Name: Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Öğrenin, hassas kesim akciğer dilimleri kullanarak fare pulmoner arterlerinde hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonu videomorfometrik olarak nasıl analiz edilir. Bu yöntem, 20-100 mikrometre çapındaki damarların vazoreaktivitesini nicel olarak değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Excellence Cluster Kardiyo-Pulmoner Sistemi tarafından desteklenmektedir.

1. Gaz Karışımlarının, Ekipmanlarının, Aletlerinin ve Çözümlerinin Hazırlanması
Bu bölümde protokol için gerekli donanım ve kurulum açıklanmaktadır. Ek ayrıntılar ve üretici bilgileri eşlik eden tabloda bulunabilir.
<ol><li>Aşağıdaki gaz karışımlarını elde edin veya hazırlayın:<ol>
<li>% 21 O 2, % 5.3 CO2,% 73.7N 2'denoluşan normoksik gaz karışımına sahip iki şişe.</li>
			<li>% 1 O 2 , % 5.3 CO2,% 93.7 N2'denoluşan hipoksik gaz karışımına sahip bir şişe.</li>
		</ol></li>
	<li>Aşağıdaki ekipmanları toplayın:<ol><li>Agarose'un eriti için mikrodalga fırın.</li>
			<li>Agarose'un akciğer bölümlerinden yıkanması için bir ısıtma kabini (aşağıya bakın). Normoksik gaz karışımı olan bir şişeye bağlı bir tüpü kabine yerleştirin.</li>
			<li>Akciğerleri 200 μm kalınlığında dilimler halinde kesmek için uygun jiletlere sahip bir vibratom. Vibratom, vibratom havzasındaki tamponu soğutmak için bir soğutma seti ile döşenmişse avantajlıdır.</li>
			<li>İntrapulmoner arterlerin HPV analizi için ters mikroskop üzerine monte edilmiş bir akışlı süperfüzyon odası.<ol>
<li>Akciğer bölümlerinin odanın dibine sabitlenerek sabitlenmesini kolaylaştırmak için naylon telleri platin bir halkaya (kendi kendine inşa edilmiş) bağlayın. Perfüzyon haznesini, sırasıyla 0,7 ml/dk ve 6 ml/dk'ya ayarlanmış akış hızlarına sahip peristaltik bir pompaya birleştirin.</li>
					<li>Ekipmanı, deneyler sırasında ortam 37 °C'lik bir su banyosunda depolanacak ve 21 G x 4 3/4 kanül kullanılarak normoksik veya hipoksik gazla kabarmış olacak şekilde monte edin. Ayrıca, normoksik/hipoksik gaz karışımlarının perfüzyon odasının hava boşluğuna beslenmesini sağlamak için gaz şişesinden ikinci bir bağlantı kullanın. Bu sistemin tüm tüplerinin gaz geçirmez olduğundan emin olun.</li>
				</ol></li>
			<li>Analiz edilen arter görüntülerini kaydetmek için dik ters mikroskop üzerine monte edilmiş bir CCD kamera.</li>
			<li>Aşağıdaki enstrümanları hazırlayın:<ol>
<li>Akciğerlerin hazırlanması için: kaba bir makas ve iki çift forseps içeren steril bir diseksiyon seti, göğsün açılması için ince bir makas, agarose doldurmak için nefes borusuna bir delik kesmek için bir mikros makas ve agarose'un dışarı çıkışını önlemek için nefes borusunun kesilmesi için pamuk (yaklaşık 20 cm) dikmek.</li>
					<li>Hava yollarının agarose ile doldurulması için: IV indwelling canülün esnek plastik borusuna 2 ml şırınga bağlayın (20 G x 1 1/4).</li>
					<li>Akciğerlerin tampon ile perfüzyonu için: 50 ml'lik bir şırınnayı fare hazırlığı için çalışma yerinden yaklaşık 40 cm yukarıda bir tampon rezervuarı olarak sabitleyin.</li>
					<li>Tamponun çıkışı için: şırınnayı 25 G x 1 çanül takılı olan bir tüpe bağlayın. Çıkışı yaklaşık 1 damla / sn 'ye (yaklaşık 0,3-0,4 ml / dk) ayarlamak için tüpte bir kelepçe kullanın.</li>
				</ol></li>
			<li>Aşağıdaki arabellekleri ve ortamları hazırlayın:<ol>
<li>1.000 ml HEPES-Ringer tamponu yapın (10 mM HEPES, 136.4 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2.2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM glikoz, pH 7.4). Steril filtratlı tamponu (filtrenin gözenek boyutu: 0,2 μm) 4 °C'de saklayın.</li>
				</ol></li>
			<li>Akciğerlerin izolasyonu başlamadan yaklaşık 30 dakika önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:<ol>
<li>HEPES-Ringer tamponunda (toplam hacim 10 ml) %1,5 w/v düşük erime noktası agarose çözün ve mikrodalga fırında pişirerek eritin. Daha sonra, bir ısıtma kabininde depolayarak 37 ° C'ye kadar soğutin. Agarose'u pulmoner hava yollarına doldurmak için 2 ml şırıngayı önceden ısıtın.</li>
					<li>HEPES-Ringer tamponunun 20 ml'sini alın, 250 I.U./ml'lik son konsantrasyona heparin ekleyin ve tamponu 37 °C'ye ısıtın. Kullanımdan hemen önce, 75 μM'lik son konsantrasyona sodyum nitroprusside ekleyin. Bu pulmoner vaskültürden kan akması için perfüzyon tamponu.</li>
					<li>200 ml HEPES-Ringer tamponu cam bir kabın içine koyun ve buzda saklayın. Bu tampon, agarose dolu izole akciğerlerin soğutulması için gerekli olacaktır.</li>
					<li>Cam bir kabın içine% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş yaklaşık 200 ml MEM doldurun ve ısıtma kabininde 37 ° C'de saklayın. Ortamı normoksik gaz karışımı ile kabarcıklayın. Bu, agarose'un akciğer bölümlerinden çıkarılması için kullanılacaktır.</li>
					<li>37 °C'ye kadar bir su banyosunda% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 2 şişe MEM ve videomorfometrik ölçümlere başlamadan önce en az 2 saat boyunca sırasıyla normoksik ve hipoksik gaz karışımı ile kabarcıklayın. Ölçüm başına yaklaşık 250 ml MEM gerekecektir.</li>
				</ol></li>
			<li>Aşağıdaki ek malzemeleri toplayın:<ol>
<li>Dezenfeksiyon için% 70 EtOH.</li>
					<li>4 °C'de depolanan heparin stok çözeltisi (25.000 I.U./5 ml), (yukarıya bakın).</li>
					<li>NO donör sodyum nitroprusside (Nipruss) stok çözeltisi: H2O'da 10 mM, buz üzerinde saklanır (yukarıya bakın).</li>
					<li>Tromromboxane analog U46619 stok çözeltisi: Etanolde 10 μM, buz üzerinde saklanır.</li>
					<li>Süperglue.</li>
					<li>Agarose ile doldurulduktan sonra nefes borusunun ligasyonu için pamuk dikmek.</li>
				</ol></li>
		</ol></li>
</ol>2. Hayvanlar
10-25 haftalıkken her iki cinsiyetten fareleri (örneğin C57Bl6 suşu) kullanın. HPV ayrıca nakavt suşlarında ve buna karşılık gelen vahşi tip suşlarda da analiz edilebilir.
Tüm deneyler, deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine göre gerçekleştirildi ve yerel kurumsal kurullar tarafından onaylandı.
3. Murine Akciğerlerinin İzolasyonu ve Hassas Kesilmiş Akciğer Dilimlerinin Hazırlanması (PCLS)
<ol><li>Servikal çıkık ile fare öldürmek. Öldürdükten hemen sonra, ventral vücut yüzeyini% 70 EtOH ile sterilize edin ve cildi ventral orta hat boyunca çeneden pelvise kesmek için kaba makası kullanın. Not: izofluran gibi inhalatif anesteziklerin damar tonu üzerinde etkisi olduğu bilindiğinden18,19, uçucu anestezikler kullanmayın.</li>
	<li>Karın boşluğunun açılmasından sonra bağırsak halkalarını bir kenara koyun ve büyük karın damarlarını kanama için kesin. İnce makasla diyaframa nüfuz ettikten sonra, plevral boşluğa hava girişi sonucu akciğerler çökecektir. Diyaframı alt torasik diyaframdan ayırmak için makası kullanın. Rip kafesinin ventral kısmını çıkarmak için kaburgaları ve köprücük kemiğini yanal olarak kesin. Not: Aksi takdirde akciğerlerin agarose ile şişkinliği imkansız olacağından, akciğerlerin bu adımda zarar görmemesi önemlidir! Sadece steril aletler ve laboratuvar camları kullanın.</li>
	<li>Pulmoner vaskülatın perfüzyonuna başlamadan önce, tamponun boşalması için kalbin sol ventrikülüne küçük bir delik açın. Şırıng rezervuarını heparin ve sodyum nitroprusside (perfüzyon tamponu) içeren sıcak (37 °C) HEPES-Ringer tamponu ile doldurun ve pulmoner vaskülatını sağ ventrikülden yavaşça geçirin. Not: Akciğerler rengini değiştirip beyaz bir görünüme kavuştuğunda perfüzyon etkilidir. Bu adımda perfüzyon tamponuna sodyum nitroprusside eklemek önemlidir; bu, acinar öncesi arterlerin çevre dokudan kopmasını önler.</li>
	<li>Tükürük bezlerini, küçük kasları ve bağ dokusunu trakeadan çıkarın. Trakeayı çevredeki bağ dokusundan çıkarın ve daha sonra ligasyon için yemek borusu ile trakea arasında pamuk diken iplik.</li>
