD (Tablo 1) 30 ml maya hücreleri inoküle. Çalkalama ile 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> YPD 50 ml, 600 nm (OD 600 = 0.2) ile 0.2 &#39;lik bir optik yoğunluğa kadar hücreleri seyreltilir ve çalkalanarak 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 600 nm (OD 600 = 1.0), 1.0&#39;lik bir optik yoğunluğa kadar kültür büyütün. </li><li> Santrifüj hücreleri 2,000 xg&#39;de 5 dakika boyunca ve supernatant atın. </li><li> Hücreleri yıkamak için 2000 x g&#39;de 5 dakika boyunca 40 ml steril su ve santrifüj hücre pelletini. Süpernatant atılır ve -20 ° C &#39;de hücre pelletini saklayın. </li></ol> Proteinlerin 2. Ekstraksiyon <ol><li> Ya da Ni-NTA Superflow boncuklar kullanılarak açılır deneyi için buzla soğutulmuş guanidin tamponu (Tablo 1) 0.5 ml olarak yeniden süspanse hücreleri, immüno-çökeltme için (Tablo 1) tampon maddesi. Her zaman buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> 2 m transferl vidalı kapaklı tüp. </li><li> Cam boncuklar aynı hacimde (Malzeme Tablo) ekleyin. </li><li> Daha sonra 2-3 dakika süreyle buz koyun, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle mini boncuk çırpıcı hücreleri (Malzeme Tablo) Boncuk yendi. Bu üç kez tekrarlayın. </li><li> 30-60 dakika boyunca 4 ° C &#39;de yüksek hızda vorteksleyin. Hücreler lize sağlamak için mikroskop altında görselleştirme hücreleri kontrol edin. Not: Liz olmuş hücreler gibi karanlık hayaletler görünür ve bir sınır veya tanımlanmış şekli yoksun olacak. En uygun olarak, hücrelerin en azından% 80 lize edilmelidir. </li><li> 15 ml konik tüp (vidalı kapak gevşek olmalıdır) bir koleksiyonda bir itme pimi ve yer kullanarak tüpün dibinde bir delik delmek. </li><li> Lizat toplamak için 1 dakika için 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Bir mikro santrifüj tüpüne lizat aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin ekstre proteinleri toplamak. </li><li> Protein assa kullanılarak ekstre proteinlerin konsantrasyonu ölçüny kiti (Malzeme Tablo) ve tüm özler normale protein aynı miktarda içermesi. Uygun bir tampon ile 1 ml toplam hacmi getirmek. Not: toplam proteinin yaklaşık 5 ila 50 mg OD 600 hücrelerinden elde edilir. </li><li> Bütün hücre ekstresi (WCE) halinde (adım 2.10 çıkarılan toplam protein, 5 mg olduğunda, 250 ug protein), 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi (Tablo 1) 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. Yük Western Blot analizi (Bölüm 5: Western blot analizi) bir SDS-PAGE jel içinde her numune için 10 ul. </li></ol> HF-Smt3 Konjugatlarının 3. saflaştırılması <ol><li> Deney 1 dakika boyunca düşük hızda santrifüj leme (800-1,500 xg) (örnek başına boncuk 100 ul) için gerekli olan Ni-NTA Superflow boncuk (Malzemelerin Tablo) elde edilir. Süpernatantı. </li><li> Yıkama boncuk PBS (Malzeme Tablosu) 1 ml 5 kat: Invert üst aşırıboncuklar yeniden süspanse kadar alt düşük hızda santrifüj boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Guanidin tamponu (Tablo 1) 1 ml boncuk askıya alma ve işlenecek olan örneklere karşılık gelen boruların sayısı içine kısım. Düşük hızda santrifüj ile boncuk toplayın ve süpernatant kaldırmak. Üst-over tersini alt tarafından iyi boncuk karıştırın. Not: Üst-over altını ters çevirerek iyice boncuk karıştırın. </li><li> Ni-NTA Superflow boncuk 100 ul: her bir numune için, (protein çıkarması Aşama 2.11) geri kalan BOA&#39;da 950 ul ilave edin. </li><li> En az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C &#39;de, bir sallanan platform üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika için 800-1,500 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatant (SUP) olarak 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. Yük