Name: Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Öğrenin, E. coli kullanarak disülfid açısından zengin hayvan zehir proteinlerinin yüksek verimli ifade taraması ve arıtma yöntemini. Otomatik sıvı işleme robotu ile çözünür protein seviyelerini nicelendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma VENOMICS projesi, Yedinci Çerçeve Programı (FP7 SAĞLIK 2011-2015) aracılığıyla 278.346 ° Avrupa projesi hibe N tarafından desteklenmiştir. VENOMICS proje Avrupa&#39;nın çeşitli araştırma kurumları ve şirketler arasında bir işbirliği olduğunu: AFMB, Aix-Marseille Université (Fransa), CEA Saclay (Fransa), NZYTech (Portekiz), SistemasGenomicos (İspanya), Üniversite de Liege (Belçika), VenomeTech (Fransa), Vitamib (Fransa), Zealand Pharma (Danimarka) Bu çalışma Entegre Yapısal Biyoloji (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01 için Fransız Altyapı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca video çekim için hazırlıkları ile yardım için Sayın Jeremy Turchetto teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li>
<li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli%3A+advantages+of+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li>
<li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li>
<li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li>
<li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems%3A+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li>
<li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37(2013).</li>
<li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusions+to+maltose-binding+protein%3A+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li>
<li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32(2007).</li>
<li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67(2010).</li>
<li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129(2012).</li>
<li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li>
<li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865(2013).</li>
<li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li>
<li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+%28Collection+Rencontres+en+Toxicologie%2C+Publications+de+la+SFET%2C+Chatenay-Malabry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+and+new+technologies+in+toxinology%22%5BJournal%5D)">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li>
<li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARINE-EXPRESS%3A+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact.%22%5BJournal%5D)">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45(2010).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 Forthcoming.</li>
<li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li>
<li>Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaez%2C+NJ+%22Structural+Genomics%3A+General+Applications+%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22">Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology</a>. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+%28R%29+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li>
<li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+pharmacology+under+flow%3A+automation+via+well-plate+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li>
<li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synergistic+approach+to+protein+crystallization%3A+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li>
<li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZanier%2C+K+%22Structural+basis+for+hijacking+of+cellular+LxxLL+motifs+by+papillomavirus+E6+oncoproteins%22">Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins</a>. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).</li>
<li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P1%27+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li>