	<li>İki komşu trakeal kıkırdak arasında trakeanın üst kısmına küçük bir delik açmak için mikrossörü kullanın. Şimdi bir IV indwelling kanül esnek plastik boruyu küçük delikten nefes borusuna yerleştirin ve dikiş pamuğu ile dikkatlice sabitleyin. Hava yollarını yavaşça ılık (37 °C) düşük erime noktası agarose ile doldurun. Akciğerleri gözlemleyin: İlk başta sağ akciğer genişlemeye başlar ve ardından sol akciğer. Dolgu, her iki akciğer de in vivo durumla karşılaştırılabilir bir hacme şişirildiğinde tamamlanır (cinsiyete, yaşa ve ağırlığa bağlı olarak yaklaşık 1.2-2.0 ml). Not: Sadece bir akciğer genişlerse, plastik boru bronşlara ulaşacak şekilde çok derine yerleştirilmiş olabilir. Bu durumda, biraz çekilmesi gerekiyor. Agarose'un yavaş yavaş soğuduğunda katılasa iyileşeceğini unutmayın.</li>
	<li>Akciğerler dolduğunda, aynı anda plastik boruyu çekin ve agarose'un dışarı çıkmasını önlemek için nefes borusunu dikiş pamuğu ile bağlayın. Daha sonra, trakeayı ligatürün üstünde kesin ve akciğerleri ve kalbi göğüsten blok halinde ayırın. Not: Yeni başlayanlar için, ligasyon adımında bir meslektaşından destek istemek yararlı olabilir.</li>
	<li>Agarose katılaştırmak için organ paketini buz gibi HEPES-Ringer tamponuna aktarın. Bu birkaç dakika içinde olur.</li>
	<li>Tek tek akciğer loblarını ayırın ve vibratomun numune tutucusuna bir lobu süperglue ile sabitleyin. Not: Elastik akciğer dokusunun kesilmesi sırasında eğriltme görevi gören tutucuya bir parça şampanya mantarı yapıştırmak faydalıdır. Kullanılan akciğer lobuna ve numune tutucusuna olan yönelimine bağlı olarak, elde edilen PCLS küçük veya büyük damarların analizi için daha uygun olabilir. Çoğunlukla PCLS'nin hazırlanması için sol lob ve sağ kranial lob kullanıyoruz. Kesitli küçük acınar arterler elde etmek için, kranial sağ lobun hilum ile tutucuya yapıştırın ve çevreden dilimleyin. Kesitli ön-acinar arterleri almak için, sağ lobun hilum'u şampanya mantarı ile hizalayın.</li>
	<li>Akciğer lobını 200 μm kalınlığında dilimler halinde kesmek için taze jiletle donatılmış bir vibratom kullanın (hız: 12 = 1,2 mm/sn; frekans: 100; genlik: 1,0). PCLS'i 4 °C soğuk HEPES-Ringer tamponu ile dolu vibratom havzasında toplayın. Not: HEPES-Ringer'ın soğutularak kullanılması önerilir.</li>
	<li>Agarose'un çıkarılması için, organ bölümlerini yaklaşık 200 ml 37 °C sıcak MEM ile dolu bir cam kabın içine aktarın. Kabı, normoksik gaz karışımına sahip bir şişeye birleştirilmiş bir tüpün yerleştirildiği ısıtma kabinine koyun. MEM'i normoksik gazla kabartır, böylece akciğer bölümleri ortamda yavaşça hareket eder. Yaklaşık 2 saat sonra, hava sahalarını dolduran "agarose plakları" akciğer dokusundan çıkarılacaktır. Bu, bölümlerin artık ortamın üstünde yüzmediği, ancak kabın dibine yerleştiği gerçeğiyle tanınabilir.</li>
</ol>4. PCLS İntrapulmoner Arterlerinin Videomorfometrik Analizi
<ol><li>Pulmoner arterlerin videomorfometrik analizi için, bir PCLS'yi 1.2 ml normoksik gazlı MEM ile dolu akışlı süperfüzyon odasına aktarın. Odanın altındaki PCLS'yi platin halkaya bağlı naylon tellerle sabitleyin (dış/iç çap: 14/10 mm).</li>
	<li>PCLS'i mikroskobik olarak iç çapları 20-100 μm arasında olan kesitli arterler için tarayın. Not: Arterlerin lümenleri düz endotel hücreleri ile kaplıdır. Çevredeki düz kas hücreleri faz kontrast görüntüsünde lümen çevreleyen bir "koyu halka" olarak tanımlanabilir (Şekil 2'dekifaz kontrast görüntülerine bakın). Buna karşılık, hava yolları, plevral yüzeye giden yolda basit bir sütunlu epitel içine geçen başlangıçta sözde katmanlı sütunlu epitel ve ardından basit bir küboidal epitel ile tanımlanabilir. <ol>
<li>Her deneyin başındaki iç çapı ölçün. Not: Hafif eğik kesilmiş kaplarda, borulu yapının gerçek iç çapı lümenin en uzun eksenine 90° açıyla belirlenebilir. İç çapları 40 μm > büyük pre-acinar arterler bronşlara ve bronşiollere bitişik olarak çalışır. İç çapı 40 μm <küçük acınar içi arterler, alveolae ve alveolar kanalların yanında alveolar septa körüklerinde bulunur6.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Deneysel tasarım:<ol>
<li>Her deneye, odanın normoksik gazlı ortamla perfüzyona maruz olduğu bir "adaptasyon aşaması" ile başlayın (akış hızı: 0,7 ml/dk; 10 dk). Daha sonra, damarın canlılığını test edin: 10 μM U46619'un 12 μl ilavesi ile atardamarın kontrtilitesini analiz edin (son konsantrasyon 0.1 μM; 10 dk; akış yok). Not: Bu iş için, ışık alanı en az% 30 oranında azaldığında bir kap uygulanabilir olarak tanımlanır (ölçüm yöntemi için aşağıya bakın).</li>
			<li>İlacı normoksik gazlı orta (akış hızı: 6 ml/dk; 10 dk) ile yıkadıktan sonra, 10 mM Nipruss'un 3 μl'si (son konsantrasyon 25 μM; 10 dk; akış yok) uygulamasıyla arteri genişletin.</li>
			<li>Yine, ilacı normoksik gazlı orta (akış hızı: 6 ml / dk) ile 10 dakikalık bir yıkama ile çıkarın ve ardından 0.7 ml / dk'lık bir akışta 10 dk.</li>
			<li>PCLS'nin hipoksik gazlı orta ile inkübasyonu ile hipoksik pulmoner vazokonstriksiyona neden olun (akış hızı: 0.7 ml/dk; 40 dk). Ek bir tüp sistemi ile, hipoksik gaz karışımını perfüzyon odasının hava boşluğuna besleyin.</li>
			<li>Hipoksik ortamı normoksik gazlı ortamla 20 dakikalık bir yıkama ile çıkarın (akış hızı: 6 ml/dk).</li>
			<li>Her deneyin sonunda, vazokonstriksiyona neden olmak için perfüzyon odasına 1.2 μl 10 μM U46619 (son konsantrasyon 0.01 μM; 20 dk; akış yok) ekleyin. Not: Bu son adım, hipoksik yanıttaki bir değişikliğin (örneğin hipoksik fazda bir ilacın eşzamanlı olarak uygulanmasıyla veya nakavt fare zorlanmasından hazırlanan bir PCLS'de gözlemlenerek) hipoksi kaynaklı daralmaya özgü olup olmadığının veya kontrtiyak üzerindeki genel bir etkiyi yansıtıp yansıtmadığının belirlenmesine izin verir. 0,01 μM konsantrasyonu, önceki konsantrasyon-kasılma ölçümlerinde tahmin edilen U46619'un EC50 değerine karşılık gelir (yayınlanmadı).</li>
			<li>Perfüzyon odasının hava boşluğunda hipoksik gazlı MEM ve normoksik gaz karışımı yerine normoksik ile kontrol deneyleri yapmak için başka bir PCLS kullanın.</li>
		</ol>
</li>
</ol>5. Vasoreaktivitenin Analizi ve Grafik Sunumu
<ol><li>Uygun yazılımı kullanarak tüm deney boyunca her dakika kesitli arterden fotoğraf çekin.</li>
	<li>Uygun yazılım kullanarak, tam ekran resimler kullanarak iç sınırları elle astarlayarak damarların ışıklı alanının değişikliklerini değerlendirin. Not: Net grafikler elde etmek için her saniye resmi analiz etmek yeterlidir. Ancak, akışlı superfusion odasındaki bir koşul diğerine değiştirildiğinde, her resmi analiz edin. Kalan resimler, bir fotoğrafın analiz edilemeyeceği durumlarda yedek görevi görebilirsiniz. Ne yazık ki, bu zaman alıcı adım, ölçüm sırasında hareket eden damar duvarına bazen kan hücreleri takıldığından veya damarın mükemmel bir kesitinde değil, iç sınırların güvenilir bir lokalizasyonunun sadece görsel kontrol altında yapılabileceği teğetsel bir bölüm olduğundan, uygun programlardan değil, elle yapılmalıdır.</li>
	<li>Deneyin başında damar lümeni alanı için elde edilen değeri %100 olarak tanımlayın ve vazokonstriksiyon veya dilatasyonu bu değerin göreceli düşüşü veya artışı olarak ifade edin.</li>
	<li>Her deney için uygun yazılımı kullanarak zamana karşı göreli ışık alanını çizin.</li>
	<li>Birkaç deneyi özetlemek için, ortalamanın (SEM) zamana karşı göreceli parlak alanlarının +/- standart hatasının araçlarını çizin. Not: Çeşitli maddelerin hipoksi veya U46619 kaynaklı pulmoner vazokonstriksiyon veya nakavt fare suşlarının hipoksik yanıtı üzerindeki etkilerinin net bir sunumu için, geminin canlılığının test edildiği deneylerin ilk aşaması grafikten atlanabilir. Bu durumda, azaltılmış oksijene maruz kalmanın başlangıcında elde edilen değerler% 100 olarak tanımlanır.</li>
</ol>6. İstatistiksel Analiz
<ol><li>Kruskal-Wallis ve Mann-Whitney testi ile deneysel gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin, p≤0.05 önemli ve p≤0.01 oldukça önemli. Not: PCLS'nin hazırlanması ve operasyonel kullanımı hakkında ek bilgi için ayrıca bkz:20,21.</li>
</ol>