Western Blot Analizi (Kısım 5 için bir SDS-PAGE jel içinde her numune için 10 ul: Batı benek AnalYsis). </li><li> Sallanan bir platform üzerinde bir kez 5-10 dakika süreyle guanidin tampon maddesi içinde 1 ml yıkama boncuk. </li><li> Yıkama boncuklar sallanan bir platform üzerinde 5-10 dakika süreyle tampon maddesi (Tablo 1) kırılması için 1 ml 5 kat. </li><li> 2x Laemmli numune tampon maddesi 90 ul içinde süspanse boncuklar. </li><li> 1 M imidazol, 10 ul ekle. Not: İmidazol bağlı imidazol ve halkalar arasında rekabet etkileşim Ni-NTA boncuklardan His-etiketli proteini ayırmak için yardımcı olur. </li><li> 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Girdap, daha sonra 30 saniye boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüjlenir. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. </li><li> (: Western blot analizi Bölüm 5) Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel içinde her bir numunenin yük 10-20 ul. Not: BOA&#39;da 5 mg kullanıldığı takdirde, 10-20 ul, giriş 0.5-1.0 mg karşılık gelir. </li></ol> Myc-etiketli Kinetokor Proteinlerin 4. immünopresipitasyonu <ol><li> Anti-c-myc agaroz afinite jel, bir elde edilirtibody (Malzeme Tablo) düşük hızda santrifüj (800-1,500 xg) deneylerinde (örnek başına reçine 25 ul) için gerekli. Süpernatantı. </li><li> Tampon A ile 1 ml &#39;si ile yıkayınız reçinesi 5x: Reçine yeniden süspansiyon haline kadar ters çevirin en fazla alt düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın. </li><li> Tampon A içinde 1 ml bir reçine askıya alma ve işlenecek olan örneklere karşılık gelen boruların sayısı içine kısım. Düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın. Not: Üst-over-bottom tersini de reçineyi karıştırın. </li><li> Reçine 25 ul (protein ekstraksiyonu Aşama 2.11) geri kalan BOA&#39;da 950 ul ekle. </li><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de, bir sallanan platform üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 dakika için 800-1,500 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatant (SUP) olarak 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. BakReklam Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel (Bölüm 5: Western blot analizi) &#39;de her bir numune için 10 ul. </li><li> Tampon A ile 1 ml &#39;si ile yıkayınız reçinesi 5x: Reçine yeniden süspansiyon haline kadar ters çevirin en fazla alt düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın. </li><li> SUMEB numune tamponu (Tablo 1), 100 ul reçine yeniden süspanse edin. Not: SUMEB örnek tamponu 8 M üre ve% 1 SDS (güçlü denatüre koşul) içerir. </li><li> 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Girdap, daha sonra 30 saniye boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüjlenir. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. </li><li> (: Western blot analizi Bölüm 5) Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel içinde her bir numunenin yük 10-20 ul. Not: BOA&#39;da 5 mg kullanıldığı takdirde, 10-20 ul, giriş 0.5-1.0 mg karşılık gelir. </li></ol> 5. Western Blot Analizi <ol><li> % 4-12 Bis-Tris jelleri (Malzeme Tablo) ve perf üzerinde protein özleri yükleyinorm Elektroforez 90 dakika boyunca 120 V (tampon Running: Malzemelerin Tablosu). </li><li> 90 dakika boyunca (: Malzemelerin Tablo transfer tampon maddesi) 30 V bir transfer aparatı kullanılarak bir nitroselüloz zar (Malzemelerin Tablo) jelden proteinleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt / TBST 1x (Tablo 1) membran bloke eder. </li><li> % 5 süt / TBST 1x gece boyunca 4 ° C birincil antikor (Malzeme Tablo) ile membran inkübe edin. 1000 (anti-Flag ve anti-Ub antikorlar) ya da 1: 5000 (anti-myc antikoru), birincil antikor, bir 