İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Aşağıdaki protokolde; insan kan monositleri, lenfositleri, nötrofilleri ve trombositlerin biyenerjetik profillerinin ve oksidatif burst yanıtlarının ölçümü gösterilecektir. Bu işlem, öncelikle taze çekilen kandan buffy coat ve trombosit bakımından zengin plazma fraksiyonlarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, heterojen beyaz kan hücresi popülasyonu, yoğunluk gradyanı kullanılarak mononükleer ve polimorfonükleer hücre katmanlarına ayrılır.

Ardından, saf monosit, nötrofil ve lenfosit popülasyonları maksimum ayrıştırma ile daha da izole edilir ve ardından hücre dışı akış veya XF analizi için plaklara ekilir. Nihayetinde, monosit, lenfosit ve trombositlerdeki mitokondriyal fonksiyonun yanı sıra monosit ve nötrofillerin oksijen tüketim hızlarındaki oksidatif patlama, XF teknolojisi ile hassas ve tekrarlanabilir şekilde ölçülebilir. Bugün size göstereceğimiz tekniğin avantajı, küçük bir kan örneğinden hastanın kanındaki tüm ana hücreleri hazırlayabiliyor olmanızdır.

Bunlar, saf inaktive formdaki trombositler ve lökositlerdir ve bunların mitokondriyal fonksiyonları ölçülmektedir. Bunun, hastadaki çeşitli hastalıkları ve durumları gerçek zamanlı olarak yansıtabileceğini düşünüyoruz. Bu yöntem; yaşam tarzı, diyet ve patolojik stresin mitokondriyal fonksiyon üzerindeki rolü gibi metabolizmaya ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu protokol, çeşitli lökosit popülasyonlarında ve trombositlerde hücresel biyenerjetiğin izolasyonu ve belirlenmesi için birden fazla teknolojiyi birleştirmektedir. Protokolün bu adımı oldukça kritiktir çünkü yoğunluk gradyanı ve manyetik ayırma işlemi hassas pipetleme gerektirir. Ayrıca, fraksiyonlama sırasında hücre popülasyonlarının nerede olduğu konusunda dikkatli olmanız gerekir.

Periferik kan hücrelerinin izolasyonunu ve hücresel biyoenerjetik analizini, 24 kuyucuklu ekstrasellüler fluks analizörü veya XF 24 üzerinde göstereceğiz. Ancak bu yöntem XF 96 üzerinde de uygulanabilir. İşleme başlamadan en az iki saat önce, XF sensör kartuşu problarını XF cran çözeltisi ile hidrate edin.

Ardından, yeni alınmış tam kanı, sallanan kova rotorlu bir santrifüjde, oda sıcaklığında ve 500 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Eritrosit buffy coat tabakasının üzerinde bir santimetre plazma kalana kadar, trombosit zengin plazmayı içeren üst tabakayı almak için bir transfer pipeti kullanın ve plazmayı daha sonraki işlemler için oda sıcaklığında kenara ayırın. Daha sonra Buffy coat'u steril 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve beyaz kan hücrelerini 24 ml'ye seyreltin.

Ardından bazal RPMI ile birlikte, üç adet 15 ml'lik konik tüpün her birine üç mililitre düşük yoğunluklu, opak 1.077 ekleyin. Sonra, beş mililitrelik dar bir pipetin ucunu her bir tüpün tabanına yerleştirin. Sırasıyla üç mililitre yüksek yoğunluklu, opak 1.119'u yavaşça boşaltın.

Şimdi, katmanları bozmadan, düşük güç ayarında bir otomatik pipet kullanarak her bir gradyana sekiz mililitre seyreltilmiş kan dikkatlice ekleyin. Tüm gradyan katmanlarının görselleştirilmesi için düşük yoğunluklu gradyana mavi boya eklenmiştir. Hücreleri santrifüjle ayrı ayrı ayırdıktan sonra, diğer hücre bantlarını bozmadan mononükleer ve polimorfonükleer hücreleri steril cam pipetlerle toplayın.

Her bir tüpteki mononükleer ve polimorfonükleer hücre popülasyonlarını, her hücre tipi için ayrı tek bir steril 50 milliliter konik tüpte toplayın ve her iki tüpe de dört hacim RPMI ekleyin. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, pelletleri 1,5 milliliter'lik bir tüpe aktarıp tekrar pelletleyin ve BSA ile takviye edilmiş 80 microliters taze RPMI içinde süspande edin. Ardından, mononükleer ve polimorfonükleer hücre fraksiyonlarına sırasıyla 20 microliters manyetik boncuk işaretli anti CD 14 ve anti CD 15 antikorları ekleyin.

Her bir hücre süspansiyonunu 4 °C'de 15 dakika inkübe edin ve ardından her tüpü 1 mL RPMI-BSA medyumu ile yıkayıp peletleri 500 µL RPMI-BSA içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücre süspansiyonlarını tekil, RPMI-BSA ile yıkanmış LS kolonlarına uygulayın ve her kolonu 3 mL RPMI-BSA medyumu ile üç kez yıkayın. Monositleri ve nötrofilleri izole etmek için hücre süspansiyonu akış pasajlarını ve kolon yıkamalarını steril tüplere toplayın; son yıkamanın ardından kolonları manyetik alandan çıkarın ve pozitif olarak seçilen hücreleri 5 mL RPMI-BSA ile steril bir tüpe elüye edin. Lenfositleri izole etmek için, hücre kolonunun akış pasajı yıkama fraksiyonunu çöktürün, hücre peletini 80 µL RPMI-BSA içerisinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 20 µL CD61 ve CD235A antikorları ile 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.

