İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüksek verimli akış sitometrisi, hücre bazlı bir test kullanarak hasta örneklerinde nöronal anti D iki R veya N-M-D-A-R antikorlarını tespit etmektir. Bu, bir plazmit içindeki insan D iki R veya NMDAR'ın tam CDNA dizisi olan alt yapışma ile elde edilir. İkinci adım olarak, bir insan hücre hattı transfekte edilir, bu da nöronal antijenlerin hücre yüzeyi ekspresyonuna yol açar.

Daha sonra transfekte edilen hücreler, akış sitometrisi ediniminden önce hasta serumu ve uygun bir ikincil antikor ile inkübe edilir. Hücre yüzeyi antijenlerine antikor bağlanmasını tespit etmek için, akış sitometrisi analizine dayalı sonuçlar elde edilir. Bu, yüksek üç portlu akış sitometrisi hücre bazlı testimiz, büyük hasta numunesi kohortları için hızlı, kantitatif ve verimlidir.

Bu, immünokimya ve konfokal analiz ile hücre bazlı bir test kullanmaya göre önemli bir avantajdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, akış sitometresinde uygun sayıda hücre elde etmek için deney boyunca hücre kaybıyla mücadele edeceklerdir. Yıkamalar arasında hücreleri aspire etmemeye dikkat edin.

Transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygun olan ve antijenlerin ve yeşil floresan proteinin ayrı ayrı hücresel birlikte ekspresyonunu sağlayan bir ekspresyon vektörü seçin. Örneğin, bu vektör, dahili bir ribozom giriş bölgesinin kontrolü altında gelişmiş bir GFP raportörüne sahiptir, klonları dizileme ile doğruladıktan sonra uygun kısıtlama enzimlerini kullanarak tam uzunlukta insan CD NA'yı vektöre klonlayın, transfect kültüründe kullanıma uygun plazmit stokları yapın. % 10 fetal sığır serumu ile tam DMEM'deki HEK 2 93 hücreleri.

Hücreleri tripsin ile hasat edin, bir yıkamadan sonra hücreleri santrifüjleyin ve hücre peletini taze, tam dmm'de tekrar askıya alın. Hücreleri sayın, daha sonra yaklaşık% 70 Co akıcılığında altı oyuklu plakaya iki mililitre kültür tohumlayın, HEK 2 93 hücrelerinin kuyularını, ifade yapıları ve kontrol vektörü ile transfeksiyon için atayın. Daha sonra telafi için transfekte edilmiş HEK 2 93 hücrelerinde bir miktar tutun.

200 mikrolitre% 0.9 sodyum klorür, 2.5 mikrogram DNA ve mililitre başına dört mikrogram polietalin içeren transfeksiyon karışımlarını hazırlayın. Hemen 10 saniye boyunca girdap yapın ve transfeksiyon karışımını iki mililitre taze tam dmm'nin her bir oyuğuna eklemeden önce oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Plakayı örtün, yanları perfil ile sarın ve hücre transfeksiyonuna yardımcı olmak için 280 GS'de beş dakika santrifüjleyin.

Daha sonra para filmi çıkarın ve ardından plakayı 18 saat boyunca kültür koşulları altında yerleştirin. Kültür ortamını taze tam DM EM ile değiştirin ve 72 saat daha kültürde tutun. Hücreleri ayırmak için, her bir oyuğa 500 mikrolitre varis ekleyin ve 37 santigrat derecede yaklaşık beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, her bir oyuğun hücrelerini PBS'de iki mililitre% 2 FBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri üç yıkamadan sonra konik bir tüpe aktarın. Hücre paletlerini %2 FBS çözeltisinde mililitre başına 1 milyon hücrede yeniden süspanse edin. Şimdi, akış sitometrisi edinimi için 96 kuyulu şablonu, farklı hücre hatları her hasta numunesi veya birincil antikor ile tedavi edilecek şekilde tasarlayın.

Daha sonra, V tabanlı 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 50.000 hücreyi tohumlayın, hücreleri beş dakika boyunca 450 Gs'de santrifüjleyerek peletleyin. Bir plakayı belirli bir açıyla eğin ve hücre peletini aspire etmemeye dikkat ederek supra natini nazikçe çıkarın. Daha sonra, antijen yüzey ekspresyonunu değerlendirmek için birincil antikorun seri seyreltmesini ekleyin.