<ol><li>Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+features+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).</li>
<li>Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+roles+of+glycolysis+and+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+the+rat%3A+identity+of+the+hypoxic+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor.</a> J. Physiol. 536, 211-224 (2001).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).</li>
<li>Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+pulmonary+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).</li>
<li>Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cell+hypoxia%3A+role+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+signaling+in+triggering+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).</li>
<li>Paddenberg, R., König, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).</li>
<li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+II+is+essential+for+hypoxia-induced+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-+but+not+of+pre-acinar+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries.</a> Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).</li>
<li>Wang, L., Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+requires+connexin+40-mediated+endothelial+signal+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction.</a> J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).</li>
<li>Archer, S. L., Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+electrophysiologically+distinct+myocytes+in+conduit+and+resistance+arteries+determines+their+response+to+nitric+oxide+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and.</a> 78, 431-442 (1996).</li>
<li>Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+intra-acinar+pulmonary+microvessels+to+hypoxia%2C+hypercapnic+acidosis%2C+and+isocapnic+acidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis.</a> Circ. Res. 82, 722-728 (1998).</li>
<li>Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+contractile+response+of+pulmonary+artery+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+261%282+Pt%22%5BJournal%5D)">Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia.</a> Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).</li>
<li>Glazier, J. B., Murray, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sites+of+pulmonary+vasomotor+reactivity+in+the+dog+during+alveolar+hypoxia+and+serotonin+and+histamine+infusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion).</a> J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).</li>
<li>Bhattacharya, J., Staub, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+microvascular+pressures+in+the+isolated+perfused+dog+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung.</a> Science. 210, 327-328 (1980).</li>
<li>Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+assessment+of+pulmonary+vascular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).</li>
<li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li>
<li>Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+generation+and+hypoxic+vasoconstriction+in+buffer-perfused+rabbit+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs.</a> J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).</li>
<li>Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+alters+Ca2%2B+entry+pathways+activated+by+store-depletion+or+hypoxia+in+canine+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).</li>
<li>Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+constricts+bovine+pulmonary+arteries+by+release+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).</li>
<li>Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+inhibits+endothelium-mediated+nitric+oxide+relaxing+pathways+in+the+isolated+perfused+rabbit+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung.</a> Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Davies, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+J+%22Replacing+Animal+Models%3A+A+Practical+Guide+to+Creating+and+Using+Culture-based+Biomimetic+Alternatives+%28Google+eBook%22">Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook</a>. , John Wiley & Sons. 57-68 (2012).</li>
<li>Müller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermedin+stabilized+endothelial+barrier+function+and+attenuated+ventilator-induced+lung+injury+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice).</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Universities+Federation+for+Animal+Welfare%22%5BJournal%5D)">The Principles of Humane Experimental Technique.</a> Universities Federation for Animal Welfare. , Wheathampstaed, UK. (1959).</li>
<li>Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+airway+and+vascular+responses+in+murine+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of airway and vascular responses in murine lungs.</a> Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).</li>
<li>Köhler, D., Schönhofer, B., Voshaar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumologie%3A+Ein+Leitfaden+f%C3%BCr+rationales+Handeln+in+Klinik+und+Praxis%5BTitle%5D)+AND+%22Thieme+Verlag%22%5BJournal%5D)">Pneumologie: Ein Leitfaden für rationales Handeln in Klinik und Praxis.</a> Thieme Verlag. , 198-19 (2009).</li>
<li>Will, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pulmonary+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22in+Health+and+Disease.+Elsevier+Science%2C+p49%22%5BJournal%5D)">The Pulmonary Circulation.</a> in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).</li>
<li>Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+endothelium+dependent+vasodilation+emerges+after+birth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice.</a> Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).</li>
<li>Wright, J. L., Churg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+exposure+to+cigarette+smoke+induces+endothelial+dysfunction+in+small+intrapulmonary+arteries%3A+analysis+using+guinea+pig+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices.</a> J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