1 seyreltme kullanın. </li><li> 1x TBST ile 10 dakika her biri için membran 3x yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt / TBST içinde 1 x sekonder antikor (Malzemelerin Tablo) ile membran inkübe edin. Sekonder antikor 5,000 seyreltme: 1 kullanın. </li><li> 1x TBST ile 10 dakika her biri için membran 3x yıkayın. </li><li> ECL worki ile membran inkübeng çözeltisi (Malzeme Tablo) 5 dakika. </li><li> Mavi duyarlı X-Ray film membranı (Malzeme Tablo) Açığa ve otomatik geliştirici (Malzeme Tablosu) kullanarak geliştirmek. </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mub1%2FUbr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216(2013).</li>
<li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li>
<li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li>
<li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li>
<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

HA, Myc, Bayrak ve GST edildiği gibi epitop işareti yaygın proteinlerin biyokimyasal analizi için kullanılmıştır. HF-Smt3 ve Ndc10 ve Ndc80 Myc-etiketli kinetochore proteinler ile suşların inşaatı, örneğin sumoylation ubikuinasyon olarak PTMS tespitini kolaylaştırır. HF-Smt3 tahlil aşağı çekme sumoylated kinetochore proteinler, Ndc10 ve Ndc80 (Şekil 1) algılanmasını sağlar. Anti-Flag antikor kullanılarak afınite saflaştırma protokolü ve western lekeleme analizi, HF-Smt3 ve hedef proteinler arasındaki et...

Sırasıyla bir hedef proteine ​​(S. cerevisiae 1 Smt3 SUMO) yayılmasını ve sumoylation ubikitin ve küçük Ubikuitin benzeri değiştirici konjügasyonunu sağlar. Kinetochore proteinlerinin PTMS sadık kromozom segregasyonu sağlamak için farklı bir hücre döngüsü aşamaları sırasında hücresel düzeyleri ve protein-protein etkileşimlerini etkiler. Örneğin, Cse4 / CENP-A ve dış kinetochore proteini Dsn1 hücresel düzeyleri genom stabilitesini 2-5 sağlanması için ubikuitin-aracılı proteolizi ile düzenlenir. Yanlış kinetochore-mikrotübül ekleri destabilizasyonu doğrudan mikrotübül 6-8 ile etkileşim Dam1 ve Ndc80 kompleksleri fosforile Ipl1 / Aurora B kinaz gerektirir. Yetmiş üzerinde kinetochore proteinlerin belirlenmesi rağmen, PTMS, örneğin ubikitin ve SUMO ile bu proteinlerin değişiklikler araştırmak çok az sayıda çalışma vardır. Büyük bir sınırlama PTM korumak için yeteneğisaflaştırma ve sumoylation, fosforilasyon, metilasyon, ve diğerleri gibi PTMS tespiti için özel antikorların yetersizliği s üzerine çıkar. Sumoylated kinetochore proteinlerin karakterizasyonu Ndc10, Cep3, Bir1 ve Ndc80 özel bir antikor 9 kullanılmaktadır. Buna ek olarak, Ndc10 ubikitinasyon 10, bir alt-tabaka olarak dahil edilmiştir. İnsan Hec1 (S. cerevisiae&#39;deki Ndc80), APC / Cı-hCdh1 E3 ligaz 11 düzenlenir, ubikitinasyon için maddedir. Bu nedenle, Ndc10 ve Ndc80 S. sumoylation ve ubikitinasyona hem algılamak için protokol optimizasyonu için iyi adaylardır cerevisiae. Sumoylation belirlenmesini kolaylaştırmak için, HF-Smt3 ve Myc etiketli Ndc10 veya Ndc80 ifade eden suşları inşa. epitop etiketleri (HF: His6-Bayrak) kullanılması nedeniyle sık, bir aday proteine ​​karşı poliklonal serum içinde gözlenir çapraz reaktivite arka en aza indirir. Biz afinite bir protokol geliştirdiHF-Smt3 birleşikleri saflaştırılması ve daha sonra saf hale Smt3 hazırlanmasında sumolyated Ndc10 ve Ndc80 varlığını tespit etmek için, ticari bir anti-Flag ve anti-myc antikoru kullanılır. Ubikitinasyon sağlamak için, Myc-etiketli kinetochore proteinlerinin dağılmasını koruyan bir tadil edilmiş immüno protokolü tasarlanmış ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna tespit etmek için ticari bir anti-Ub antikoru ile Western Blot analizi gerçekleştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Cam