<li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli%3A+becoming+faster+and+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RF+cloning%3A+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çözünür, katlanmış, fonksiyonel proteinlerin ifadesi için tek bir genel protokol vardır. , Maliyet ve zaman verimli çoklu hedefleri ile çalışan en laboratuarlar veya protein çekirdek tesisleri nedenle hedeflerin çoğunluğu için çözünebilir aktif bir protein elde etmek için değişkenlerin en iyi &#39;genel&#39; kombinasyonunu bulmak için tarama yüksek verimlilik protein ifadesini kullanın. Biz, disülfid zengin peptidler ve proteinler 11 çözünebilir ifadesi için genel olarak uygulanabilir bir füzyon ortağı olarak DsbC belirledik. DsbC füzyonları ve yüksek verimli yöntemler kullanılarak, bir hafta içinde birden fazla hedefin çözünebilir ifadesi 11 gözlenebilir ve daha sonra, giriş kısmında ele alınanlar gibi ek değişkenler, daha fazla optimizasyon gerektiren hedeflere sonraki turda taranabilir. Burada tarif edilen protokoller disülfid bakımından zengin proteinler ve peptidlerin ifadesi yöneliktir. Ancak, kullanıcılar için exp isteyenbir yüksek verimli bir şekilde Arş olmayan ağ gibi örülmüş proteinleri, karşılık gelen protokollerin daha önce yayınlanmış olan ve başka bir yerde 22,24 bulunabilir. Yüksek verimli kurulum çözünebilir ifadesi ya da aynı anda birden fazla hedef gen için (çeşitli füzyon etiketler de dahil olmak üzere) bir ekspresyon yapıları, çok sayıda taranması için farklı proteinlerin büyük sayıda taranması dahil olmak üzere, bir dizi uygulamalar, (için idealdir veya birden fazla ifade başarı oranlarını artırmak için tek bir hedef) için oluşturur. Platform ayrıca hedeflerin çok sayıda yeni protokollerin kıyaslama ve doğrulama için kullanılabilir. Diğer uygulamalar, tek zor bir hedef için varyantların tarama, örneğin, tüm ortologlarını veya aynı aile üyeleri, ya da bir deneyde, tek bir hedefin mutantlarının bir panelinin üretimi başarısını test etmek için bulunur. Bu protokol, aynı zamanda ortak-sentezleme vektörleri (wit ile bir arada kullanılmaktadırh bir aşağı çekme ve doğru kompleks oluşumu ve stokiyometrisinden 33 onaylamak için daha kapsamlı biyofiziksel analizi takip protein-protein komplekslerinin ön karakterizasyonu izin) sadece protein etiketledi. Saflaştınldı protein miktarı, mikro-analizleri (fonksiyonel testler, protein-DNA 34 veya protein-protein etkileşimi deneyleri) bazen uygundur. Yüksek verimli sentezleme tarama stratejisi için bir çok avantajı vardır: (i) hedef, çok sayıda test yeteneği ya da tek bir deneyde değişken çok sayıda, (ii) sınırlı partiden partiye değişkenlik, (iii) basitlik ve (v) otomasyon potansiyeli ve izleme (vi), basitlik, daha büyük bir ölçekte, derin kuyular, (iv) ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirliği ile daha küçük bir ölçekte çalışan ve bireysel tüplerin (no etiketleme, daha az işleme kolaylığı ) karıştırma bireysel tüplerin kullanımı ile daha plaka formatı kullanılarak veya klonlarının değişiminde ortaya hatalar. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; protokol bölümde ele birlikte, aşağıda kısaca ele alınacaktır deney hazırlanması için, pek çok önemli hususlar bulunmaktadır. Daha ayrıntılı bir tartışma için, önceki yayın 24 bakın. Maksimum verimlilik için, bu hedeflerin çok sayıda alt-klonlama kolaylaştırmak için, yüksek verimli klonlanması için uygun bir sistem olması faydalıdır. VENOMICS Projenin ilk aşamasında, biz haftada klonların yüzlerce bir tempoda herhangi bir hedef vektörü olarak subklonlama verir yönlü Geçidi rekombinasyon sistemini 25 kullanmaktadır. Ağ Geçidi rekombinasyon klonlama için Protokoller Invitrogen web sitesinde bulunabilir. Yüksek verimli klonlanması için diğer alternatifler 37 klonlama ligasyon bağımsız klonlama (LIC) 35,36 ve kısıtlama içermeyen (RF) içerir. Giriş klon koleksiyonlarından, şablon DNA&#39;dan PCR ile dahil olmak üzere, ekspresyon için hedef genlerin elde edilmesi için birden çok yolu vardır ya daVENOMICS proje için seçilen strateji sentetik genler,. Sentetik genlerin gen ve gen sentezi her iki ucundaki rekombinasyon ile birlikte sipariş edilebilir Hedef gen dizisinin kolay kodon optimizasyonu (nadir E. coli kodonu hariç) sağlar. Bu önerilir, ancak gerekli değildir. Nadir kodonların yüksek bir sayı, Rosetta 2 (yüksek derecede E. coli içinde ifade edilmeyen ender kodonlar için tRNAs taşır) (DE3) pLysS içeren kodon optimizasyonu