İzole havalandırılmış ve perfüzyonlu fare akciğeri, pulmoner vasküler sistemin oksijen kaynağındaki değişiklikler üzerindeki fizyolojik yanıtının analizi için mükemmel bir modeldir ve diğerlerinin yanı sıra pulmoner arteriyel basıncın sürekli ölçümüne izin sağlar1. Bununla birlikte, bu model hipoksiye en güçlü yanıtı gösteren vasküler segmentlerin tanımlanmasına ve analizine izin vermez. Bu, iç çapları 20-100 μm olan bireysel arterlerin HPV'nin ölçülmesine kolaylaştıran PCLS videomorfometrik analizimizin avantajıdır. Hücre kültürü sistemlerinin aksine, tüm hücre tipleri orijinal doku matrisi yapılandırmalarında bulunur. Ayrıca, bir akciğer birçok PCLS'nin hazırlanması için yeterlidir, böylece en azından kısmen deneyler aynı fareden bölümlerin kullanılmasıyla standartlaştırılabilir. Russell ve Burch23'ün 3R konseptine (yaşam bilimlerindeki laboratuvar hayvanlarının azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi) göre, bu gerçek PCLS kullanımını da savunuyor.
Bununla birlikte, örneğin Kübler ve ark. 14 artık mümkün değil.
Başlangıçta, PCLS esas olarak biyokimyasal, farmakolojik ve toksikolojik çalışmalar için uygulanmıştır, ancak bu arada bronş kontraktilitesi, mukoziyel fonksiyon ve vasküler yanıtların ölçümü için de kullanılırlar (incelemeler için bkz: Sanderson20 ve Davies21). Held vd. izole perfüzyonlu ve havalandırılmış fare akciğeri ve PCLS24modellerini karşılaştırdıkları bir çalışma gerçekleştirmişlerdir. Hava yolları ve pulmoner damarların çeşitli endojen mediatörlere verdikleri yanıtların analizi ile tüm akciğerin önemli özelliklerinin PCLS'de korunduğunu buldular.
PCLS'de hipoksik durumlar sağlam akciğerde olduğu gibi hava yolları üzerinden değil, hipoksik gazlı ortamda akciğer bölümünün inkübasyonu ile ortaya çıkarken ortaya çıkarken ortaya çıktı. %1 O 2 ,%5,3CO 2 , %93,7 N2ve%21O2 , %5,3 CO2 , %73,7 N2ile pregazsed ortamın oksijen kısmi basıncını (pO2)bir kan gazı analizörü kullanarak analiz ettik. Perfüzyon odasına beslemeden hemen önce, hipoksik gazlı MEM'in pO2'si 40 mmHg ve normoksik gazlı orta 160 mmHg6idi.  Sağlam akciğerDE HPV, alveolar pO2 50 mmHg25'inaltına düştüğünde indüklenmiştir, hipoksik gazlı ortamın uygulanmasıyla açıkça taklit edilebilen bir durumdur. HPV'nin kapsamına ilişkin verilerimiz, farklı bir deneysel yaklaşımla elde edilen sonuçlarla iyi eşleşir. Yamaguchi ve ark. 20-30 μm çapındaki mikrovesselleri gerçek zamanlı konfokal lazer tarama lüminesans mikroskopisi ile incelemek için izole fare akciğerleri uyguladık, bir görüntü yoğunlaştırıcı10ile yüksek hassasiyetli bir kameraya bağlanmıştır. Akciğerlerin hipoksiye maruz kalmasından sonra çaplarında ortalama 2,7 μm azalma gözlemlediler. Sistemimizde ölçtükçe ışık alanının% 20 azalmasının çapının yaklaşık% 15'ine karşılık geldiği hesaplanabilir.
Deneylerimizde arterleri sırasıyla 40-100 μm ve 20-40 μm iç çaplarına sahip ön ve acinar damarlar olarak sınıflandırdık. İnsanlarda kaslardan nonmüsküler arterlere geçiş 70-100 μm çap aralığında gerçekleşir. Farelerde, düz kas hücreleri 20 μm26dış çapa kadar bulunur. Bu nedenle, çapı 20 μm'nin altında olan arterleri analiz etmek mümkün değildir, çünkü faz kontrast görüntüsüne göre güvenilir olarak tanımlanamaz. Ölçeğin diğer ucunda, çapları 100 μm'nin üzerinde olan damarlar PCLS'de bulmak zordur ve genellikle çevre dokudan çıkarılır.
Aslında, bir dizi moleküler aday moleküler oksijen sensörü(ler) veya HPV ile sonuçlanan sinyal basamaklamanın bir bileşeni olarak tartışılmaktadır (inceleme için bkz. 4). Uygun nakavt fareleri mevcut olduğunda, vahşi tip hayvanlara kıyasla pre-ve intra-acinar arterlerin vasoreaktivitesinin analizi için videomorfometri kullanılabilir. Bununla birlikte, PCLS diğer sorunlar için de kullanılmıştır: Faro ve ark. doğumdan sonra akciğerde endotel bağımlı genişleme gelişimini karakterize etmek için onları istihdam29 ve 2 hafta boyunca günlük duman veya havaya maruz kalan kobaylardan hazırlanan PCLS, endotel disfonksiyonunun indüksiyonu yoluyla sigara dumanının vasoreaktivite üzerindeki etkisini göstermek için kullanılmıştır30.
Protokol içinde kritik adımlar
Deneylerimizde arterleri ön-acinar (40-100 μm iç çapları) ve intra-acinar (20-40 μm iç çaplar) olarak sınıflandırdık. Özellikle daha büyük damarların analizi için kullanılması gereken akciğer bölümlerinin hazırlanması için perfüzyon tampona sodyum nitroprusside eklenmesi önemlidir. Bu ilaç, numune hazırlama sırasında damarların kasılmasını ve böylece eksik vazodilasyona yol açan çevre dokudan koparılmalarını önler. Perfüzyon tamponundaki sodyum nitroprusside, alveolar septaya güçlü bir şekilde tutturuldukları için küçük arterlerin analizi için kullanılması gereken akciğer bölümünün hazırlanması için çok önemli değildir.
Tüm deneyler arterlerin reaktivitesinin test edildiği inkübasyonlarla başlatılmalıdır. Nadiren, gemilerin yüklenicilere veya dilatörlere hiçbir yanıtının tespit edilemeyen akciğer preparatları elde ettik. Bunun nedenini bilmiyoruz: Akciğerlere doldurulan agarose hacminin çok büyük veya çok düşük olması olabilir, böylece organın PCLS'ye kesilmesi optimal değildi. Alternatif olarak, agarose'un aşılama prosedürü sırasında çok hızlı soğuduğu ve kesme stresine zarar verdiği düşünülebilir. Tek bir PCLS'de uygulanabilir bir arterin tespit edilememeyen bir durumda, bölümün atılması ve başka bir arterle değiştirilmesi gerekir.
Bir atardamarın uygulanabilirliğine ilişkin karar U46619'a verilen yanıta dayanarak verildi. U46619'un 0,1 μM konsantrasyonda uygulanması, bazı egzersizlerden sonra doğrudan ekrandaki görüntü dizisinde görülebilen bir vazokonstriksiyona neden oluyor. Vasoreaktivitede bazı farklılıklar olduğundan, ilaca maruz kalan akciğer bölümlerindeki vasoresponseyi ölçerek veya sırayla sadece ortama bir ilacın HPV üzerindeki etkisini araştırıyoruz.
Bireysel bir arterin HPV'si genellikle mikroskopta neredeyse hiç tespit edilemez ve ortalama olarak yaklaşık% 20-30'luk ışık alanının azalmasına neden olur. Bununla birlikte, bir arterin çapındaki küçük değişiklikler akış direnci üzerinde belirgin bir girişe sahiptir. R=direnç ve r=radius ile "R = 1/r4" denklemine göre, akış direnci yarıçapın dördüncü gücüyle ters orantılıdır. Bir örnek vereyim: 40 μm (r=20 μm) çapında dairesel bir kesit sergileyen "ideal arter" yaklaşık 1.260 μm2ışık alanına sahiptir. Işıklı alan % 20 azaldığında, geminin çapının% 10,5 oranında azaltılarak 35,8 μm'ye (r=17,9 μm) düşürüldüğünü hesaplayabiliriz. Yukarıda verilen denkleme göre, bu geminin akış direnci 6.25 x 10-6'dan 9.71 x 10-6'ya yükselecekti, bu da yaklaşık% 55'tir. Işıklı alanın% 30 azaltılması durumunda yarıçap yaklaşık% 16 azalır, ancak akış direnci yaklaşık% 100 artar. Bu hesaplamalar, laminer bir kan akışının ve sert bir borunun damar formunun, çapın zaten küçük değişikliklerinin akış direnci üzerindeki etkisini düşündürücü olduğu varsayılabilen bir aşırı basitleştirme olmasına rağmen.