boncuklar</td><td>BioSpec Ürünleri</td><td>11079105</td><td>0,5 mm çap</td></tr><tr><td>Mini boncuk çırpıcı</td><td>BioSpec Ürünler</td><td>#693</td><td>8 hücre bozucu</td></tr><tr><td>Ni-NTA süper akış</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>Tavşan</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich'te</td> üretilen 1 ml<td>Anti-c-Myc agaroz afinite jel karınca</td><td>A7470</td><td>Fare</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich'te</td> üretilen 1 ml<td>Monoklonal anti-Flag M2 antikoru</td><td>F1804</td><td>Birincil antikor, seyreltme 1:1.000</td></tr><tr><td>c-Myc antikoru (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Birincil antikor, seyreltme 1:5.000</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış fare antikoru monoklonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Birincil antikor, seyreltme 1:5.000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoklonal antikor</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Birincil antikor, seyreltme 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>NA934V</td><td>İkincil antikor, seyreltme 1:5.000</td></tr><tr><td>ECL Fare IgG, HRP'ye Bağlı Tam Ab</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>NA931V</td><td>İkincil antikor, seyreltme 1:5.000</td></tr><tr><td>DC protein testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0,45 mm gözenek boyutu</td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 kuyulu</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Çalıştırma Tamponu</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Aktarım Tamponu</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Kemilüminesan Yüzey</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Maviye duyarlı X-Ray filmi</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik geliştirici</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Kimyasalları</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

sumoylation ve geliştirici maya kinetokor proteinler ndc10 ve ndc80 ve ubikuitinasyomınun tespiti verir protein saflaştırma tekniği

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon, ubikitinasyon ve sumoylation gibi post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS), pek çok protein, hücresel fonksiyonu düzenleyen. Sentromerik DNA ile ilişkilendirmek kinetochore proteinlerin PTMS genom istikrarı korumak için sadık kromozom tecrit aracılık eder. Bu tür kütle spektrometrisi ve western blot analizi gibi biyokimyasal yaklaşımlar en yaygın PTMS tanımlanması için kullanılır. Burada, bir protein saflaştırma yöntemi Saccharomyces cerevisiae&#39;de kinetochore proteinler, Ndc10 ve Ndc80, bir sumoylation ubikuinasyon hem saptanmasına izin veren tarif edilmektedir. Ndc10 Myc-etiketli ya Ndc80 inşa ve çalışmaları için kullanılmıştır ifade polihistidin-Flag-işaretli Smt3 (HF-Smt3) ve A suşu. Sumoylation saptanması için, nikel boncuklar kullanılarak His ile etiketlenmiş sumoylated proteinleri saflaştırmak için bir protokol geliştirilmiştir ve sumoylated Ndc10 a tespit etmek için bir anti-myc antikor ile Western blot analizi kullanılannd Ndc80. Ubikitinasyon saptanması için, Myc-etiketli proteinlerin immüno için bir protokol geliştirilmiştir ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinlenmiş olduğunu göstermek için anti-Ub antikor ile Western blot analizi kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız His-Bayrak ilgi epitop etiketli protein Smt3 suşu birden PTMS tespitini kolaylaştırır etiketlenmiş olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmalar bu tekniğin sömürü belirli bir PTM bağımlı protein etkileşimleri belirlemek ve tanımlamak için izin vermelidir.