Daha sonra antikoru tespit etmek için hasta numuneleri, 170 mikrolitre% 2 FBS çözeltisinde üç yıkamadan sonra hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, hasta için uygun AF 6 47 konjuge ikincil antikor anti-insan IgG'yi ekleyin ve anti-US. Primer antikorlar için IgG. Üç yıkamadan sonra karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca melezleyin.

Resus, akış sitometresinde akış sitometrisi hücre edinimi için hücreleri 35 mikrolitre% 2 FBS çözeltisinde askıya alır. Önce yüksek verimli örnekleyiciyi ayarlayın. Akış sitometrisi edinme şablonuna göre kuyu başına 10.000 olay elde edin.

Bir akış sitometrisi yazılım paketi kullanarak verileri dışa aktarın ve ardından ileri iç saçılmalara dayalı olarak canlı HEK 2 93 hücrelerini açın. Ayrıca, yalnızca transfekte edilmiş hücreleri analiz etmek için yüksek GFP pozitifliğine kapı açın. Canlı GFP pozitif hücreler içindeki AF 6 47 kanalının ortalama floresan yoğunluğunu belirleyin.

Ardından verileri analiz için Excel'e veya prizmaya aktarın. Her hasta ve kontrol numunesi için karşılık gelen numunelerden elde edilen MFI'ye karşı primer antikor konsantrasyonlarını çizin. Delta MFI'yi belirleyin: Kontrol kohortunun ortalama delta MFI'sinin üzerine üç standart sapma ekleyerek antikor pozitifliğinin eşiğini hesaplayın.

Ardından, hasta grubuna göre gruplandırılmış bireysel örnekleri bir grafik üzerinde çizin. Eşiği burada bir çizgi olarak temsil edin. N metil de aspartat reseptörünü veya dopamin iki reseptörünü eksprese eden hücreler, yüksek verimli bir örnekleyici kullanılarak akış sitometresinde elde edildi.

Analiz sırasında hücreler, boyut için ileri saçılmaya ve taneciklik için yan saçılmaya dayalı olarak kapılandı. TRANSFEKTE HK 2 9 3 hücreleri, sitoplazmada GFP raportör molekülünü eksprese etti ve UNT transfekte edilmiş hücreler, GFP pozitif yürüyüş içinde analizden çıkarıldı. AF 6 47 konjuge anti-insan IgG ikincil antikor bağlanması ile ilişkili MFI, insan serumlarını analiz ederken arka plan floresansını ortadan kaldırmak için ölçüldü.

Delta MFI, kontrol hücrelerinin arka plan MFI'si çıkarılarak hesaplandı. Bu akış sitometrisi hücre bazlı test, ilgilenilen hücre yüzeyi antijeninin antikor tespitine dayanır. Örneğin, N-M-D-A-R için ekspresyon plazmidi ile transfekte edilen a GK 2 93 hücreleri, yüzey ve metil de reseptörünün yüksek ekspresyonunu gösterdi.

Benzer şekilde, D iki R transfekte edilmiş hücreler dopamin iki reseptörünü eksprese ederken, kontrol edilen hücreler bu antijenlerin hiçbirini eksprese etmedi. Bu klinik çalışma, N-M-D-A-R ensefalitli bir hasta kohortunu, D iki R antikoru ile ilişkili ensefalitli bir hasta kohortunu ve diğer inflamatuar olmayan nörolojik hastalıkları olan bir kontrol kohortunu değerlendirdi. Pozitif hastaların hiçbirinin antikorlar için çift pozitif olmadığını unutmayın.

Beklendiği gibi N-M-D-A-R-M-D iki R'yi hedefliyor. N-M-D-A-R ve D iki R antikorları analiz edilen kontrollerin hiçbirinde tespit edilmedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, geliştirildikten sonra yaklaşık 80 numune için bir saatlik akış alımı ile beş saat içinde düzgün bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, nöroimmünoloji alanındaki araştırmacıların immün aracılı bozukluklarda yeni antikor hedefleri keşfetmelerinin yolunu açtı.