Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi
4 Nisan 2016
Burada izole edilmiş insan trombosit Ben rotenone inhibitör kompleksi cevaben metabolik uyarlamalar incelemek için ex vivo olarak erişilebilir bir şekilde modeli kullanılabilir göstermektedir. Bu yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile izotopik izleme ve nispi miktarını kullanır ve çalışma düzeni, çeşitli uygulanabilir.
Bu prosedürün genel amacı, bir ksenobiyotik tedavinin veya bir hastalık durumunun hücresel metabolizmayı nasıl değiştirdiğini belirlemektir. Bu yöntem, bir hastalık durumunun veya uygulanan bir toksinin hücresel metabolizmayı nasıl etkilediğini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Ve bu bir kez bilindiğinde, yöntemimiz bir tür müdahalenin kusuru düzeltip düzeltemeyeceğini ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir.
Bu tekniğin temel avantajı, dönüştürülmüş hücre hatlarına dayanmamasıdır, bu nedenle insan sağlığıyla doğrudan ilgili cevaplar verme olasılığı daha yüksektir. Bu işleme başlamak için, dimetil sülfoksit içinde 10 milimolar bir rotenon stok çözeltisi hazırlayın. Bir nanomolar ila 100 mikromolar arasında değişen rotenon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler elde etmek için 10 milimolar rotenon stok çözeltisinin seri seyreltmesini gerçekleştirin.
Daha sonra, 10 pikomolar ila bir mikromolar arasında değişen rotenon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler hazırlamak için önceden hazırlanmış zenginleştirilmiş bir Tyrode tampon çözeltisinin beş mililitresine her bir stok çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin. Araç kontrolü olarak hizmet etmek için tampon çözelti örneklerinden birine 50 mikrolitre DMSO ekleyin. Trombositleri tam kandan izole etmek için, tam kan örneklerini 175 x g'da 15 dakika boyunca ara vermeden santrifüjleyin.
Bittiğinde, üst trombositten zengin plazma tabakasının bir mililitresini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Trombositten zengin plazmayı transfer ederken, trombosit peletinin lenfositler tarafından kontamine olmaması için buffy kaplamayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Trombositten zengin plazma tabakasını beş dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
Ardından, süpernatenti aspire edin. Her koşul için en az üç biyolojik kopya kullanarak, trombosit peletini önceden hazırlanmış her bir rotenon çözeltisinin bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Bunu takiben, yeniden süspanse edilmiş trombositleri, bir saat boyunca 37 santigrat derecede %95 nem ve %5 karbondioksite ayarlanmış su ceketli bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.
Bu noktada, numuneleri üç dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyerek trombositleri peletleyin. Supernatent'i aspire ettikten sonra, uygun kararlı izotop etiketli iç standardı ekleyin. Daha sonra trombositleri 750 mikrolitre buz gibi %10 trikloroasetik asit içinde tekrar süspanse edin.
Her numuneyi 0,5 saniyelik darbelerle 30 kez sonikleştirin. Santrifüjlemenin ardından, C18 katı faz ekstraksiyon kolonlarını bir vakum manifolduna takın. Sütunları bir mililitre metanol ile şartlandırın.
Ardından, sütunları bir mililitre çift damıtılmış su ile dengeleyin. Örnekten türetilmiş süpernatenti sütunlar arasında çalıştırın. Bittiğinde, sütunları bir mililitre su ile yıkayın.
Ardından, elüsyon fraksiyonlarını toplamak için 10 mililitrelik cam santrifüj tüplerini vakum manifolduna yükleyin. Sütunları bir mililitre 25 milimolar amonyum asetat ve metanol ile elute. Elüatı nitrojen gazı altında kuruttuktan sonra, kurutulmuş kalıntıları 50 mikrolitre% 5-sülfosalisiklik asit içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri analiz için HPLC dosyalarına aktarın.
SH-SY5Y hücrelerinde daha önce bildirildiği gibi, rotenona yanıt olarak aseil CoA tiyoesterlerinin nispi seviyelerindeki değişikliklerin, kompleks olanın inhibisyonundan kaynaklandığı varsayılmaktadır. Spesifik olarak, süksinil CoA'da doza bağlı bir azalma ve aynı anda beta-Hidroksibütiril-CoA'da bir artış olurken, asetil CoA seviyeleri değişmedi. Rotenon ile tedavi edilen insan trombositlerinin analizi, son derece tutarlı sonuçlar ortaya çıkarır ve benzersiz bir deneysel veri seti sağlar.
Bu gözlemin, trombositlerin çekirdeği olmadığı için rotenona verilen yanıtın mitokondriyal bağımlılığının altını çizdiğine dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, aşağıdakiler gibi ek soruları yanıtlamak için metabolik izleme gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir: Bu tedavi veya hastalık durumu substrat kullanımını nasıl etkiler? Bazı metabolitlerin seviyelerindeki değişiklikleri tespit edersek, neden değişiyor?