Çoğu sistemik vasküler yatakta hipoksi, pulmoner vaskülürdeki hipoksinin neden olduğu vazokonstriksiyona kıyasla vazodilatasyona neden olandır. Düşük oksijen gerilimine akciğere özgü bu yanıta hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon (HPV) denir, saniyeler içinde geçer ve normoksik ventilasyona geri döndükten sonra hızlı bir şekilde tersine döner. HPV 60 yıldan fazla bir süredir bilinmesine rağmen, hücresel oksijen sensörleri ve vazokonstriksiyonla sonuçlanan sinyal basamaklamaları hala tartışilmektedir. Hipoksi ile çağrıştırılan redoks ve ROS değişikliklerinin HPV ve pulmoner hipertansiyon gelişimi için gerekli olduğu konusunda göreceli geniş bir fikir birliği vardır (Sylvester ve ark.'da gözden geçirilmiştir). 4 ve Schumacker ve diğerleri. 5). Kendi verilerimiz HPV6,7'demitokondriyal solunum zincirinin karmaşık II'nin merkezi bir rolünü desteklemez. Son zamanlarda, Wang ve ark. oksijen algılama ve HPV için tamamen yeni bir kavram sundu: Verilerine dayanarak, alveolar hipoksinin endotel hücrelerinin membran depolarizasyonuna neden olan bitişik kılcal damarlar tarafından algılanmasını önermektedirler. Yanıt, endotel hücrelerinin konnexion 40 boşluk birleşimleri ile yayılır ve yukarı akış arteriyüllerinin düz kas hücrelerinin daralmasına yol açar8.
Akciğerin atardamarları hava yollarının yanında çalışır, onlarla birlikte dallanma, çapı sürekli azalır ve son olarak alveolar duvarlarda bulunan kılcal sisteme kan sağlar. Bu arteriyel dolaşım anatomik ve fonksiyonel olarak farklı segmentlerden oluşur. Duvarlarda bol miktarda elastik lif ile karakterize proksimal kanal arterlerini, pulmoner vasküler direnci büyük ölçüde kontrol eden tamamen kaslı intra-pulmoner arterler izler. Adım adım, bu arterler kas tabakasının eksik kaldığı segmentlere geçer ve son olarak damarlar düz kas aktüen-immünreaktif hücrelerden arındırılır. Bireysel pulmoner acinus'u kanla besleyen intra-acinar arter kısmen kas segmentini temsil eder6. Aynı şekilde, pulmoner arteriyel sistem hipoksik yanıtla ilgili tekdüze bir yapıyı temsil etmez, ancak bölgesel çeşitlilik9,10olarak işaretlenmiştir. Örneğin, sıçan akciğerlerinden izole edilen proksimal pulmoner arterlerde hipoksi bifazik bir yanıta neden olur ve kısa süreli ilk hızlı kasılma gösterir - eksik gevşemeden sonra - ikinci bir yavaş ama sürekli kasılma11. Sıçan akciğer parenkiminden dördüncü ve beşinci pulmoner arterler (dış çap <300 μm) olarak izole edilen direnç arterlerinde hipoksi monofazik daralmaya neden olur9. Zaten 1971'de Glazier ve Murray, hipoksik gaz karışımlarıyla havalandırılan köpeklerin akciğerlerindeki kılcal kırmızı kan hücresi konsantrasyonundaki değişikliklerin ölçümlerinden, vasküler dirençteki hipoksi kaynaklı artışın esas olarak kılcal damarların yukarı akışında meydana geldiği sonucuna vardı12. Günümüzde, anestezi ve mekanik olarak havalandırılan farelerin sağlam akciğerlerinin intravital mikroskopisi pulmoner mikrovasküler13,14'ünanalizi için güçlü bir aracı temsil eder. Torasik duvardaki dairesel bir pencerenin eksizyonu, akciğer yüzeyine mikroskobik erişim sağlar ve çapı 50 μm'ye kadar olan alt pulmoner damarların analiz edilmesini sağlar. Bu tekniği FITC-dektran infüzyonu ile birleştirerek, Tabuchi ve ark. sadece 30-50 μm çapındaki orta büyüklükteki arteriyoüllerin, 30 dk'dan sonra küçük bir zayıflama ile 60 dakikalık bir süre boyunca devam eden hipoksiye belirgin bir yanıt gösterdiğini göstermiştir. Buna karşılık, 20-30 μm çapında küçük arteriyollar hipoksi3'esadece küçük bir yanıt gösterdi. Bununla birlikte, bu teknik, bu damarlar akciğer dokusunun çok derinlerinde bulunduğundan, 50 μm'den daha büyük çapa sahip arterlerin analizine izin vermez.
Murine akciğerlerin büyük ve çok küçük pulmoner arterlerinin (alt el damarları gibi) analizindeki boşluğu kapatmak için, Martin ve ark. hava yollarının reaktivitesinin analizi için15. Agarose jel aşılama tekniğine dayanarak, bu nispeten yumuşak ve elastik organdan hassas kesilmiş akciğer dilimlerinin (PCLS) hazırlanmasını kolaylaştırır. PCLS içinde iç çapı 20-100 μm arasında olan kesitli arterlerin vasoreaktivitesi doğrudan videomikroskop ile gözlemlenebilir. PCLS'nin hipoksik inkübasyonu sırasında ilaçların uygulanması HPV üzerindeki etkilerinin analizini sağlar. Bu tekniğin genetik olarak tasarlanmış fareye de uygulanabilmesi ayrı bir önem taşımaktadır. Akciğer içindeki konumlarına göre, arterleri sırasıyla 20-40 μm ve 40-100 μm iç çaplarına sahip, acı verici öncesi ve içi damarlar olarak sınıflandırıyoruz. Fonksiyonel bir görünüm altında intra-acinar arter kan ile bireysel bir pulmoner acinus sağlar ve pre-acinar arter önceki damar bölümleridir. Resimlerin dijital kameraya kaydedilmesi, vasoreaksiyonun daha sonra ölçülmesini sağlar. Bu PCLS modelinin belirgin bir özelliği, endotel üzerinde hareket eden kesme stresi eksikliğidir. Buna karşılık, perfüzyonlu damarlarda akut HPV kesme-streste bir artışa yol açar ve böylece NO release16gibi ikincil mekanizmaların indüklendiğini söyler. Ek olarak, PCLS kullanımı, ekstrapulmoner sinirsel veya hormonal etkiler olmadan HPV ölçümlerine izin verir. Hücre kültürü sistemlerinin aksine, örneğin köpek pulmoner arteriyel düz kas hücrelerinden hazırlanan17, damar duvarının histolojik mimarisi neredeyse tamamen korunur.
Özetle, bu protokol, kesme stresinden arındırılmış koşullar altında iç çapları 20-100 μm arasında olan pulmoner arterlerin HPV'lerinden sorumlu potansiyel moleküler oksijen sensörlerinin ve/veya hücresel yolların analizi için yararlı bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Vibratom "Microm HM 650 V"</td><td>Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td><td>Bosch, Frankfurt, Almanya</td><td>HMT 702C</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma kabini</td><td>Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akışlı süperfüzyon odası&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Elektronik, March, Almanya</td><td>PCLS-Banyo Tipi: 847 SN:4017</td><td></td></tr><tr><td>4X, 10X, 20X ve 40X objektiflerle donatılmış dik ters mikroskop&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera&nbsp;</td><td>Stemmer Görüntüleme, Puchheim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa Minipuls 3</td><td>Gilson, Limburg-Offheim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu " Evrensel Wasserbad Isotem 205"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya</td><td>9452450</td><td></td></tr><tr><td>Gaz geçirmez borular Tygon R3603-13 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &Öğr; i: 3/32 inç, &Oslash; a: 5/32 inç, duvar: 1/32 inç</td><td>VWR, Darmstadt, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çeşitli makas ve forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dikiş pamuğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Şırınga&nbsp;</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Şırınga</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IV kalıcı kanülün esnek plastik borusu " IntrocanR-W" (kanül 20 G x 1 & frak14; inç, 1,1 x 32 mm)</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Almanya</td><td>4254112B</td><td>Agarozun akciğere damlatılması için</td></tr><tr><td>Kanül 21 G x 4 &frac34; içinde; 0,8 x 120 mm</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Almanya</td><td>4665643</td> Orta Kanülün <td>köpürtülmesi için</td></tr><tr><td>Nr. 17, 24 G x 1, 0,55 x 25 mm&nbsp;</td><td>Terumo, Eschborn, Almanya</td><td>NN 2425 88DSF18</td><td>Akciğer perfüzyonu için</td></tr><tr><td>Normoksik gaz karışımı (%21 O2, %5.3 CO2, %73.7 N2)</td><td>Linde, Hildesheim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipoksik gaz karışımı (%1 O2, %5.3 CO2, %93,7 N2)</td><td>Linde, Hildesheim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Deisenhofen, Almanya</td><td>H 4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1.04936.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz D-(+)</td><td>Sigma, Deisenhofen, Almanya</td><td>G 7021</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Münih, Almanya</td><td>161-3111</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodyum</td><td>Ratiopharm, Ulm, Almanya</td><td>5120046</td><td></td></tr><tr><td>Fenol içermeyen minimal esansiyel ortam (MEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Almanya</td><td>5120046</td><td></td></tr><tr><td>Dedezenfeksiyon için %70 EtOH</td><td>Stockmeier Chemie, Dillenburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı</td><td>UHU, B&uuml; hl/Baden, Almanya veya bir süpermarketten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U46619 (tromboksan analogu)</td><td>Calbiochem/Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>538944</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum nitroprussid (Nipruss)</td><td>Schwarz Pharma, Monheim, Almanya</td><td>5332804</td><td></td></tr><tr><td>Optimas 6.5 yazılımı&nbsp;</td><td>Stemmer, Puchheim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 19</td><td>AskNet, Karlsruhe, Almanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine hassas kesim akciğer dilimleri kullanılarak pulmoner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonunun videomorfometrik analizi

