İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Aşağıdaki protokolde, insan kan monositlerinin, lenfositlerinin, nötrofillerin ve trombositlerinin biyoenerjetik profillerinin ve oksidatif patlama yanıtlarının ölçümü gösterilecektir. Bu, ilk olarak taze alınan kandan buffy coat ve trombositten zengin plazma fraksiyonlarının toplanmasıyla elde edilir. İkinci bir adım olarak, heterojen beyaz kan hücresi popülasyonu, yoğunluk gradyanı ile mononükleer ve polimorfonükleer hücre katmanlarına ayrılır.

Daha sonra, saf monosit nötrofil ve lenfosit popülasyonları, maksimum ayırma ile daha fazla izole edilir ve daha sonra hücre dışı akı veya XF analizi için kaplanır. Sonuç olarak, monositlerde, lenfositlerde ve trombositlerde mitokondriyal fonksiyonun hassas ve tekrarlanabilir ölçümü ile monosit ve nötrofil oksijen tüketim oranlarının oksidatif patlaması XF teknolojisi ile ölçülebilir. Bugün size göstereceğimiz tekniğin avantajı, küçük bir kan örneğinden hastanın kanındaki tüm ana hücreleri hazırlayabilmenizdir.

Bunlar trombositler ve saf inaktive edilmiş formdaki lökositlerdir ve mitokondriyal fonksiyonlarını ölçerler. Bunun, daha sonra hasta içindeki çeşitli hastalıkları ve durumları gerçek zamanlı olarak yansıtabileceğini düşünüyoruz. Bu yöntem, yaşam tarzının, diyetin ve patolojik stresin mitokondriyal fonksiyon üzerindeki rolü gibi metabolizma ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu protokol, çeşitli lökosit popülasyonlarında ve trombositlerde hücresel biyoenerjetiklerin izolasyonu ve belirlenmesi için birden fazla teknolojiyi birleştirir. Protokolün bu adımı çok önemlidir çünkü yoğunluk gradyanı ve manyetik ayırma hassas pipetleme gerektirir. Ek olarak, fraksiyonlama sırasında hücre popülasyonlarının nerede olduğunun farkında olmanız gerekir.

Periferik kan hücrelerinin izolasyonunu ve 24 kuyulu hücre dışı akı analizörü veya XF 24 üzerinde hücresel biyoenerjetik analizini göstereceğiz. Bununla birlikte, bu yöntem XF 96'da da yapılabilir, Prosedüre başlamadan en az iki saat önce. XF sensör kartuş problarını XF cran solüsyonu ile nemlendirin.

Daha sonra taze çekilmiş tam kanı, sallanan bir kova rotoru olan bir santrifüjde 500 kez G ve oda sıcaklığında 15 dakika döndürün. Trombositten zengin plazmayı içeren üst tabakayı, eritrosit buffy coat tabakasının üzerinde bir santimetre plazma kalana kadar çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın ve plazmayı daha sonraki işlemler için oda sıcaklığında bir kenara koyun. Daha sonra Buffy ceketi 50 mililitrelik steril bir konik tüpe aktarın ve beyaz kan hücrelerini 24 mililitreye seyreltin.

Daha sonra bazal RPMI ile, üç 15 mililitrelik konik tüpün her birine opak 1.077 olan üç mililitre düşük yoğunluklu ekleyin. Ardından, beş mililitrelik dar bir pipetin ucunu her tüpün altına yerleştirin. Sırayla ve yavaşça üç mililitre yüksek yoğunluklu, opak 1.119'u serbest bırakın.

Şimdi, katmanları rahatsız etmeden her gradyana sekiz mililitre seyreltilmiş kanı dikkatlice eklemek için düşük güç ayarında otomatik bir pipet kullanın. Tüm degrade katmanların görselleştirilmesi için düşük yoğunluklu gradyana mavi boya eklenmiştir. Hücreleri ayrı ayrı santrifüj ile ayırdıktan sonra mononükleer ve polimorfonükleer hücreleri steril cam pipetlerle diğer hücre bantlarını rahatsız etmeden toplayın.

Mononükleer ve polimorfonükleer hücre popülasyonlarını her tüpten her hücre tipi için tek steril 50 mililitrelik konik tüplere toplayın ve her iki tüpe dört hacim RPMI ekleyin. Hücreler döndürüldükten sonra, peletleri 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın, pelet yeniden ve BSA ile desteklenmiş 80 mikrolitre taze RPMI'de yeniden süspanse edin. Daha sonra mononükleer ve polimorfonükleer hücre fraksiyonlarına sırasıyla anti CD 14 ve anti CD 15 antikorları etiketli 20 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin.

