Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, iç çapları 20 ila 100 mikron arasında olan aynalama intrapulmoner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonunu analiz etmektir. Bu, önce akciğerlerin hava yollarının düşük erime noktalı aros ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, izole edilmiş akciğerleri 200 mikron kalınlığında dilimler halinde kesmek için bir vibratör kullanmaktır.

Daha sonra, aros, normoksik gazla köpürtülen 37 santigrat derece, ılık ortamda inkübasyon yoluyla akciğer bölümlerinden çıkarılır. Böylece bölümler sıvı içinde yavaş hareket eder. Daha sonra ayrı bir akciğer bölümü süperfüzyon odasından bir akışa aktarılır, ardından enine kesitli arterin vazo reaktivitesinin video morfometrik analizi yapılır.

Sonuçta, farklı tedavilere yanıt olarak damarın lümen bölgesindeki değişiklikler değerlendirilir. Bu tekniğin, izole proksimal pulmoner arterlerde vasküler gerginliğin ölçülmesi, subplevral mikro damarların intra vital mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çapları 20 ile 100 mikrometre arasında olan intrapulmoner arterlerin VA reaktivitesinin kantitatif analizine izin vermesidir. Prosedürü göstermek için Anna Goldenberg ve bu laboratuvarın iki teknisyeni olacak.

Bir fareyi servikal çıkık ile öldürdükten hemen sonra, karın boşluğunu açın, bağırsak halkalarını bir kenara getirin ve kanama için büyük karın damarlarını kesin. Ardından, diyaframa nüfuz etmek için ince makas kullanın. Bu, plevral boşluğa hava girişinin bir sonucu olarak akciğerlerin çökmesine neden olur.

Diyaframı alt torasik açıklıktan ayırmak için kesmeye devam edin. Şimdi kaburgaları ve köprücük kemiğini yanlamasına kesin. Göğüs kafesinin ventral kısmını çıkarmak için timusu çıkarın.

Bir şırıngayı ılık perfüzyon tamponu ile doldurun. Sonra, kalbin sol ventrikülüne küçük bir delik açın. Perfüzyon tamponunun çıkışını ayarlayın ve akciğerler beyaz görünene kadar pulmoner vaskül sistemini sağ ventrikül üzerinden yavaşça perfüze edin.

Ardından, tükürük bezlerini, küçük kasları ve bağ dokusunu trakeadan çıkarın. Trakeayı çevredeki bağ dokusundan ayırın ve daha sonra ligasyon için yemek borusu ile trakea arasına bir parça dikiş pamuğu yerleştirin. Ardından, iki komşu trakeal kıkırdak arasında trakeanın üst kısmına küçük bir delik açmak için bir mikro makas kullanın.

Bir şırıngayı 37 santigrat derece, ılık, düşük erime noktalı agros ile doldurduktan sonra, esnek bir plastik kanüle bağlayın ve kanülden hava çıkana kadar pistonu yavaşça itin. Kanülü soluk borusundaki küçük deliğe yerleştirin ve dikiş pamuğu ile dikkatlice yerine sabitleyin. Ardından, hava yollarını yavaşça aros ile doldurun ve akciğerleri gözlemleyin.

İlk başta sağ akciğer genişlemeye başlar, ardından sol akciğer gelir. 30 ila 40 saniye sonra, doldurma tamamlanır ve her iki akciğer, yaklaşık 1.2 ila 2.0 mililitre olan in vivo durumla karşılaştırılabilir bir hacme şişirilir. Cinsiyete, yaşa ve kiloya bağlı olarak, Yumurta gülünü işlem sırasında katılaşmayacak kadar hızlı enjekte etmek, ancak akciğerlere zarar verecek kadar hızlı olmamak önemlidir.

Akciğerler aynı anda doldurulduktan sonra, plastik kanülü dışarı çekin ve arosların sızmasını önlemek için trakeayı dikiş pamuğu ile bağlayın. Daha sonra soluk borusunu bağın üzerinden kesin ve akciğerleri ve kalbi göğüsten blok halinde ayırmak için, beklerken birkaç dakika içinde gerçekleşen agrosları katılaştırmak için organları buz gibi soğuk yığınlar zil tamponuna aktarın. Akciğer dokusu için bir eğrilik görevi görmesi için vibratörün numune tutucusuna bir parça şampanya mantarı takmak için süper yapıştırıcı kullanın Agros katılaştıktan sonra, tek tek akciğer loblarını ayırın.