Daha önce tarif edildiği gibi 9,12 kinetochore proteinleri Ndc80 ve Ndc10 bölgesinin sumoylation tespit etmek için, HF-Smt3 ve Myc-etiketli kinetochore proteinleri (Ndc80 veya Ndc10) suşlar, (Tablo 2) yapılmıştır. HF-Smt3 konjugatları afinite Ni-NTA boncuklar kullanılarak saflaştırılmıştır. HF-Smt3 (Şekil 1A ve 1B, sol panel) içermeyen kontrol suşu yoktu SUMO substratların sumoylated formları, bir anti-Bayrak antikor izin algılama ile arıtılmış, HF-Smt3 Weste...

Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Bu prosedürün genel amacı, tomurcuklanan maya kinetik çekirdek proteinleri NDC 10 ve NDC 80'in sumilasyonunu ve ubikitinasyonunu tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle hiss flag etiketli SMT three ile MT etiketli NDC 10 veya NDC 80 eksprese eden maya hücrelerinin hasat edilmesi ve bu hücrelerden protein ekstraktlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, sumilasyonun tespiti için hiss flag etiketli SMT three konjugatlarının saflaştırılması veya ubikitinasyonun tespiti için mik etiketli kinetik çekirdek proteinlerinin immünopresipite edilmesidir.Ardından, sumilasyon veya ubikitinasyon western blot analizi ile tespit edilir. Sonuç olarak, NDC 10 ve NDC 80 için bir merdiven paterni oluşumu, bu proteinlerin sumileştiğini ve ubikitinlendiğini doğrular. Açıklanan protein saflaştırma yöntemi, tomurcuklanan maya sacro'daki ND C 10 ve NDC 80 koniko proteinlerinin hem sumilasyonunun hem de ubikitinasyonunun tespit edilmesine olanak tanır.My cci. Bu tekniğin temel avantajı, oluşturduğumuz suşun iki epitop saldırısına sahip olmasıdır; bunlardan biri test proteini üzerindedir, diğeri ise simülasyonun tespitine olanak tanır. Bu etiketlerin kullanımı, poliklonal serumlar kullanıldığında sıklıkla gözlemlenen çapraz reaktivite kaynaklı arka plan gürültüsünü azaltır.Bu prosedürün gösterimi, laboratuvarımdaki araştırma görevlisi Canero Uni tarafından gerçekleştirilecektir. İlgilenilen proteinler, daha önce hazırlanmış ve -20 °C'de saklanmış maya hücre peletlerinden ekstrakte edilecektir. Hücreleri 0,5 mL buz gibi soğuk tampon çözeltide yeniden süspande edin.Ekstrat nikel nitril, triasetik asit veya nikel NTA superflow boncuklar kullanılarak yapılacak bir pull-down analizi içinse guine tamponu kullanın. Ekstrat immünopresipitasyon içinse tampon A kullanın. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun.Hücre süspansiyonlarını iki mililitreye aktarın. Her tüpe vidalı kapak takın. Hücre süspansiyonu hacmine eşit miktarda cam boncuk ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca mini boncuklu homojenizatörde (bead beater) parçalayın ve ardından tüpleri iki ila üç dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Boncukla parçalama ve buz üzerinde bekletme işlemini üç kez tekrarlayın. 4 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca yüksek hızda vorteksleyin.Hücrelerin lizize olduğundan emin olmak için mikroskop altında görüntüleme ile kontrol edin. Lizize olmuş hücreler koyu renkli gölgeler şeklinde görünecek, bir sınıra veya tanımlı bir şekle sahip olmayacaktır. İdeal olarak hücrelerin en az %80'i lizize olmalıdır.Ardından, tüpün altına bir raptiye ile delik açın. Vidalı kapağı gevşekçe kapatın ve tüpü 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. 