Ardından, maksimum ayırmayı daha önce olduğu gibi tekrarlayın ve trombositleri izole etmek için lenfositleri içeren akışlı kısmı toplayın; ayrılmış trombosit zengin plazmayı santrifüjleyin, ardından plazmayı uzaklaştırın ve hücre peletini, mililitrede bir mikrogram prostaglandin I2 eklenmiş beş mililitre steril PBS ile bir kez yıkayın. İzole edilen monositleri, lenfositleri, nötrofilleri ve trombositleri ekim yapmak üzere trombosit peletini bir mililitre taze PBS prostaglandin I2 tamponunda yeniden süspande edin. Öncelikle hücreleri sayın ve 200 mikrolitre hacimde kuyu başına 2,5 × 10⁵ hücre ekim yoğunluğu sağlayacak şekilde XF assay ortamında uygun hacme getirin. Trombositler için CellT ile kaplanmış 24 kuyucuklu bir XF hücre kültürü mikroplakasında, 200 mikrolitre hacimde kuyu başına 2,5 × 10⁷ hücre ekimi yapın.

Hücreler plaka üzerine çöktürüldükten sonra, son kuyucuk hacimlerini XF medyumu ile 660 microliters seviyesine tamamlayın ve XF analizi öncesinde plakaları 37 degrees Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında, 75 microliters analiz reaktiflerini belirtilen sırayla XF sensör kartuşu enjeksiyon portlarına ekleyin. Oksidatif patlama ölçümleri yapılacaksa, antimisin sonrası bir sonraki enjeksiyon portuna PMA enjekte edilebilir; ardından kartuşu, analizi başlatmak için hücre dışı akış analizörüne yerleştirin. Lökositlerin ve trombositlerin biyoenerjetik profilleri, hücrelerdeki oksijen tüketimini invaziv olmayan bir yöntemle gerçek zamanlı olarak ölçen seahorse XF hücre dışı akış analizörü kullanılarak belirlenebilir.

Tabloda gösterildiği gibi, her hücre tipi XF 24 mikroplakasına beş tekrar şeklinde ekilir. Deney sırasında ölçülen temsili bazal ve oksidatif burst değerleri ile kuyu başına ortalama protein konsantrasyonları hücre tipine göre gösterilmiştir. Oksijen tüketim hızı değerleri, ilgili kuyulardaki toplam protein içeriğine göre normalize edilmiş ve protein mikrogramı başına dakika başına p mol olarak ifade edilmiştir. Bazal oksijen tüketim hızı daha sonra ilk üç ölçümle belirlenir.

Mitokondriyal ATP sentaz inhibitörü olan oligomisin, ATP sentezi ile eşleşen oksijen tüketim hızını tahmin etmek için XF ortamına enjekte edilir ve ATP bağlantılı olarak temsil edilir; artık oksijen tüketim hızı ile mitokondriyal olmayan oksijen tüketim hızı arasındaki fark proton sızıntısına atfedilebilir. Ayrıştırıcı FCCP'nin eklenmesi, maksimal oksijen tüketim hızının belirlenmesini sağlar; bunu takiben, mitokondriyal respirasyon inhibitörü olan antimisin A enjekte edilerek mitokondriyal olmayan oksijen tüketim kaynakları ölçülür. Rezerv kapasite, mitokondrilerin artan enerji talebi altında gerçekleştirebileceği ek iş miktarının bir ölçüsüdür ve monositlerin ve nötrofillerin oksidatif burst kapasitesini belirlemek amacıyla, maksimal respirasyon hızı ile bazal hız arasındaki fark olarak hesaplanabilir.

P-M-A-A-P-K-C agonisti enjekte edilir ve oksijen tüketim hızındaki artış, N-A-D-P-H oksidaz tarafından gerçekleştirilen oksidant üretimi ile ilişkilendirilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde, analiz süresi hariç, kan alımını takiben sadece üç saat gibi kısa bir sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, her adımın biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmesi ve oda sıcaklığında steril tamponlar ile besiyerleri kullanılmasıyla steril koşulların korunması önemlidir. Bu prosedürün ardından; hücre saflığını, lökositlerin aktivasyon durumunu belirlemek ve ayrıca lökosit alt popülasyonlarındaki hücresel biyönerjetiyi saptamak için fax analizi gibi diğer protokoller uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra; trombositlerin, lenfositlerin, monositlerin ve nötrofillerin nasıl hazırlanacağı, bunların seahorse cihazına nasıl yerleştirileceği ve bu verilerden oksidatif patlama ile mitokondriyal fonksiyonun nasıl ölçüleceği konusunda oldukça net bir fikre sahip olmanız gerekir. Ardından, hasta popülasyonlarınızı analiz edebilir ve biyoenerjetiklerinin gerçek zamanlı olarak nasıl değiştiğini belirleyebilirsiniz. İnsan hasta örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedür sırasında kişisel koruyucu ekipman giymeniz ve bir biyolojik güvenlik kabini kullanmanız gerekmektedir.