Sonraki süper yapıştırıcı, numune tutucuya bir lob. Küçük intra asner arterlerin enine kesitlerini elde etmek için, sağ akciğerin kraniyal lobunu alın ve akciğer lobunu 200 mikron kalınlığında dilimler halinde keserek, çevreden dilimlenmiş yeni bir tıraş bıçağı ile donatılmış bir vibrato kullanarak hilum yüzeyi ile tutucuya süper yapıştırın. Daha büyük pre aser arterlerin enine kesitlerini elde etmek için, sol akciğerin hilumunu şampanya mantarı ile hizalayın ve lobu bu yönde tutucuya yapıştırın, ardından aroların çıkarılması için çevreden dilimleyin.

Organ bölümlerini yaklaşık 200 mililitre 37 santigrat derece ile doldurulmuş bir cam behere aktarın. MEM, kabı bir ısıtma kabinine koydu ve akciğer bölümlerinin ortamda yavaşça hareket etmesi için normoksik gazla köpürtüldü. Yaklaşık iki saat sonra havayı dolduran aros plakları akciğer dokusundan çıkarılmış ve bölümler beherin dibine yerleşmiş olacaktır.

İntrapulmoner arterlerin video morfometrik analizi için, bir akciğer bölümünü, bir mikroskop üzerine monte edilmiş ve 1.2 mililitre normoksik gaz ile doldurulmuş süperfüzyon odasından akışa aktarın. MEM. Akciğer bölümünü odanın altına bir platin halkaya bağlı naylon iplerle sabitleyin. Odayı normoksik gazlı ortamla perfüze etmeye başlayın.

İç çapları 20 ila 100 mikron arasında olan kesitli arterler için akciğer bölümünü taramak için 10 x objektifli bir faz kontrast mikroskobu kullanın. Makul bir aday damar bulunduktan sonra, bir ön yükseltici damarın fotoğrafını çekmek için 20 x objektifi veya burada gösterildiği gibi, damarın iç çapının ölçümü için bir intra asner arterin resmini çekmek için 40 x objektifi kullanın. Deneye başlamadan önce, yazılımı tüm deney boyunca her dakika enine kesitli arterin fotoğraflarını çekecek şekilde ayarlayın.

Fotoğrafı tetikledikten sonra, odanın normoksik gaz ortamı ile perfüzyonuna 10 dakika boyunca devam edin. Daha sonra akciğer bölümünü U 466 19'da yıkayın ve arterin kasılmasını analiz etmek için arterin kasılmasını analiz etmek için sadece lümen alanları en az% 30 oranında azalmış damarları kullanarak U 466 19'da 19 dakika boyunca yıkayın. İlacı 10 dakika boyunca normoksik gaz ortamı ile yıkayın.

Daha sonra arteri 10 dakika boyunca res uygulayarak akış düşük olmadan genişletin. Yine, ilacı dakikada altı mililitre akış hızında normoksik gazlı ortam ile 10 dakikalık bir yıkama ile çıkarın, ardından dakikada 0.7 mililitre akışta 10 dakika izleyin. Daha sonra, akciğer dilimini yüksek hipoksik gazlı ortam ile 40 dakika inkübe edin.

Ayrıca hipoksik gaz karışımını ek bir boru seti aracılığıyla perfüzyon odasının hava sahasına akıtın. Hipoksik besiyerini normoksik gazlı besiyeri ile 20 dakikalık bir yıkama ile çıkarın ve kabın canlılığını kontrol etmek için haznenin hava sahasına hipoksikten normoksik gaz akışına geçin. Deneyin sonunda, U 466 19'u perfüzyon odasına uygulayın ve vazokonstriksiyonu indüklemek için akış olmadan 20 dakika inkübe edin.