olmadan hedefler için BL21 (DE3) pLysS daha uygun olabilir. Sitoplazma normal indirgeyici çevrede disülfid bağların azaltılması sınırlamak suşları olsa da, elimizdeki düzenli E kadar başarılı olmamıştır coli suşları 11. Analitik ölçek afinite saflaştırma çözünebilir füzyon proteinleri geri ve verimleri ölçmek amacıyla test sentezleme kültürlerden gerçekleştirilir. Nicel veriler inci elde edilebilirkültür, 100 mg / L - 0.1 aralığında ifade edilen füzyon proteinlerinin çözülebilir e verimleri. Hedef çözünür değilse, farklı füzyon ortakları takip önce, alternatif ifadesi ve indüksiyon sıcaklıkları suşları veya ortam test edilebilir. Disülfid açısından zengin proteinlerin çözülebilir ekspresyonu için, daha önce ifade sitoplazmik 11 DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-etiketi olarak füzyon ortaklarının etkisini sırada yer almaktadır. Periplazma ifadesi disülfid zengin hedeflerin başarılı katlanmasına yardımcı olabilir başka bir olasılıktır. Periplazma sitoplazmada daha az indirgeyici ortam ve disülfid bağ yardımcı olmak için kullanışlı redoks şaperonlar içerir. DsbC, DsbA ve MBP periplazmik proteinlerin normal olarak sinyal dizileri ile periplazma lokalizedir. Bu katlama yardımcı olmak amacıyla, periplazmik boşluğa disülfid zengin hedefleri doğrudan bu etiketleri yararlanmak için bir fırsat sağlar. Inatçı hedefler için, bir sonraki adım p olacaktır(bu protokol kapsamı dışında olan ve burada 3 9 ele olmayacak), çözünmesi ve katlanamayan, katma gövdelerinden çözünmeyen HIS-etiketli hedef urify. Bu, yalnızca bir ya da iki disülfid bağları ile hedefler için oldukça basit olabilir, ama disülfid bağları sayısı arttıkça giderek daha zor hale gelir olabilir. Seçenek olarak ise, özellikle dört veya daha fazla disülfür bağları ile protein ve peptidler için, bu tür maya, böcek ya da memeli ekspresyon gibi daha karmaşık üretim sistemleri denemek için yararlı olabilir. Minyatür ve otomasyon gelişmeler ile, HTP elektrofizyoloji lab-on-a-chip teknolojileri 28 şüphesiz fonksiyonel analizler için geleceğin yol olacaktır. Biz, (belki de yapısal çalışmaları hariç) bu büyük ölçekli kültürler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır doyurmaya çok amaç için düşünüyoruz. Küçük çaplı kültürler sentezleme koşulları taranması için faydalı değil, aynı zamanda mak, sağlamak mümkün olmazficient Bu minyatür işlevsel tahliller için örnek tutarındadır. Fonksiyonel karakterizasyonu için yeterli miktarlarda paralel olarak birden fazla hedefin üretme yeteneği kültürlenmesi ve platformlar, bu tür kullanarak maliyetlerini düşürür, rekombinant proteinlerin ekspresyonu ve karakterizasyonu daha fazla maliyet ve zaman etkili olacaktır. Protokoller, burada 7. Çerçeve Avrupa VENOMICS projesinin başlangıç ​​aşamasında disülfid zengin peptidler ve proteinlerin ekspresyonu için uygulanmıştır. Zehirleri ilginç genellikle farmakolojik potansiyeline sahip biyoaktif peptitler mükemmel bir kaynağıdır. Bununla birlikte, bunların üretimi nedeniyle karmaşık disülfür bağ kalıpları ve küçük bir boyuta zordur. Burada tarif edilen gibi yüksek verimli platformları kullanarak, VENOMICS proje doğada görülen çeşitliliğini yeniden üretmek için 10,000 yeni venom peptidleri içeren bir kitaplık oluşturmak için amaçlamaktadır. Bu kütüphane, disülfid-r karakterizasyonu için yararlanılabilir doyurmayayeni ilaçlar geliştirmek amacıyla olası farmakolojik veya terapötik uygulamalar ile ich peptidler. Platform şu anda VENOMICS projesinde kullanılmak üzere yeni protokoller kıyaslama ve doğrulamak için kullanılan ediliyor.