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Akut alveolar hipoksi, akciğer perfüzyonunu ventilasyonla eşleştirmeye yarayan von Euler-Liljestrand mekanizması olarak da bilinen pulmoner vazokonstriksiyona (HPV) neden olur. Şimdiye kadar, temel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. HPV'ye katkıda bulunan başlıca vasküler segment, intra-acinar arterdir. Bu damar bölümü, akciğer distalinin terminal bir bronşiol kısmı olarak tanımlanan bireysel bir acinus'un kan temini için sorumludur. İntra-acinar arterler çoğunlukla akciğerin bu kısmında bulunur ve izole perifused akciğerlerde pulmoner arter basıncının ölçümü veya diseksiyonlu proksimal pulmoner arter segmentlerinden kuvvet kayıtları gibi yaygın olarak kullanılan bir dizi teknikle seçici olarak ulaşılamaz1,2. Subpleural damarların gerçek zamanlı konfokal lazer tarama lüminesans mikroskopisi ile analizi,3çapı 50 μm'ye kadar olan damarlarla sınırlıdır.
20-100 μm iç çap aralığındaki murin intra-pulmoner arterlerin HPV'lerini incelemek için bir teknik sunuyoruz. Hassas kesim akciğer dilimlerinde (PCLS) kesitli arterlerin videomorfometrik analizine dayanmaktadır. Bu yöntem, alveolar kanalların yanındaki alveolar septa körüklerinde bulunan iç çapı 20-40 μm arasında olan küçük acinar içi arterlerin ve bronşlara ve bronşlara bitişik çalışan 40-100 μm arasında iç çaplara sahip daha büyük acinar öncesi arterlerin vasoreaktivitesinin nicel olarak ölçülmesine izin verir. Uyuşturulmuş ve havalandırılan farelerde subpleural damarların gerçek zamanlı görüntülenmesinin aksine, PCLS'nin videomorfometrik analizi kesme stresinden arındırılmış koşullarda gerçekleşir. Deneysel modelimizde her iki arteriyel segment de %1 O2 ile orta gazlıya maruz kaldığında monofazik HPV sergiler ve hipokside yanıt 30-40 dk sonra kaybolur.

Şekil 1'de büyük bir pre-acinar arterin HPV ölçümünün sonuçları ve küçük asçınar içi arterlerin Şekil 2'sinde verilmiştir. Faz kontrast görüntülerinde (Şekil 1A ve 2A) akciğer dokusu içindeki konumlarına göre bu 2 arter sınıfını ayırt etmenin mümkün olduğu açıktır: Pre-acinar arterler yakın mahallede çalışır bronşlar ve bronşioller (Şekil 1A), oysa intra-acinar arterler alveolar septa körüklerinde bulunur ve alveola ile çevrilidir (Şekil 2A). Biraz pratikle, faz kontrast resimlerinde U46619'a yanıt olarak aydınlık alandaki değişiklikleri görmek mümkündür (Şekil 1A ve 2A). Bununla birlikte, hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon genellikle çok belirgin değildir ve sadece ışık alanlarının değişikliklerinin tam olarak değerlendirilmesinin ardından netleşir(Şekil 1B, 1C, 2B ve, 2C). Didaktik nedenden dolayı, alışılmadık derecede belirgin bir vazokonstriksiyon gösteren bir pre-acinar arter örneği verdik. Ortalama olarak HPV, ışıklı bölgenin %20-30 oranında azalmasına neden olur.
Şekil 2'de, 50 μM pinacidilli veya 50 μM pinacidilsiz hipoksik gazlı ortamla inkübe edilen küçük acinar arterlerin kayıtları gösterilmiştir (mitokondriyal ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının seçimsiz bir açıcısı) ve ilacın inhibitör etkisi açıkça görülebilir hale gelir. Deneyin son kısmı ilacın HPV üzerindeki eyleminin seçiciliğini göstermektedir: Tromromboxane analog U46619 tarafından indüklenen vazokonstriksiyon pinacidil ilavesi ile değiştirilmez. Gerçekten de, arter eğrisi pinacidil'in diğer ikisinden belirgin şekilde daha düşük olduğunu ortaya çıkardı, ancak ışık alanının sadece U46619 tarafından azaltılmasının boyutu karşılaştırılabilir. Bu durumda, eğriler arasındaki farka neden olan HPV'nin eksik geri çevrilmesiydi. Bu grafikte ayrıca normoksik gazlı ortama maruz kalan bir arter ek kontrol olarak dahil edilir. Bu durum altında, ışıklı alanda herhangi bir değişiklik tespit edilemez.
Şekil 3'te pinacidil'in HPV üzerindeki etkisine ilişkin tüm ölçümler serisinin verileri gösterilmiştir. İstatistiksel farklılıklar için iki grubun karşılaştırılması için, belirtilen zaman noktalarının veri kümeleri Kruskal-Wallis ve Mann-Whitney testi ile analiz edildi. HPV pinacidil varlığında açıkça kaldırılmış, U46619 kaynaklı kasılma değişmemiştir.
Alternatif olarak, Müller-Redetzky ve ark.'da açıklandığı gibi eğrinin altındaki alanın karşılaştırılmasıyla gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek mümkündür. 22
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1.jpg"> Şekil 1. Büyük bir pre-acinar arter hpv ölçümü. (A) Kesitli bir bronş(B)için yakın mahallede çalışan kesitli bir ön-acinar arter (a) faz kontrast görüntüleri. Resimler daireler halinde (B) ile belirtilen zaman noktalarında yapılır: ölçümün başında (a), U46619 (b) ile tedavinin sonunda, Nipruss'a (c) maruz kalmanın sonunda, hipoksik gazlı ortamda (d, e) 30 veya 40 dk'dan sonra, normoksik gazlı ortamla yıkandıktan sonra (f) ve U46619'un son uygulamasından sonra (g). Grafikte (B) ışıklı alanın değişiklikleri zamana göre çizilirken, deneyin başındaki ışık alanı% 100 olarak tanımlanır ve vazokonstriksiyon / dilatasyon göreceli değerler olarak verilir. Bu durumda hipoksi, ışıklı alanın% 60 azalmasına neden oldu. (C) Hipoksik yanıtın daha net bir sunumu için, vazoreaktivitenin test edildiği deneyin başlangıç aşaması dahil değildir, ancak azaltılmış oksijene maruz kalmadan hemen önce elde edilen değer% 100 olarak ayarlanır (ayrıca bkz. Şekil 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2.jpg"> Şekil 2. Pinacidil'in (mitokondriyal ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının seçimsiz bir açıcısı; mitoKATP) küçük acınar arterlerin HPV'si üzerindeki etkisi. (A) İntra-acinar arterler (a) alveolar septa körüklerinde bulunur. Alv = alveolus. Bu deneylerde uygulanan bireysel koşulların sırası grafiğin (B) başlığında verilmiştir. Hipoksik maruziyet 50 μM pinacidil varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilir. Kontrol inkübasyonları normoksik gazlı ortam ile yapılır. (A)cinsinden gösterilen resimler ölçümün başında (a, a', a"), tedavinin sonunda U46619 (b, b', b"), Nipruss'a (c, c', c") maruz kalmanın sonunda, hipoksik veya normoksik gazlı ortamda (d, d', d"; e, e', e"), normoksik gazlı ortamla (f, f', f") yıkandıktan sonra ve U46619'un son uygulamasından sonra (g, g', g") 30 veya 40 dk sonra. Normoksi/hipoksi/hipoksi+pinasitede yanıtın daha net bir sunumu için, normoksik/hipoksik gazlı ortama maruz kalmadan hemen önce elde edilen değerler% 100 (C) olarak ayarlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3.jpg"> Şekil 3. HPV'nin pinacidil ile inhibisyonu. 50 μM pinacidilli veya 50 μM pinacidilsiz hipoksik gazlı ortama maruz kalan küçük acınar arterlerin kayıtları özetlenir ve SEM ± araç olarak sunulur. (A)içinde kayıtların tamamı verilir,(B) içinde hipoksik inkübasyonun başlangıcındaki değere ilişkin göreli veriler gösterilir. Pinacidil içeren hipoksik gazlı ortama maruz kalan PCLS'de vasoreaktivite saptenemez. U46619 tarafından indüklenen vazokonstriksiyon ilaç tarafından etkilenmez. Braketlerdeki "n", PCLS'nin yapıldığı arter sayısını/hayvan sayısını ifade eder. Başka bir deyişle, ilk sayı analiz edilen akciğer bölümlerinin sayısını açıklar ve ikinci sayı bu bölümlerin hazırlandığı farelerin sayısını verir. Verilen zaman noktalarında her iki grup arasındaki farklar önem için test edilir. n.s.: önemli değil, *: s≤0.05, **: p≤0.01, ***: s≤0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4.jpg"> Şekil 4. Yöntemin şematik özeti. Kısaca, fareler servikal çıkık tarafından öldürülür. Göğsün açılmasından sonra, akciğerler düşük erime noktası agarose ile doldurulur ve soğuduktan sonra 200 μm kalınlığında hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS) kesilir. Agaroz 37 °C'de çıkarıldıktan sonra bir PCLS, normoksik ortama maruz kaldığı akışlı süperfüzyon odasına veya% 1 O2ile orta gazlıya aktarılır. Vasoreaktivite, ışıklı bölgede değişiklikler olarak kaydedilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon (HPV), alveolar hipoksi akciğer perfüzyonunun ventilasyonla eşleştiği önemli bir fizyolojik olgudur. HPV'ye katkıda bulunan başlıca vasküler segment, intra-acinar arterdir. Burada, 20-100 μm çapındaki murine pulmoner damarların HPV analizi için protokolümüzü açıklıyoruz.

