Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, iç çapları 20 ila 100 mikron olan yansıyan intrapulmoner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonunu analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle akciğer havayollarunun düşük erime noktalı aros ile doldurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, izole edilmiş akciğerleri 200 mikron kalınlığında dilimlere ayırmak için bir vibratör kullanılır.

Ardından, akciğer kesitlerindeki aros, normoksik gazla havalandırılan 37 °C sıcaklıktaki besiyerinde inkübasyon yoluyla uzaklaştırılır; böylece kesitler sıvı içinde yavaşça hareket eder. Daha sonra, tek bir akciğer kesiti bir akışlı superfüzyon kamarasına aktarılır ve ardından enine kesilmiş arterin vazo-reaktivitesinin video morfometrik analizi gerçekleştirilir.

Sonuç olarak, farklı tedavilere yanıt olarak damarın lüminal alanındaki değişiklikler değerlendirilir. Bu tekniğin, subplevral mikrodamarların intravital mikroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, izole proksimal pulmoner arterlerdeki vasküler tansiyonun ölçülmesinin, çapları 20 ile 100 mikrometre arasında olan intrapulmoner arterlerin VA reaktivitesinin kantitatif analizine olanak tanımasıdır. Prosedürü Anna Goldenberg ve bu laboratuvardan iki teknisyen uygulamalı olarak gösterecektir.

Bir fareyi servikal çıkık yoluyla öldürdükten hemen sonra, abdominal kaviteyi açın, bağırsak kıvrımlarını kenara çekin ve kanama sağlamak için büyük abdominal damarları kesin. Ardından, diyaframı delmek için ince makas kullanın. Bu işlem, plevral kaviteye hava girişi sonucunda akciğerlerin sönmesine neden olur.

Diyaframı inferior torasik açıklıktan ayırmak için kesmeye devam edin. Şimdi kaburgaları ve klavikulayı lateralden kesin. Göğüs kafesinin ventral kısmını çıkarmak için timusu dışarı alın.

Bir şırıngayı ılık perfüzyon tamponu ile doldurun. Ardından, kalbin sol ventrikülüne küçük bir delik açın. Perfüzyon tamponunun çıkış hızını ayarlayın ve akciğerler beyaz görünene kadar sağ ventrikül aracılığıyla pulmoner vaskülatürü yavaşça perfüze edin.

Ardından, trakeadaki tükürük bezlerini, küçük kasları ve bağ dokusunu temizleyin. Trakeyi çevreleyen bağ dokudan ayırın ve daha sonra yapılacak ligasyon için özofagus ile trakea arasına bir parça dikiş pamuğu yerleştirin. Daha sonra, yan yana bulunan iki trakeal kıkırdak arasındaki trakeanın üst kısmına mikro makas kullanarak küçük bir delik açın.

Bir şırınga 37 °C sıcaklıktaki, düşük erime noktalı agar ile doldurulduktan sonra, şırıngayı esnek bir plastik kanüle bağlayın ve kanüldeki hava tamamen çıkana kadar pistonu yavaşça itin. Kanülü trakeadaki küçük deliğe yerleştirin ve dikiş pamuğu ile dikkatlice sabitleyin. Ardından, hava yollarını agar ile yavaşça doldurun ve akciğerleri gözlemleyin.

Öncelikle sağ akciğer genişlemeye başlar, ardından sol akciğer gelir. 30 ila 40 saniye sonra dolum tamamlanır ve her iki akciğer de in vivo durumla karşılaştırılabilir bir hacim olan yaklaşık 1.2 ila 2.0 mililitreye kadar şişirilir. Cinsiyete, yaşa ve ağırlığa bağlı olarak, egg rose'un prosedür sırasında çok fazla katılaşmaması için yeterince hızlı, ancak akciğerlere zarar vermeyecek kadar yavaş enjekte edilmesi önemlidir.