1000 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin.Lizatı toplamak için, ekstrakte edilen proteinleri çöktürmek amacıyla lizatı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 15,000 ×g hızında santrifüjleyin. Ekstrakte edilen proteinlerin konsantrasyonunu bir protein analiz kiti kullanarak ölçtükten sonra, her bir ekstraktın aynı miktarda protein içermesini sağlayacak şekilde tüm ekstraktları normalize edin. Toplam hacmi uygun tampon çözelti ile 1 mL'ye tamamlayın.50 OD 600 hücreden yaklaşık beş miligram toplam protein elde edilir. Ekstrakte edilen proteinin 50 mikrolitresini tüm hücre ekstraktı olarak saklayın. Kalan 950 mikrolitre protein ekstraktı, daha sonra protein saflaştırma veya MT etiketli proteinlerin immünopresipitasyonu için kullanılacaktır.50 µL tüm hücre ekstraktına 50 µL 2x Laly örnek tamponu ekleyin. Western blot ile analiz etmeden önce örnekleri bir ısıtıcı blokta 100 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Bu prosedüre, saflaştırma için gerekli olan nikel NTA superflow boncuklarını hazırlayarak başlayın.Bir dakika boyunca düşük hızlı santrifüjle gerekli miktarda boncuk elde edin. Süpernatanı uzaklaştırın ve boncukları PBS ile yıkayın. Bir mililitre PBS ekleyin ve boncuklar yeniden süspanse olana kadar tüpü alt üst ederek karıştırın.Boncukları düşük hızda santrifüj ederek toplayın ve süpernatantı uzaklaştırın. Boncukları bu şekilde toplam beş kez yıkayın. Boncukları bir mililitre guine tamponu içinde süspanse edin ve işlenecek numune sayısına uygun sayıda tüpe paylaştırın.Her bir örnek için boncukları düşük hızlı santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı uzaklaştırın. Daha önce hazırlanmış olan tüm hücre ekstraktından 950 microliter'ı, 100 microliter boncuğun üzerine ekleyin.Dört °C'de, sallantılı platform üzerinde en az dört saat veya gece boyunca inkübe edin. Dört °C'de, 800 ila 1500 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanttan 50 µL saklayın.Bu süpernatanta 50 µL 2x Laemmli örnek tamponu ekleyin ve bir ısıtıcı blokta 100 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Her örnekten 10 µL daha sonra western blot ile analiz edilecektir. Nikel NTA superflow boncuklarını, oda sıcaklığında sallantılı bir platform üzerinde 5 ila 10 dakika boyunca 1 mL yıkama tamponu ile bir kez yıkayın.Ardından, boncukları beş kez 1 mL parçalama tamponu ile yıkayın; parçalama tamponu ile yapılan son yıkamadan sonra boncukları 90 µL 2x Laemmli örnek tamponu içerisinde yeniden süspande edin. His etiketli proteinin nikel NTA boncuklarından ayrışmasına yardımcı olmak için 10 µL 1 M imidazole ekleyin; bir ısıtıcı blokta 100 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Vorteksledikten sonra 13.000 ×g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bu prosedüre başlamak için, düşük hızlı santrifüjleme yoluyla gerekli miktarda anti cmic aero afinite jel antikoru elde edin. Süpernatanı uzaklaştırın, reçineyi tampon A ile yıkayın. Bir mililitre tampon A ekleyin ve reçine yeniden süspanse olana kadar tüpü ters yüz ederek karıştırın.Reçineyi düşük hızlı santrifüjasyon ile toplayın ve süpernatantı uzaklaştırın. Toplam beş kez yıkayın. Reçineyi bir mililitre tampon A içinde süspande edin ve işlenecek örnek sayısına uygun sayıda tüpe paylaştırın.Reçineyi düşük hızda santrifüj ederek toplayın ve süpernatantı uzaklaştırın. 