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Bu prosedürün genel amacı, iç çapları 20 ila 100 mikron olan yansıyan intrapulmoner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle akciğer havayollarunun düşük erime noktalı aros ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, izole edilmiş akciğerleri 200 mikron kalınlığında dilimlere ayırmak için bir vibratör kullanılır.Ardından, akciğer kesitlerindeki aros, normoksik gazla havalandırılan 37 °C sıcaklıktaki besiyerinde inkübasyon yoluyla uzaklaştırılır; böylece kesitler sıvı içinde yavaşça hareket eder. Daha sonra, tek bir akciğer kesiti bir akışlı superfüzyon kamarasına aktarılır ve ardından enine kesilmiş arterin vazo-reaktivitesinin video morfometrik analizi gerçekleştirilir.Sonuç olarak, farklı tedavilere yanıt olarak damarın lüminal alanındaki değişiklikler değerlendirilir. Bu tekniğin, subplevral mikrodamarların intravital mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, izole proksimal pulmoner arterlerdeki vasküler tansiyonun ölçülmesinin, çapları 20 ile 100 mikrometre arasında olan intrapulmoner arterlerin VA reaktivitesinin kantitatif analizine olanak tanımasıdır. Prosedürü Anna Goldenberg ve bu laboratuvardan iki teknisyen uygulamalı olarak gösterecektir.Bir fareyi servikal çıkık yoluyla öldürdükten hemen sonra, abdominal kaviteyi açın, bağırsak kıvrımlarını kenara çekin ve kanama sağlamak için büyük abdominal damarları kesin. Ardından, diyaframı delmek için ince makas kullanın. Bu işlem, plevral kaviteye hava girişi sonucunda akciğerlerin sönmesine neden olur.Diyaframı inferior torasik açıklıktan ayırmak için kesmeye devam edin. Şimdi kaburgaları ve klavikulayı lateralden kesin. Göğüs kafesinin ventral kısmını çıkarmak için timusu dışarı alın.Bir şırıngayı ılık perfüzyon tamponu ile doldurun. Ardından, kalbin sol ventrikülüne küçük bir delik açın. Perfüzyon tamponunun çıkış hızını ayarlayın ve akciğerler beyaz görünene kadar sağ ventrikül aracılığıyla pulmoner vaskülatürü yavaşça perfüze edin.Ardından, trakeadaki tükürük bezlerini, küçük kasları ve bağ dokusunu temizleyin. Trakeyi çevreleyen bağ dokudan ayırın ve daha sonra yapılacak ligasyon için özofagus ile trakea arasına bir parça dikiş pamuğu yerleştirin. Daha sonra, yan yana bulunan iki trakeal kıkırdak arasındaki trakeanın üst kısmına mikro makas kullanarak küçük bir delik açın.Bir şırınga 37 °C sıcaklıktaki, düşük erime noktalı agar ile doldurulduktan sonra, şırıngayı esnek bir plastik kanüle bağlayın ve kanüldeki hava tamamen çıkana kadar pistonu yavaşça itin. Kanülü trakeadaki küçük deliğe yerleştirin ve dikiş pamuğu ile dikkatlice sabitleyin. Ardından, hava yollarını agar ile yavaşça doldurun ve akciğerleri gözlemleyin.Öncelikle sağ akciğer genişlemeye başlar, ardından sol akciğer gelir. 30 ila 40 saniye sonra dolum tamamlanır ve her iki akciğer de in vivo durumla karşılaştırılabilir bir hacim olan yaklaşık 1.2 ila 2.0 mililitreye kadar şişirilir. Cinsiyete, yaşa ve ağırlığa bağlı olarak, egg rose'un prosedür sırasında çok fazla katılaşmaması için yeterince hızlı, ancak akciğerlere zarar vermeyecek kadar yavaş enjekte edilmesi önemlidir.Akciğerler eş zamanlı olarak doldurulduktan sonra, havanın sızmasını önlemek için plastik kanülü çıkarın ve trakeayı dikiş pamuğu ile bağlayın. Ardından trakeayı bağlama noktasının üzerinden kesin ve akciğerler ile kalbi blok halinde göğüsten ayırmak için organları, bekleme süresi boyunca birkaç dakika içinde hava yollarının sertleşmesini sağlamak amacıyla buz gibi soğuk heaps ringer tamponuna aktarın. Akciğer dokusu için bir destek görevi görmesi amacıyla, vibratörün numune tutucusuna bir parça şampanya mantarı yapıştırmak için hızlı yapıştırıcı kullanın. Hava yolları sertleştikten sonra, tekil akciğer loblarını birbirinden ayırın.Ardından, bir lobu numune tutucuya hızlı yapıştırıcıyla sabitleyin. Küçük intra asner arterlerin kesitlerini almak için, sağ akciğerin kranial lobunu alın ve hilum yüzeyi tutucuya bakacak şekilde hızlı yapıştırıcıyla yapıştırın; taze bir jiletle donatılmış bir vibratom kullanarak akciğer lobunu çevreden başlayarak 200 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin. Daha büyük pre aser arterlerin kesitlerini almak için, sol akciğerin hilumunu şampanya mantarı ile hizalayın ve lobu bu yönde tutucuya yapıştırın, ardından arosların çıkarılması için çevreden başlayarak dilimleyin.Organ kesitlerini, yaklaşık 200 mililitre 37 °C sıcaklıktaki MEM ile doldurulmuş bir cam behere aktarın. Beheri bir ısıtma kabinine yerleştirin ve akciğer kesitlerinin ortam içerisinde yavaşça hareket etmesini sağlamak için normoksik gaz ile kabarcıklandırma yapın. Yaklaşık iki saat sonra, havayı dolduran aros plakları akciğer dokusundan uzaklaşmış olacak ve kesitler beherin dibine çökecektir.İntrapulmoner arterlerin video morfometrik analizi için, bir akciğer kesitini mikroskopa monte edilmiş ve 1,2 milliliters normoksik gazlanmış MEM ile doldurulmuş akışlı süperfüzyon haznesine aktarın. Akciğer kesitini, bir platin halkaya bağlı naylon iplerle haznenin tabanına sabitleyin. Hazneyi normoksik gazlanmış ortamla perfüze etmeye başlayın.İç çapları 20 ve 100 mikron arasında olan enine kesilmiş arterleri taramak için 10 x objektifli bir faz kontrast mikroskobu kullanın. Uygun bir aday damar bulunduğunda, pre asner damarın fotoğrafını çekmek için 20 x objektifi veya burada gösterildiği gibi, damarın iç çapını ölçmek için bir intra asner arterin fotoğrafını çekmek için 40 x objektifi kullanın. Deneye başlamadan önce, tüm deney boyunca her dakika enine kesilmiş arterin fotoğraflarını çekecek şekilde yazılımı ayarlayın.Fotoğraflama işlemini başlattıktan sonra, odanın normoksik gast ortamı ile perfüzyonuna 10 dakika boyunca devam edin. Ardından, U 466 19 ile lüminal alanları en az %30 oranında azalmış damarları kullanarak arterin kontraktilitesini analiz etmek için, akciğer kesitini akış olmadan 10 dakika boyunca U 466 19 içinde bekletin. İlacı normoksik gast ortamı ile 10 dakika boyunca yıkayarak uzaklaştırın.Ardından, akış olmadan 10 dakika boyunca res uygulayarak arteri genişletin. İlacı, dakikada altı mililitre akış hızında normoksik gazlı ortamla 10 dakikalık bir yıkama ve ardından dakikada 0.7 mililitre akışla 10 dakika daha uygulayarak tekrar uzaklaştırın. Sonrasında, akciğer kesitini 40 dakika boyunca yüksek hipoksik gazlı ortamda inkübe edin.Ayrıca, ek bir tüp seti aracılığıyla hipoksik gaz karışımını perfüzyon odasının hava boşluğuna akıtın. Damarın canlılığını kontrol etmek için hipoksik ortamı, normoksik gazlı ortam ile 20 dakikalık bir yıkama yaparak uzaklaştırın ve odanın hava boşluğuna giden gaz akışını hipoksikten normoksik gaz akışına çevirin. Deneyin sonunda, vazokonstriksiyonu indüklemek için perfüzyon odasına U 466 19 uygulayın ve akış olmadan 20 dakika inkübe edin.Başka bir damarın vazoaktivitesini ölçmek için bu adımları taze bir akciğer kesitiyle tekrarlayın. Analize, enine kesilmiş arterlerin görüntülerini bir görüntü analiz programına yükleyerek başlayın. Ardından, damarın lüminal alanını belirlemek için bir imleç kullanın.Ellerin kurulanması, örneğin damar duvarına yapışmış kan hücrelerinden kaynaklanan artefaktları önlediği için gereklidir. Kesit görüntülerini benzer şekilde analiz etmeye devam edin. Akışlı inkübasyon odasındaki bir koşul diğerine dönüştürüldüğünde her görüntü analiz edilmelidir, ancak koşullar değişmediğinde her iki görüntüden birinin analiz edilmesi yeterlidir.Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon, kesit alınmış bir bronşun hemen yakınından geçen kesit alınmış bir pre ASIN arterinin bu faz kontrast görüntülerinde gözlemlenebilir. Görüntüler; ölçümün başlangıcında, ölçümün sonunda, U 466 19 uygulamasında, RA'lara maruz kalmanın sonunda, hipoksik gazlı ortamda 30 veya 40 dakika sonra, normoksik gazlı ortamla yıkama sonrası ve U 466 19'un son uygulamasından sonra, grafikte dairelerle belirtilen zaman noktalarında alınmıştır. Vazoreaktivite, kesit alınmış arterin lüminal alanındaki göreceli değişimlerin zamana karşı kaydedilmesiyle belirlenmiştir. Deneyin başlangıcındaki alan %100 olarak tanımlanmış ve vazokonstriksiyon, başlangıç alanına göre göreceli değerler olarak verilmiştir.Bu vakada, hipoksik yanıtın daha net bir şekilde sunulması için hipoksiye maruz bırakma, lüminal alanda %60 azalma indüklemektedir. Vasküler reaktivitenin test edildiği deneyin başlangıç aşaması burada gösterilmemiştir ve azaltılmış oksijene maruz kalmadan hemen önce elde edilen değer %100 olarak belirlenmiştir. Bu çalışmalarda incelenen diğer damar tipi, alveolar septaların kıvrımlarında yer alan intra ASIN arterlerdir. Bu deney setinde, mitochondrial ATP duyarlı potasyum kanallarının non-selektif bir açıcısı olan sidalin, küçük intra asner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonu üzerindeki etkisi bu amaçla analiz edilmektedir.Kesitler hipoksik ortamda inkübe edilir. Normoksiye, hipoksiye veya hipoksi artı sidal uygulamasına verilen yanıtın daha net sunulması için, 50 micromolar sidal yokluğunda veya varlığında normoksik gast ortamında kontrol inkübasyonları gerçekleştirilir. Normoksik veya hipoksik gast ortamına maruz bırakılmadan hemen önce elde edilen değerler %100 olarak belirlenir. Pineal uygulamasına maruz kalan arter, katkısız hipoksik ortamda inkübe edilen arterde olduğu gibi, alanda bir azalma göstermez.Normoksik ortamda, lümen alanında herhangi bir değişiklik saptanmamıştır. Hipoksik gast ortamına 50 µM sidal ile veya sidal olmaksızın maruz bırakılan küçük intra ASIN arterlerin kayıtları, ortalama artı veya eksi SEM olarak sunulmuştur. Bu grafikte, hipoksik inkübasyon başlangıcındaki değere göre göreceli veriler gösterilmektedir.Herhangi bir vazo reaktivitesi tespit edilememiştir. Hipoksik gaza maruz kalan akciğer dilimlerinde, U 466 19 tarafından indüklenen pineal vazokonstriksiyon içeren medyum, ilaçtan etkilenmemiştir. Bu videoyu izledikten sonra; mirror precision hazırlamanın, akciğer dilimleri kesmenin ve bunları, alveolar septaların tabanında yer alan 20 ile 40 mikrometre arası çaplardaki küçük intra-acinus arterlerinin ve bronşlar ile bronşiyollere komşu seyreden 40 ile 100 mikrometre arası çaplardaki daha büyük pre-acinus arterlerinin VA reaktivitesinin kantitatif ölçümü için nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