Başka bir damarın vazo reaktivitesini ölçmek için bu adımları yeni bir akciğer bölümü ile tekrarlayın. Enine kesitli arterlerin görüntülerini bir görüntü analiz programına yükleyerek analize başlayın. Ardından, kabın luminal alanını ana hatlarıyla belirtmek için bir imleç kullanın.

Elde kurutma, örneğin damar duvarına bağlı kan hücrelerinden kaynaklanan artefaktları önlediği için gereklidir. Kesit görüntülerini benzer şekilde analiz etmeye devam edin. İnkübasyon odasından geçen akıştaki bir koşul diğerine değiştirildiğinde her görüntü analiz edilmelidir, ancak koşullar değişmediğinde diğer her görüntüyü analiz etmek yeterlidir.

Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon, enine kesitli bir bronşun yakınında uzanan enine kesitli bir pre ASIN arterin bu faz kontrast görüntülerinde gözlenebilir. Resimler, ölçümün başlangıcında grafikte dairelerle gösterilen zaman noktalarında çekilir, ölçümün sonunda U 466 19 ile ölçümün sonunda, normoksik gazlı ortamla yıkandıktan sonra hipoksik gazlı ortamda 30 veya 40 dakika sonra RA'lara maruz kaldıktan sonra ve U 466 19'un son uygulamasından sonra vazo reaktivite, enine kesitin luminal alanının nispi değişiklikleri olarak kaydedilir zamana karşı atardamar. Deneyin başlangıcındaki alan %100 olarak tanımlanır ve vazokonstriksiyon başlangıç alanına göre değerler olarak verilir.

Bu durumda, hipoksiye maruz kalma, hipoksik yanıtın daha net bir sunumu için luminal alanda% 60'lık bir azalmaya neden olur. Vasal reaktivitenin test edildiği deneyin ilk aşaması burada gösterilmemiştir ve indirgenmiş oksijene maruz kalmadan hemen önce elde edilen değer %100 olarak ayarlanmıştır. Bu çalışmalarda incelenen diğer damar tipi, alveolar septa köşebentlerinde bulunan intra ASIN arterleridir. Bu deney setinde, mitokondriyal A TP'ye duyarlı potasyum kanallarının seçici olmayan bir açıcısı olan sidal'in küçük intra asner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonu üzerindeki etkisi bu amaçla analiz edilmiştir.

Dilimler hipoksik ortamda inkübe edilir. 50 mikromolar sidal kontrolün yokluğunda veya varlığında, normoksi veya hipoksi veya hipoksi artı sidal yanıtın daha net bir sunumu için normoksik gaz ortamında inkübasyonlar gerçekleştirilir. Normolik veya hipoksik gaz ortamına maruz kalmadan hemen önce elde edilen değerler %100 olarak ayarlanmıştır. Pineal'a maruz kalan arter, katkı maddesi olmadan hipoksik ortamda inkübe edilen arter gibi alanda bir azalma göstermez.

Normodik ortamda, luminal alanda herhangi bir değişiklik tespit edilemez. 50 mikromolar sidal olan veya olmayan hipoksik gaz ortamına maruz kalan küçük intra ASIN arterlerin kayıtları artı veya eksi SEM olarak sunulur. Bu grafikte, hipoksik inkübasyonun başlangıcındaki değere ilişkin göreceli veriler gösterilmektedir.

Hiçbir vaso reaktivitesi tespit edilemez. Hipoksik gaza maruz kalan akciğer dilimlerinde, U 466 19'un neden olduğu besiyeri içeren pineal vazokonstriksiyon ilaçtan etkilenmez. Bu videoyu izledikten sonra, ayna hassasiyetinin nasıl hazırlanacağını, akciğer dilimlerinin nasıl kesileceğini ve bunların alveolar septa gazlarında bulunan çapları 20 ila 40 mikrometre arasında olan küçük intra asina arterlerin ve çapları 40 ila 100 mikrometre arasında olan daha büyük pre Athena arterlerinin VA reaktivitesinin kantitatif ölçümü için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bronchi ve Bronchioli'nin bitişiğinde çalışır.