Akciğerler eş zamanlı olarak doldurulduktan sonra, havanın sızmasını önlemek için plastik kanülü çıkarın ve trakeayı dikiş pamuğu ile bağlayın. Ardından trakeayı bağlama noktasının üzerinden kesin ve akciğerler ile kalbi blok halinde göğüsten ayırmak için organları, bekleme süresi boyunca birkaç dakika içinde hava yollarının sertleşmesini sağlamak amacıyla buz gibi soğuk heaps ringer tamponuna aktarın. Akciğer dokusu için bir destek görevi görmesi amacıyla, vibratörün numune tutucusuna bir parça şampanya mantarı yapıştırmak için hızlı yapıştırıcı kullanın. Hava yolları sertleştikten sonra, tekil akciğer loblarını birbirinden ayırın.

Ardından, bir lobu numune tutucuya hızlı yapıştırıcıyla sabitleyin. Küçük intra asner arterlerin kesitlerini almak için, sağ akciğerin kranial lobunu alın ve hilum yüzeyi tutucuya bakacak şekilde hızlı yapıştırıcıyla yapıştırın; taze bir jiletle donatılmış bir vibratom kullanarak akciğer lobunu çevreden başlayarak 200 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin. Daha büyük pre aser arterlerin kesitlerini almak için, sol akciğerin hilumunu şampanya mantarı ile hizalayın ve lobu bu yönde tutucuya yapıştırın, ardından arosların çıkarılması için çevreden başlayarak dilimleyin.

Organ kesitlerini, yaklaşık 200 mililitre 37 °C sıcaklıktaki MEM ile doldurulmuş bir cam behere aktarın. Beheri bir ısıtma kabinine yerleştirin ve akciğer kesitlerinin ortam içerisinde yavaşça hareket etmesini sağlamak için normoksik gaz ile kabarcıklandırma yapın. Yaklaşık iki saat sonra, havayı dolduran aros plakları akciğer dokusundan uzaklaşmış olacak ve kesitler beherin dibine çökecektir.

İntrapulmoner arterlerin video morfometrik analizi için, bir akciğer kesitini mikroskopa monte edilmiş ve 1,2 milliliters normoksik gazlanmış MEM ile doldurulmuş akışlı süperfüzyon haznesine aktarın. Akciğer kesitini, bir platin halkaya bağlı naylon iplerle haznenin tabanına sabitleyin. Hazneyi normoksik gazlanmış ortamla perfüze etmeye başlayın.

İç çapları 20 ve 100 mikron arasında olan enine kesilmiş arterleri taramak için 10 x objektifli bir faz kontrast mikroskobu kullanın. Uygun bir aday damar bulunduğunda, pre asner damarın fotoğrafını çekmek için 20 x objektifi veya burada gösterildiği gibi, damarın iç çapını ölçmek için bir intra asner arterin fotoğrafını çekmek için 40 x objektifi kullanın. Deneye başlamadan önce, tüm deney boyunca her dakika enine kesilmiş arterin fotoğraflarını çekecek şekilde yazılımı ayarlayın.

Fotoğraflama işlemini başlattıktan sonra, odanın normoksik gast ortamı ile perfüzyonuna 10 dakika boyunca devam edin. Ardından, U 466 19 ile lüminal alanları en az %30 oranında azalmış damarları kullanarak arterin kontraktilitesini analiz etmek için, akciğer kesitini akış olmadan 10 dakika boyunca U 466 19 içinde bekletin. İlacı normoksik gast ortamı ile 10 dakika boyunca yıkayarak uzaklaştırın.

Ardından, akış olmadan 10 dakika boyunca res uygulayarak arteri genişletin. İlacı, dakikada altı mililitre akış hızında normoksik gazlı ortamla 10 dakikalık bir yıkama ve ardından dakikada 0.7 mililitre akışla 10 dakika daha uygulayarak tekrar uzaklaştırın. Sonrasında, akciğer kesitini 40 dakika boyunca yüksek hipoksik gazlı ortamda inkübe edin.

Ayrıca, ek bir tüp seti aracılığıyla hipoksik gaz karışımını perfüzyon odasının hava boşluğuna akıtın. Damarın canlılığını kontrol etmek için hipoksik ortamı, normoksik gazlı ortam ile 20 dakikalık bir yıkama yaparak uzaklaştırın ve odanın hava boşluğuna giden gaz akışını hipoksikten normoksik gaz akışına çevirin. Deneyin sonunda, vazokonstriksiyonu indüklemek için perfüzyon odasına U 466 19 uygulayın ve akış olmadan 20 dakika inkübe edin.