videomorphometric-analysis-hypoxic-pulmonary-vasoconstriction-intra

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Sıçanlarda plevral yüzeyin akciğer kanseri metastazlarında mikrodolaşım kan akış hızını otomatik bir şekilde, kapalı göğüs pulmoner intravital mikroskopi kullanarak ölçmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu model, kemirgenlerde pulmoner metastazlar üzerinde fizyolojik araştırmalar yapmak için yaygın bir araç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.

Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Pulmoner hipertansiyon, pulmoner arter pulsatilitesi, kasılma ve elastikiyetinde önemli bir azalma ile ilişkilidir ve pulmoner arter basıncında ve pulmoner dirençte artışa katkıda bulunur. Hipoksik bir domuz yavrusu modeli kullanan bu çalışma, yeni geliştirilen bir pulsatil kateter kullanılarak pulmoner arter plastisitesinin iyileştirilmesinin hipoksik pulmoner hipertansiyonu iyileştirdiğini göstermiştir.

Artan Pulmoner Arter Pulsatif Akış Piglets içinde Hipoksik Pulmoner Hipertansiyon Artırır

Pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH), pulmoner arteriyollerin obliterasyonuna ve sağ ventrikül yetmezliği gelişmesine yol açan bir hastalıktır. PAH'ın kemirgen modelleri, PAH'ın patofizyolojisini anlamada kritik öneme sahiptir. Burada fare ve sıçanlarda sağ kalp kateterizasyonu ve ekokardiyografi ile hemodinamik karakterizasyonu gösterildi.

Pulmoner Hipertansiyon Kemirgen Modeller Hemodinamik Karakterizasyonu

Bu protokol, hipoksiye maruz kalma ve VEGF reseptör antagonistinin enjeksiyonuna bağlı olarak farelerde pulmoner hipertansiyonun (PH) indüksiyonunu tanımlar. Hayvanlarda protokolün başlamasından 3 hafta sonra PH ve sağ ventrikül (RV) hipertrofisi gelişir. Modelin fonksiyonel ve morfometrik karakterizasyonu da sunulmuştur.

Hipoksi/SU5416 Modeli kullanılarak Farelerde Pulmoner Hipertansiyonun İndüksiyonu ve Karakterizasyonu

Burada, açık göğüs cerrahisi yaklaşımı ile farelerde sağ ventrikül ve pulmoner arterin invaziv hemodinamik değerlendirmesini yapmak için bir protokol salıyoruz.

Farelerde Sağ Ventrikül Sistemi ve Hipoksiye Bağlı Pulmoner Arteriyel Hipertansiyon için İnvaziv Hemodinamik Değerlendirme

Bu tekniğin amacı, erken postnatal ve erişkin farelerin pulmoner arter ağlarının akciğer şişmesi yoluyla ex vivo görselleştirilmesi ve pulmoner arter yoluyla radyoopak polimer bazlı bileşiğin enjeksiyonudur. Döküm dokular için potansiyel uygulamalar da tartışılmıştır.

Mikro-BT Görüntüleme için Erişkin ve Erken Postnatal Fare Akciğerlerinin Vasküler Döküm

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Bu protokol, farelerde çoklu intravenöz bolus dozu uygulaması ve invaziv hemodinamik izleme yürütmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü pulmoner arter hipertansiyonu için gelecekteki terapötik bileşik taraması için kullanabilirler.

Hipoksi ile İndüklenen Fare Pulmoner Arter Hipertansiyon Modelinde Çoklu İntravenöz Bolus Dozu ve İnvaziv Hemodinamik Değerlendirme

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Burada, İzolektin B4'ün tek boyamasını kullanarak tüm farelerin akciğer dokusu için pulmoner mikrovasküler yoğunluğun tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlamak için basit ve ekonomik bir protokol açıklıyoruz.

Lobüller Boyunca Farelerde Pulmoner Mikrovasküler Yoğunluğun Ölçülmesi

Öğrenin, hassas kesim akciğer dilimleri kullanarak fare pulmoner arterlerinde hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonu videomorfometrik olarak nasıl analiz edilir. Bu yöntem, 20-100 mikrometre çapındaki damarların vazoreaktivitesini nicel olarak değerlendirir.

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi (Video) | JoVE Journal

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Daha fazla video keşfet