25 µL reçineye 950 µL tüm hücre ekstraktı ekleyin. Bir sallama platformunda dört °C'de gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün dört °C'de bir dakika boyunca 800 ila 1500 ×g hızında santrifüjleyin.Süpernatantın 50 µL'sini saklayın. Bu süpernatanta 50 µL iki x lam ly örnek tamponu ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 100 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Reçineyi tampon A ile yıkayın; bir mL tampon A ekleyin ve reçine yeniden süspanse olana kadar üst kısmı alt kısmın üzerine gelecek şekilde ters çevirin.Son yıkamanın ardından süpernatanı uzaklaştırın ve reçineyi düşük hızlı santrifügasyonla toplayın. Reçineyi 100 µL örnek tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve bir ısıtıcı blokta 100 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Vorteksleyin, ardından 13.000 ×g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Son olarak, bu protokol ile toplanan tüm örnekleri yükleyin. Western blot analizi için hazırlanan bir SDS-PAGE jelinde, kinetikor proteinlerin kolokalizasyonunu saptamak amacıyla poli-histidin flag etiketli SMT3 veya HF-SMT3 ile MT etiketli NDC80 ve NDC10 eksprese eden maya suşları kullanılmıştır.HF SMT three substratları nikel boncuklar kullanılarak afinite saflaştırılmış ve Anti-Flag antikoru ile tespit edilmiştir. Anti-mic antikoru ile problandığında, HF SMT three substratlarında sumoile edilmiş NDC 80 tespit edilmiştir. HF SMT three içermeyen kontrol suşlarında modifiye proteinlerin bulunmaması, HF SMT three ile hedef proteinleri arasındaki etkileşimin özgünlüğünü göstermektedir.Ayrıca, NDC 80 ve NDC 10'un ubiquitination durumunu tespit etmek için NOCO desole ile işlem görmüş hücrelerde NDC 80 ve NDC 10 toplam miktarlarının azaldığı görülmüştür. Myc etiketli NDC 80 veya NDC 10 immünopresipite edilmiş ve anti-myc ile anti-ubiquitin antikorları kullanılarak western blot analizi gerçekleştirilmiştir. Tüm hücre ekstresi ve süpernatantın analizi, NDC 80 M ve NDC 10 M ekspresyonunu doğrulamıştır. Anti-MIC ile problanan immünopresipite örnekler, NDC 80 ve NDC 10'un post-translasyonel modifikasyonlar içerdiğini gösteren çok sayıda yüksek moleküler ağırlıklı bant sergilemiştir. Anti-ubiquitin ile problanan immünopresipite örneklerin merdiven benzeri bir örüntü göstermesi, NDC 80 ve NDC 10'un ubiquitinationa uğradığını kanıtlamıştır.NDC 80 ve NDC 10'un basamaklanma paternleri, bir proteazom inhibitörü olan MG 1 32 ile yapılan işlemle belirginleştirilmiştir. Bu durum, söz konusu yapıların poli-ubikitinasyonu temsil ettiğini daha fazla doğrulamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, yarasa NN'nin tespiti ve aşılanmasına olanak tanıyan protein saflaştırma tekniği hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Bu videoda, karmaşık bir peptit karışımından kalan di-glisin peptitleri içeren ubikitinile peptitlerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, proteindeki orijinal ubikitinasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

Bu video, sıralı bir enzim kaskad kullanılarak substrat proteinlerinin SUMOylasyonu için in vitro yöntemi göstermektedir. Ayrıca, proteinin SUMOylated durumu, elektroforez ve immünoblotlama tekniği kullanılarak tanımlanır.

SUMOylation Assay: İmmünoblotlama ile Substrat Proteinlerinin SUMOylation Durumunu Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.

Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.

SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler

Keşfedin Saccharomyces cerevisiae'de Ndc10 ve Ndc80 kinetokor proteinlerinin sumoylasyon ve ubikuitinasyon tespiti için protein saflaştırma yöntemini. Western blot analizi ile bu modifikasyonları doğrulayın.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği (Video) | JoVE Journal

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Daha fazla video keşfet