Enzim replasman terapileri ile hücre tabanlı tahlil hücresel alımını nötralize antikorların tespiti

Bu yöntem, nötralize edici antikorların ilaç güvenliği, etkinliği ve farmakokinetik ve farmakodinamik profiller üzerindeki etkisi hakkında immünojenisite ve biyoanalitik alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilaca özgü nötralize edici antikorları yarı kantitatif bir şekilde ölçmek için hassas ve biyolojik olarak ilgili hücre bazlı bir yöntem sağlamasıdır. Bu teknikte, florofor etiketli enzimler, bir mannoz-6-fosfat kalıntısının Katyondan Bağımsız Mannoz-6-Fosfat Reseptörüne veya CI-M6PR'ye bağlanması yoluyla Jurkat hücrelerine girer.

Enzim reseptör etkileşimini önleyen nötralize edici antikorlar, akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi floresansta bir azalmaya neden olur. Başlamak için, 37 santigrat derecede 14 ila 20 saatlik bir inkübasyon için 96 oyuklu yuvarlak tabanlı hücre kültürü plakasında oyuk başına 100 mikrolitre hücre büyüme ortamında 7,5 kez 10 ila dördüncü Jurkat hücresine tohum atın,% 95 nem ile% 5 karbondioksit. Tahlil örneklerini önce serum içermeyen ortamda bir ila 2.5 oranında seyreltin.

Daha sonra, 96 oyuklu beyaz yuvarlak tabanlı bağlayıcı olmayan bir polipropilen plakanın uygun kuyucuklarına her numuneden 60 mikrolitre ekleyin. Bu numune inkübasyon plakası olacaktır. Pozitif taranan ve onaylanması gereken numuneler için, bir şişe Enzim Replasman Tedavisi veya ERT boncukları girdaplayın ve başka bir girdap için 15 mililitrelik konik bir tüpe uygun sayıda boncuk ekleyin.

Ardından tüpü iki dakika boyunca manyetik bir tüp rafına yerleştirin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Dördüncü yıkamadan sonra, yeni bir beyaz 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bağlayıcı olmayan polipropilen plakanın uygun kuyucuklarına 100 mikrolitre boncuk ekleyin. Tüm boncuklar kaplandığında, plakayı 96 oyuklu yan etekli bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve şeffaf süpernatanı dikkatlice çıkarmadan önce boncukların bir pelet oluşturmasına izin verin.

Daha sonra, her numuneden 140 mikrolitreyi uygun kuyucuklara ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 800 RPM'de döner bir çalkalayıcı üzerinde en az 60 dakika çalkalamak için plakayı plastik film ile kapatın. Ardından, boncukların başka bir pelet oluşturmasına izin vermek için doğrulayıcı plakayı 96 oyuklu yan etekli mıknatısın üzerine yerleştirin ve 60 oyuklu beyaz yuvarlak dipli bağlayıcı olmayan polipropilen numune inkübasyon plakasının uygun kuyucuklarına 96 mikrolitre numune ekleyin. Taranmış ve pozitif olduğu teyit edilmiş numuneler için bir titre serisi gerçekleştirilebilir.

Bir titre serisi hazırlamak için, önceden belirlenmiş titre kesme noktasını geçmek için havuzlanmış matristeki numuneyi yeterli sayıda seri olarak seyreltin ve her seyreltilmiş numuneden 60 mikrolitre numune inkübasyon plakasının uygun kuyucuklarına ve 60 mikrolitre uygun konsantrasyonlarda florofor etiketli ERT'yi metin protokolüne göre yeni bir 96 oyuklu beyaz yuvarlak tabanlı bağlayıcı olmayan polipropilen plakanın uygun kuyucuklarına ekleyin. Ardından, iki ila sekiz santigrat derecede 14 ila 20 saatlik bir inkübasyon için plakaları karıştırmak ve folyoya sarmak için florofor ERT numune çözeltisini birkaç kez pipetleyin. Ertesi sabah, numune plakalarını 37 santigrat derece boncuk banyosunda 10 ila 15 dakika ısıtın ve hücrelerin sağlıklı olduğunu ve kuyucuklara eşit olarak dağıldığını doğrulamak için kaplanmış hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskopta kontrol edin.

Plakalar ısındığında, deneysel plaka haritasına göre hücre plakasına 100 mikrolitre numune ve florofor etiketli ERT karışımı ekleyin ve hücreleri üç saat 15 dakika daha hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Kuluçka işleminin sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve her bir oyuğun dibinde bir pelet varlığını onaylayın. Plakayı 30 ila 45 derecelik açıyla tutarak, peletleri rahatsız etmeden her bir oyuktaki süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri santrifüjleme başına kuyu başına 200 mikrolitre DPBS'de üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için her bir oyuğa 100 mikrolitre canlı ölü leke ekleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve hücreleri kuyu başına 200 mikrolitre DPBS ile yıkayın. Yıkanmış peletleri oyuk başına 100 mikrolitre iki ila sekiz santigrat derece %1 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin ve hafif nabız girdabı için plakayı kapatın.

Ardından, iki ila sekiz santigrat derecede 10 dakikalık bir sabitleme için plakayı folyoya sarın. Akış sitometrisi ile hücre canlılığını analiz etmek için, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri oyuk başına 50 mikrolitre DPBS ile karıştırın ve hücreleri standart akış sitometrisi protokollerine göre bir akış sitometresinde okuyun. Florofor konjuge ERT alımı daha sonra canlı tek hücrelerin Medyan Floresan Yoğunluğuna veya MFI'sine göre değerlendirilebilir.

Tahlilde test edilmeden önce, pozitif ve negatif numunelerin belirlenmesi için bir eşik olarak deneysel bir tarama kesme noktası hesaplanır. Bu örnekte, yüksek veya düşük miktarlarda nötralize edici antikorlarla çivilenmiş kalite kontrolleri gösterilmektedir. Pozitif numuneler daha sonra numunelerden ilaca özgü antikoru tüketmek için ilaç konjuge manyetik boncuklar kullanılarak doğrulayıcı bir testte test edilir.

Doğrulayıcı kesme noktasından daha büyük bir geri kazanım oranına sahip numuneler pozitif olarak kabul edilir. Taranan ve pozitif olduğu teyit edilen numuneler seri olarak seyreltilir ve her bir numunedeki nötralize edici antikorların nispi titresini belirlemek için titre testinde test edilir. Titre, titre kesme noktasını geçen iki seyreltme arasındaki enterpolasyonlu değerdir.

Burada gösterilen, canlı tek hücreli MFI'ler florofor konjuge ERT alımını değerlendirdi. Örneğin, bu deneyde, pozitif kontrol antikoru ile sivrilen matris, florofor konjuge ERT alımını inhibe etti ve bu da düşük bir medyan floresan yoğunluğu ile sonuçlandı. Buna karşılık, pozitif kontrol antikorunun yokluğunda matris ile inkübe edilen hücreler, florofor konjuge ERT'nin alımını gösteren daha yüksek bir medyan floresan yoğunluğu sergiledi.

Bu prosedürü denerken, güvenilir ve tutarlı sonuçlar elde etmek için sıkı inkübasyon pencerelerini korumayı unutmamak önemlidir. Her enzim replasman tedavisi için testi optimize etmek de önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre alımını nötralize eden antikorların ERT güvenliği ve etkinliği üzerindeki etkisini araştırmak için ilaç geliştirmede immünojenisite ve biyoanalitik bilim adamlarının yolunu açtı.

İnsan numuneleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken tüm numunelerin potansiyel olarak bulaşıcıymış gibi ele alınması gerektiğini unutmayın.