Genomik ilerlemesi ve yeni proteinlerin keşif hızlandırılmış oranda motive olmuş, yüksek verim boru hatları tarama ve optimal protein üretim stratejilerinin belirlenmesi için geleneksel yaklaşımlar parallelize için geliştirilmiştir. Optimize edilmesi olası değişkenler farklı sentezleme hedef şaperonlar 14,15, 5, füzyon ortakları 6-13, ko-ifade varyantları, 1,2, 3,4 sıcaklık, ortam 2,3 suşları, sitoplazmik arasında, ancak bunlarla sınırlı değildir: ya da periplazmik ifade 16-18 ve arıtma tampon bileşenler 3. Batch-parti varyasyon sınırlandırarak, yüksek verimlilik yaklaşımlar, çok değişken ya da pek çok hedef verimliliği yüksek düzeyde paralel olarak test edilebilir uygulayarak. Bizim tecrübelerimize göre, strateji de aynı kültürü (sıcaklık, medya, havalandırma, vb) ve arıtma koşulları (aynı resi kullanarak ölçek-up üzerine iyi tekrarlanabilirlik verirn, tamponlar, vb.) Çeşitli yüksek verimli platformları, yani bu tip füzyon ortakları, ekspresyon suşları veya sıcaklık 19-23 gibi değişik parametreler aracılığıyla, çözünür protein ifadesi için koşulları belirlemek için son on yıl içinde kullanılmıştır. Yakın zamanda çözünür disülfid açısından zengin proteinlerin 11 ekspresyonu için yüksek verimli tarama yaklaşımı kullanılabilir. Seçilen Proteinler zehirli kaynaklarından sadece, ama aynı zamanda bitkilerin, domuz, inek ve insan da dahil olmak üzere türlerinin geniş bir disülfid zengin enzim inhibitörleri dahildir. Deney, 12 farklı füzyon ortakları ve 28 disülfür ağsı proteinlerin çözünürlüğüne ve katlama üç farklı ekspresyon suşları etkilerini karşılaştırdık. Bu soy BL21 içinde üretimi için bir füzyon partneri (DE3) pLysS olarak DsbC kullanılarak çok outproduced (elde edilen çözünebilir proteinlerin verimi ve sayısı hem de) gerilme ve kaynaşma bunların herhangi bir kombinasyonu test edilen 11 olduğunu gösterdi.Bu deneyin sonuçları disülfid zengin hedeflerin ekspresyonu için daha uygun bir içine (proteinlerin geniş bir ekspresyon taramasında kullanılmıştır) orijinal genel yüksek verimlilik boru hattı 22,24 uyarlanması için temel oluşturmuştur. Hayvan zehirlerinden disülfit zengin proteinleri özel ilgi konusudur. Zehirleri farmakolojik ve terapötik potansiyel değeri ile, biyolojik olarak aktif peptidler ve proteinlerin bir karmaşık bir karışımıdır. Bununla birlikte, disülfid bağı ihtiva eden proteinlerin ifadesi önemsiz değildir. Bu proteinler genellikle yedi disülfid bağları göre bir içerirler, ve aktif olmak için doğru disülfid bağlayıcı desenleri ile okside edilmesi gerekir. Şu anda, platform 7. Çerçeve Avrupa VENOMICS Projesi (www.venomics.eu) bir parçası olarak disülfit zengin zehir hayvansal proteinlerin büyük sayıda ekspresyonunu tarama ve hedefler binlerce yüksek kapasiteli ekspresyon için yeni protokolleri kıyaslama için kullanılıyor . Burada, otomatik bir yöntemyüksek verimlilik küçük ölçekli ekspresyon tarama ve arıtma için (bkz. Şekil 1) için sağlanmıştır disülfid zengin hayvan zehir proteinleri uygulanabilir. Disülfid zengin peptitler ve proteinler için bir strateji, hedef proteinlere HIS-bölünebilir DsbC füzyonları oluşturmak saflaştırma ve redoks-aktif füzyon partneri, DsbC için bir HIS-etiketi, (bkz. Şekil 2) kullanır. Protokollerin odağı burada bir sıvı taşıma robot ve HTP elektroforezi kullanılarak otomasyon iken, bu yöntemler bir temel kurulum bile laboratuvarlar pahalı ekipman için herhangi bir önkoşul olmadan protokollerin yararlanabilirsiniz yani, aynı zamanda yüksek verim manuel yaklaşım için uygundur . Arıtılmadan ve analiz (disülfid zengin proteinlere özgü olmayan) için transformasyon için başka protokoller Manual 24 yayınlanmıştır ve burada tekrar edilmeyecektir. Rekombinant ile üretilen sentezleme klonundan manuel prosedürün hacmi (çözünür protein seviyelerinin analizi ulusal klonlama 25) SDS-PAGE algılama) veya 384 (4 x 96 kullanılarak (96 olduğu, (bkz. Şekil 1)), haftada kültürleri nokta leke ve SDS-PAGE 26 kullanılmıştır. (Örneğin, bir kaliper GXII LabChip sistemi 22 ile olduğu gibi, bir sıvı kotarma robotu ve nokta leke veya 26 HTP elektroforez kullanılarak bir yarı-otomatik bir şekilde gerçekleştirilir, bu arttırılabilir burada tarif edildiği gibi bir hafta boyunca paralel olarak en fazla 1,152 (12 x 96) kültürleri, sonuçlar) analizi için. Düzenli sallayarak inkübatör yeterli havalandırma için kısa yörünge yüksek hızda sallayarak kuluçka kullanımını gerektiren 96 (DW96) formatında, (sallayarak derin kuyu içinde yetiştirilen kültürler aksine kullanılabilir böylece kültürleme derin kuyuda 24 (DW24) biçiminde yapılır 800 rpm). Otomatik indüksiyon ortamı 27&#39;nin kullanımı da manuel indüksiyon aşamasını ortadan kaldırarak, ifade kolaylaştırır. Laboratuarlar zaten önceden tanımlanmış