Yoldaki hangi adımlar etkilenir ve ne şekilde? Bu videoyu izledikten sonra, trombositleri tam kandan nasıl izole edeceğinizi, kontrollü ex-vivo mücadeleyi nasıl gerçekleştireceğinizi ve LCMS analizi için aseil CoA tiyoesterlerini nasıl çıkaracağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, karmaşık I inhibitörü rotenon'a karşı metabolik adaptasyonları araştırmak için ex vivo bir model olarak izole insan trombositlerin kullanımını göstermektedir. Yöntem, göreceli kantitasyon için izotopik izleme ve sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi kullanmaktadır ve bu, çeşitli çalışma tasarımlarına uygulanabilir kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel metabolizma
- Farmakoloji
- İnsan sağlığı ile ilgililik
Arka Plan
- Ksenobiyotiklerin hücresel metabolizmayı nasıl etkilediğini anlamak çok önemlidir.
- İzole insan trombositler, dönüştürülmüş hücre hatlarına kıyasla daha ilgili bir model sunar.
- Bu yaklaşım, metabolik bozukluklar için potansiyel müdahaleleri belirlemeye yardımcı olabilir.
- Rotenon, metabolik değişiklikleri incelemek için karmaşık I inhibitörü olarak kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Ksenobiyotik tedavinin hücresel metabolizma üzerindeki etkilerini belirlemek.
- Hastalık durumlarının metabolik süreçleri nasıl değiştirdiğini keşfetmek.
- Metabolik bozuklukları düzeltmek için müdahalelerin potansiyelini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Dimethyl sülfoksit içinde 10 milimolarlık bir rotenon stoğunun hazırlanması.
- Çeşitli konsantrasyonlar elde etmek için rotenon stokunun seri seyreltilmesi.
- Metabolik analiz için izotopik izleme.
- Kantitasyon için sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi.
Ana Sonuçlar
- İzole trombositler, rotenon'a metabolik tepkileri etkili bir şekilde modeller.
- Izotopik izleme, önemli metabolik adaptasyonları ortaya çıkarır.
- Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi, doğru kantitasyon sağlar.
- Yöntem, çeşitli deneysel tasarımlara uygulanabilir.
Sonuçlar
- İzole insan trombositler, metabolizmayı incelemek için değerli bir modeldir.
- Bu yaklaşım, hastalık mekanizmaları ve potansiyel tedaviler hakkında bilgilere yol açabilir.
- Gelecek çalışmaları, bu yöntemi diğer metabolik yolları keşfetmek için genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Human platelets offer a clinically relevant, non-transformed model for studying mitochondrial metabolism and xenobiotic effects, addressing limitations of cancer cell lines in metabolic research. This platform enables reproducible, donor-specific analysis of metabolic pathway alterations, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Scalability via blood bank sourcing facilitates translational continuity from basic discovery to preclinical and clinical studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by probing mitochondrial responses to complex I inhibitors like rotenone.
- Operational Value: Provides a human-relevant system that reduces confounding variables from metabolic reprogramming in transformed cell lines.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through consistent detection of compensatory metabolic shifts, such as increased fatty acid oxidation upon glycolysis inhibition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative LC-MS readouts of acyl-CoA thioesters, enabling relative quantification and isotopic labeling for pathway-specific activity assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible metabolite profiles across biological replicates, supporting assay standardization for xenobiotic screening campaigns.
- Scalability: Platelet isolation from individual donors or blood banks allows scalable production of metabolically active samples for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects ex vivo platelet responses to in vivo metabolic adaptations, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed metabolic changes are mitochondria-dependent, as evidenced by responses in anucleate platelets.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of intervention efficacy in reversing metabolic defects, informing go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for mitochondrial-targeted compounds and metabolic modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of xenobiotic effects on cellular metabolism by isolating platelet responses to dose-dependent rotenone treatment.
- Screening: Enables assay-ready preparation of platelets for LC-MS analysis, yielding reproducible quantitative outputs for compound library screening.
- Analytics: Provides relative quantification of acetyl-CoA, succinyl-CoA, and beta-hydroxybutyryl-CoA thioesters, enabling comparison of metabolic flux across conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by modeling metabolic adaptations relevant to disease states and therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platelet isolation and metabolite extraction workflow applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by using a physiologically relevant human model that avoids cancer cell line artifacts.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized platelet isolation, ex vivo challenge, and metabolite extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of metabolic liabilities, reducing late-stage attrition due to unforeseen mitochondrial toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on core metabolic pathways in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in platelet isolation, sterile cell handling, and LC-MS/MS metabolomics.
- Dependent on access to centrifugation equipment, vacuum manifolds for solid-phase extraction, and HPLC-MS systems.
- Necessitates standardization of platelet-rich plasma preparation and rotenone dosing across laboratories and donors.
- Involves adaptation considerations for different xenobiotics and isotopic labeling schemes.
- Limited by platelet viability ex vivo and the need for immediate processing post-isolation to maintain metabolic integrity.