Başka bir damarın vazoaktivitesini ölçmek için bu adımları taze bir akciğer kesitiyle tekrarlayın. Analize, enine kesilmiş arterlerin görüntülerini bir görüntü analiz programına yükleyerek başlayın. Ardından, damarın lüminal alanını belirlemek için bir imleç kullanın.

Ellerin kurulanması, örneğin damar duvarına yapışmış kan hücrelerinden kaynaklanan artefaktları önlediği için gereklidir. Kesit görüntülerini benzer şekilde analiz etmeye devam edin. Akışlı inkübasyon odasındaki bir koşul diğerine dönüştürüldüğünde her görüntü analiz edilmelidir, ancak koşullar değişmediğinde her iki görüntüden birinin analiz edilmesi yeterlidir.

Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon, kesit alınmış bir bronşun hemen yakınından geçen kesit alınmış bir pre ASIN arterinin bu faz kontrast görüntülerinde gözlemlenebilir. Görüntüler; ölçümün başlangıcında, ölçümün sonunda, U 466 19 uygulamasında, RA'lara maruz kalmanın sonunda, hipoksik gazlı ortamda 30 veya 40 dakika sonra, normoksik gazlı ortamla yıkama sonrası ve U 466 19'un son uygulamasından sonra, grafikte dairelerle belirtilen zaman noktalarında alınmıştır. Vazoreaktivite, kesit alınmış arterin lüminal alanındaki göreceli değişimlerin zamana karşı kaydedilmesiyle belirlenmiştir. Deneyin başlangıcındaki alan %100 olarak tanımlanmış ve vazokonstriksiyon, başlangıç alanına göre göreceli değerler olarak verilmiştir.

Bu vakada, hipoksik yanıtın daha net bir şekilde sunulması için hipoksiye maruz bırakma, lüminal alanda %60 azalma indüklemektedir. Vasküler reaktivitenin test edildiği deneyin başlangıç aşaması burada gösterilmemiştir ve azaltılmış oksijene maruz kalmadan hemen önce elde edilen değer %100 olarak belirlenmiştir. Bu çalışmalarda incelenen diğer damar tipi, alveolar septaların kıvrımlarında yer alan intra ASIN arterlerdir. Bu deney setinde, mitochondrial ATP duyarlı potasyum kanallarının non-selektif bir açıcısı olan sidalin, küçük intra asner arterlerin hipoksik pulmoner vazokonstriksiyonu üzerindeki etkisi bu amaçla analiz edilmektedir.

Kesitler hipoksik ortamda inkübe edilir. Normoksiye, hipoksiye veya hipoksi artı sidal uygulamasına verilen yanıtın daha net sunulması için, 50 micromolar sidal yokluğunda veya varlığında normoksik gast ortamında kontrol inkübasyonları gerçekleştirilir. Normoksik veya hipoksik gast ortamına maruz bırakılmadan hemen önce elde edilen değerler %100 olarak belirlenir. Pineal uygulamasına maruz kalan arter, katkısız hipoksik ortamda inkübe edilen arterde olduğu gibi, alanda bir azalma göstermez.

Normoksik ortamda, lümen alanında herhangi bir değişiklik saptanmamıştır. Hipoksik gast ortamına 50 µM sidal ile veya sidal olmaksızın maruz bırakılan küçük intra ASIN arterlerin kayıtları, ortalama artı veya eksi SEM olarak sunulmuştur. Bu grafikte, hipoksik inkübasyon başlangıcındaki değere göre göreceli veriler gösterilmektedir.

Herhangi bir vazo reaktivitesi tespit edilememiştir. Hipoksik gaza maruz kalan akciğer dilimlerinde, U 466 19 tarafından indüklenen pineal vazokonstriksiyon içeren medyum, ilaçtan etkilenmemiştir. Bu videoyu izledikten sonra; mirror precision hazırlamanın, akciğer dilimleri kesmenin ve bunları, alveolar septaların tabanında yer alan 20 ile 40 mikrometre arası çaplardaki küçük intra-acinus arterlerinin ve bronşlar ile bronşiyollere komşu seyreden 40 ile 100 mikrometre arası çaplardaki daha büyük pre-acinus arterlerinin VA reaktivitesinin kantitatif ölçümü için nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.