Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi

Bu prosedürün genel amacı, bir ksenobiyotik tedavinin veya bir hastalık durumunun hücresel metabolizmayı nasıl değiştirdiğini belirlemektir. Bu yöntem, bir hastalık durumunun veya uygulanan bir toksinin hücresel metabolizmayı nasıl etkilediğini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Ve bu bir kez bilindiğinde, yöntemimiz bir tür müdahalenin kusuru düzeltip düzeltemeyeceğini ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir.

Bu tekniğin temel avantajı, dönüştürülmüş hücre hatlarına dayanmamasıdır, bu nedenle insan sağlığıyla doğrudan ilgili cevaplar verme olasılığı daha yüksektir. Bu işleme başlamak için, dimetil sülfoksit içinde 10 milimolar bir rotenon stok çözeltisi hazırlayın. Bir nanomolar ila 100 mikromolar arasında değişen rotenon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler elde etmek için 10 milimolar rotenon stok çözeltisinin seri seyreltmesini gerçekleştirin.

Daha sonra, 10 pikomolar ila bir mikromolar arasında değişen rotenon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler hazırlamak için önceden hazırlanmış zenginleştirilmiş bir Tyrode tampon çözeltisinin beş mililitresine her bir stok çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin. Araç kontrolü olarak hizmet etmek için tampon çözelti örneklerinden birine 50 mikrolitre DMSO ekleyin. Trombositleri tam kandan izole etmek için, tam kan örneklerini 175 x g'da 15 dakika boyunca ara vermeden santrifüjleyin.

Bittiğinde, üst trombositten zengin plazma tabakasının bir mililitresini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Trombositten zengin plazmayı transfer ederken, trombosit peletinin lenfositler tarafından kontamine olmaması için buffy kaplamayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Trombositten zengin plazma tabakasını beş dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.

Ardından, süpernatenti aspire edin. Her koşul için en az üç biyolojik kopya kullanarak, trombosit peletini önceden hazırlanmış her bir rotenon çözeltisinin bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Bunu takiben, yeniden süspanse edilmiş trombositleri, bir saat boyunca 37 santigrat derecede %95 nem ve %5 karbondioksite ayarlanmış su ceketli bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

Bu noktada, numuneleri üç dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleyerek trombositleri peletleyin. Supernatent'i aspire ettikten sonra, uygun kararlı izotop etiketli iç standardı ekleyin. Daha sonra trombositleri 750 mikrolitre buz gibi %10 trikloroasetik asit içinde tekrar süspanse edin.

Her numuneyi 0,5 saniyelik darbelerle 30 kez sonikleştirin. Santrifüjlemenin ardından, C18 katı faz ekstraksiyon kolonlarını bir vakum manifolduna takın. Sütunları bir mililitre metanol ile şartlandırın.

Ardından, sütunları bir mililitre çift damıtılmış su ile dengeleyin. Örnekten türetilmiş süpernatenti sütunlar arasında çalıştırın. Bittiğinde, sütunları bir mililitre su ile yıkayın.

Ardından, elüsyon fraksiyonlarını toplamak için 10 mililitrelik cam santrifüj tüplerini vakum manifolduna yükleyin. Sütunları bir mililitre 25 milimolar amonyum asetat ve metanol ile elute. Elüatı nitrojen gazı altında kuruttuktan sonra, kurutulmuş kalıntıları 50 mikrolitre% 5-sülfosalisiklik asit içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri analiz için HPLC dosyalarına aktarın.

SH-SY5Y hücrelerinde daha önce bildirildiği gibi, rotenona yanıt olarak aseil CoA tiyoesterlerinin nispi seviyelerindeki değişikliklerin, kompleks olanın inhibisyonundan kaynaklandığı varsayılmaktadır. Spesifik olarak, süksinil CoA'da doza bağlı bir azalma ve aynı anda beta-Hidroksibütiril-CoA'da bir artış olurken, asetil CoA seviyeleri değişmedi. Rotenon ile tedavi edilen insan trombositlerinin analizi, son derece tutarlı sonuçlar ortaya çıkarır ve benzersiz bir deneysel veri seti sağlar.

Bu gözlemin, trombositlerin çekirdeği olmadığı için rotenona verilen yanıtın mitokondriyal bağımlılığının altını çizdiğine dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, aşağıdakiler gibi ek soruları yanıtlamak için metabolik izleme gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir: Bu tedavi veya hastalık durumu substrat kullanımını nasıl etkiler? Bazı metabolitlerin seviyelerindeki değişiklikleri tespit edersek, neden değişiyor?

Yoldaki hangi adımlar etkilenir ve ne şekilde? Bu videoyu izledikten sonra, trombositleri tam kandan nasıl izole edeceğinizi, kontrollü ex-vivo mücadeleyi nasıl gerçekleştireceğinizi ve LCMS analizi için aseil CoA tiyoesterlerini nasıl çıkaracağınızı iyi anlamış olmalısınız.