Her hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin ve ardından her tüpü bir mililitre R-P-M-I-B-S-A ortamı ile yıkayın, peletleri 500 mikrolitre R-P-M-I-B-S-A'da yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını tek tek R-P-M-I-B-S-A yıkanmış LS kolonlarına uygulayın ve her sütunu üç mililitre R-P-M-I-B-S-A ortamı ile üç kez yıkayın Monositleri ve nötrofilleri izole etmek için hücre süspansiyonu akışını ve kolon yıkamalarını steril tüplere toplayın, son yıkamadan sonra kolonları manyetik alandan çıkarın ve pozitif olarak seçilen hücreleri beş mililitre R-P-M-I-B-S-A içeren steril bir tüpe boşaltın. Lenfositleri izole etmek için, hücre kolonunun yıkama fraksiyonundan akışı peletleyin, hücre peletini 80 mikrolitre R-P-M-I-B-S-A'da yeniden süspanse edin ve hücreleri 20 mikrolitre CD 61 ve CD 2 35 A antikorunda 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra maksimum ayırmayı daha önce olduğu gibi tekrarlayın ve trombositleri, santrifüjü, ayrılmış trombositten zengin plazmayı izole etmek için lenfositleri içeren akışı toplayın ve daha sonra plazmayı çıkarın ve hücre peletini bir kez mililitre başına bir mikrogram prostaglandin I ile takviye edilmiş beş mililitre steril PBS ile yıkayın, izole edilmiş monositleri plakalamak için trombosit peletini bir mililitre taze PBS prostaglandin I iki tamponunda yeniden süspanse edin, lenfositler, nötrofiller ve trombositler. İlk olarak, hücreleri sayın ve 200 mikrolitrelik bir hacimde oyuk başına 2,5 kat 10 ila beşinci hücreye bir tohumlama yoğunluğuna izin vermek için XF tahlil ortamında uygun bir hacme getirin. Trombositler için T hücresi ile kaplanmış 24 oyuklu bir XF hücre kültürü mikroplakasında, 200 mikrolitrelik bir hacimde oyuk başına 2.5 kez 10 ila yedi hücre.

Hücreleri plaka üzerine döndürdükten sonra, son kuyu hacimlerini XF ortamı ile 660 mikrolitreye getirin ve inkübasyon yükü sırasında XF tahlilinden önce 30 dakika boyunca plakaları 37 santigrat derecede inkübe edin, 75 mikrolitre tahlil reaktifleri listelenen sırayla XF sensör kartuşu enjeksiyon portlarına. Oksidatif patlama ölçümleri elde edilecekse, antimisin'den sonra PMA enjekte edilebilir, ardından enjeksiyon portu yüklemesi, teste başlamak için kartuşu hücre dışı akı analizörüne yerleştirin. Lökositlerin ve trombositlerin biyoenerjetik profilleri, hücrelerde gerçek zamanlı oksijen tüketimini non-invaziv olarak ölçen denizatı XF hücre dışı akı analizörü kullanılarak belirlenebilir.

Her hücre tipi, tabloda gösterildiği gibi beş kopya ile XF 24 mikroplaka üzerine kaplanır. Test sırasında ölçülen temsili bazal ve oksidatif patlama değerleri ve oyuk başına ortalama protein konsantrasyonları hücre tipi ile gösterilir: Oksijen tüketim oranı değerleri, karşılık gelen oyuklardaki toplam protein içeriğine normalize edilir ve proteinin mikrogramı başına dakikada p mol olarak ifade edilir. Bazal oksijen tüketim oranı daha sonra ilk üç ölçümle belirlenir.

Bir mitokondriyal A TP sentaz inhibitörü olan oligo misin, bir TP sentezine bağlı oksijen tüketim oranını tahmin etmek için XF ortamına enjekte edilir ve artık oksijen tüketim oranı eksi mitokondriyal olmayan oksijen tüketim oranı proton sızıntısına bağlanabilir. Ayırma FCCP'sinin eklenmesi, maksimum oksijen tüketim oranının belirlenmesine ve ardından mitokondriyal olmayan oksijen tüketimi kaynaklarını ölçmek için antimisin a ve bir mitokondriyal solunum inhibitörü enjeksiyonuna izin verir. Rezerv kapasitesi, mitokondrinin artan enerji talebi altında gerçekleştirebileceği ek iş miktarının bir ölçüsüdür ve monositlerin ve nötrofillerin oksidatif patlama kapasitesini belirlemek için maksimum solunum hızı ile bazal arasındaki fark olarak hesaplanabilir.

P-M-A-A-P-K-C agonisti enjekte edilir ve oksijen tüketim oranındaki artış, N-A-D-P-H oksidaz tarafından oksidan üretimine bağlanır Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa testin kendisi dahil değil, kan alımını takiben üç saat gibi kısa bir sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, her adımı bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirerek ve steril oda sıcaklığında tamponlar ve ortamlar kullanarak steril koşulların korunması önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücrelerin saflığını, lökositlerin aktivasyon durumunu belirlemek ve ayrıca lökosit alt popülasyonlarındaki hücresel biyoenerjetik değerleri belirlemek için faks analizi gibi başka protokoller de yapabiliriz.

Bu videoyu izledikten sonra, trombositleri, lenfositleri, monositleri ve nötrofilleri nasıl hazırlayacağınız ve bunları denizatına nasıl koyacağınız ve bu verilerden oksidatif patlama ve mitokondriyal fonksiyonu nasıl ölçeceğiniz konusunda oldukça net bir fikre sahip olmalısınız. Daha sonra hasta popülasyonlarınızı analiz edebilir ve biyoenerjetik değerlerinin gerçek zamanlı olarak nasıl değiştiğini belirleyebilirsiniz. İnsan hasta örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu işlem sırasında kişisel koruyucu ekipman giymeniz ve biyolojik güvenlik kabini kullanmanız gerekir.