ifade ve Puri kullanmak hatta neredebahsedilmekte koşulları, bu sadece verimliliği artırmak için bu HTP sisteme doğrudan transfer edilebilir. Disülfid zengin proteinleri için yüksek verimli tarama hattı ayrıntılı bir şematik Şekil 3 &#39;de verilmiştir. Boru hattı parametreleri ile proteinlerin üretimi için en faydalı koşullarını seçmek için izin kapsamlı tarama deneylerinde, 11, 22 göre seçildi. Karakterizasyon numunenin mikrogram onlarca yeterli, veya hassas fonksiyonel deneyleri ve bağlama deneylerinde (örneğin, düşük hacimli HTP patch clamp sistemleri 28) için kılavuz çalışmalarında küçük ölçekli ifadeleri tarafından doğrudan saflaştırılmıştır etiketli proteinler üzerinde gerçekleştirilebilir. Aynı hatta etiketi ve proteaz (ters faz HPLC ile, örneğin) kaldırılır mesafede, yarılmadan sonra etiketsiz hedeflere gerçekleştirilebilir. Kalite kontrolü de (beklenen boyutu ve oksidasyon st teyit etmek için kütle spektrometresi ile yapılabilirate) veya kromatografik yöntemler () 29 saflığını veya heterojenliği onaylayın. Bazen bölünme (özellikle zayıf çözünür proteinler 30,31 için) gereksiz ve hatta istenmeyen bir etiket, bu nedenle bu protokol bölünmesinde isteğe bağlıdır. Ne olursa olsun, tüm yapılar, doğrudan (Şekil 2 ve Tartışma) bölünmesinden sonra yerli protein üretmek için, hedef genin bir önceki TEV proteaz bölünme sitesi (ENLYFQ / [G] 32) vardır. , Füzyon etiketinin yarılması isteniyorsa, bölünme etkinliğini analiz etmek için, küçük ölçekli (elüsyon fraksiyonu üzerinde ya da &#39;sütunu&#39;) test edilebilir, daha sonra ölçek büyütme deneyleri için verim güvenilir bir tahminini elde etmek ve eğer gerekli koşulları optimize eder. Afinite saflaştırma sırasında kullanılan tanelerin hacim için iki seçenek Deneyin amaçları ve beklentilere bağlı olarak bulunmaktadır. (Pilot deneyleri ya da MS saflaştırmak için ya da extrapol için mümkün olduğu kadar çok protein yakalamak edebilmek) ölçek büyütme elde etmek yedi reçinenin 200 ul nihai hacim sistemin doyurulmasından önce 1-100 mg / L kültür aralığında çözünür proteinin saptanmasını sağlayan kullanılmalıdır) Bölüm 8.1 &#39;de (protokolü (A bakınız) . Deneyin amacı, çözünebilir proteinlerin düşük miktarlarının tespiti ise, ancak, o zaman reçinenin 50 ul&#39;lik bir nihai hacim (B (protokolüne 0.1-25 mg / L kültür aralığında çözünür proteinin saptanmasına olanak tanıyan, uygun bir ) Bölüm 8.2). Gerekirse Üretim çözünebilir ifadesi için tanımlanan koşullar kullanılarak daha fazla yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için saflaştınldı hedefler miligram miktarları elde etmek için, yukarı ölçeklendirilebilir. AFMB kullanılan ölçek-up protokollerinin ayrıntıları başka bir yerde 22,24 tartışılmıştır. Deney düzeneği, protokol dahilinde kritik adımlar ile ilgili diğer detayları, modifikasyonlar ve sorun giderme ve teknik sınırlamalar diskin sağlanırussion. Deneyler başlamadan önce tartışma okuyunuz. Her aşamada% 90 başarı oranı beklemek protokolleri boyunca (örneğin, kültürlerin en az% 90, herhangi bir aşamada büyümesi olmalıdır). Deneyde bir aşamasının başarı oranı% 90 altına düşerse numuneler atılır ve deney yapıların tam toplanması için tekrarlanır. Bu, test edilen protein son derece bağımlı olacaktır Ancak, bu başarı oranı, çözülebilir proteinler veya% 100 verimle bölen konstruktların oranını ifade yapıların sayısı için geçerli değildir. Robot tezgahının set-up için özel ayrıntıları alternatif Worktable set-up için gerekli olan ancak onlar adapte edilebilir, (ayrıca bakınız Şekil 4) her protokol için sağlanmıştır. Robot donanım (Tecan) 96-kanallı koluna (MCA96), robotik manipülatör (RoMa) ve 8-kanal, sıvı taşıma başının (oluşurLIHA). MCA96 kullanan tüm adımlar da LIHA adımları arasında yıkanacak gerekir, çünkü ancak daha uzun sürer, bir MCA96 mevcut değilse LIHA kullanılarak yapılabilir. Robot teknik olarak steril bir ortam olmasa da, antibiyotik dahil genel olarak kirlenme ya da kısırlık ile ilgili sorunlar yok olmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 sıvı taşıma robotu</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td>Protokoller, plakalar için bir vakum manifoldu olan herhangi bir sıvı işleme robotuna uyarlanabilir. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8</td></tr><tr><td>96 oyuklu PCR (PCR96) plakaları</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652270</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td></tr> <tr><td>LB ortamı</td><td></td><td></td><td>Sterilite için otoklavlanmış.</td></tr><tr><td>Antibiyotik stokları</td><td></td><td></td><td>Kanamisin (50 mg / ml), ampisilin (100 mg / ml), kloramfenikol (etanol içinde 34 mg / ml), stok stokları & eksi; 20 &d; C. 1: 1,000 seyreltme kullanın.</td></tr><tr><td>2,42 ml hacim kapasiteli derin kuyu 96 (DW96) plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780270</td><td>Sterilite için otoklavlanmıştır. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td></tr> <tr><td>Ekspresyon vektörleri</td><td></td><td></td><td>Hedef yapıların ifadesi için. & eksi adresinde saklayın; 20 derece >C.</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS yetkin hücreler</td><td></td><td></td><td>Veya alternatif E. coli kullanıcının seçtiği ekspresyon suşu. & eksi adresinde saklayın; 80 derece >C.</td></tr><tr><td>Breathseal nefes alabilen yapışkan film</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676050</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka bloklu</td><td></td><td></td> PCR makinesi <td>SDS-PAGE/Kaliper numunelerinin dönüşümü, ısı şoku ve kaynatılması için.</td></tr><tr><td>24 oyuklu steril doku kültürü plakaları</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662165</td><td>http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td></tr> <tr><td>LB-agar</td><td></td><td></td><td>Sterilite için otoklavlanmıştır.</td></tr><tr><td>200 &mu; l steril tek kullanımlık uçlar</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 617</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Multitron çalkalama inkübatör, 3 mm mesafeli</td><td>Infors</td><td>AJ103</td><td>Gerekli değildir, normal bir çalkalama inkübatörü de kullanılabilir. http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td></tr> <tr><td>plakalı inkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotitre plakası</td><td></td><td></td><td>Saflaştırma protokolü B kullanılarak gliserol stokları ve elüsyon için.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td></td><td></td><td>Gliserol stoklarının hazırlanması için.</td></tr><tr><td>200 &mu; l tek kullanımlık uçlar</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 038 616</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Yapışkan bant pedleri&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td></tr><tr><td>Bactinyl</td><td>Orapi Grubu</td><td></td><td>Veya eşdeğeri mikrobiyal dezenfektan.</td></tr><tr><td>ZYP-5052 orta</td><td></td><td></td><td>Bileşenlerin tarifleri için <güçlü>Tablo 1</güçlü> bölümüne bakın.</td></tr><tr><td>Derin kuyu 24 (DW24) plaka, 10 ml kapasite</td><td>Whatman</td><td>7701-5102</td><td>Sterilite için otoklavlanmıştır. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td></tr><tr><td>Düz tabanlı, şeffaf mikrotitre plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Absorbans okumaları için. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td></tr> <tr><td>Plaka okuma spektrofotometresi</td><td></td><td></td><td>Opsiyonel. Kültürlerin OD < alt > 600 < / alt > ölçmek için.</td></tr><tr><td>Derin kuyu plakaları için rotorlu santrifüj&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.800 x g için uygundur.</td></tr><tr><td>Lizozim</td><td></td><td></td><td>50 mg / ml suda. & eksi adresinde saklayın; 20 derece >C.</td></tr><tr><td>İmidazol ACS sınıfı</td><td>Merck</td><td>IX0005-1</td><td>Protein verimini hesaplamak için A280 okumalarına müdahale etmeyecek şekilde yüksek kaliteli bir imidazol sınıfı kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>Lizis tamponu</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8, 0.25 mg / ml lizozim (veya tercih ettiğiniz tampon) içerir. Her seferinde stoklardan lizozim ekleyin ve uzun süre saklamayın.</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaka sonikatörü (Ultrasonik işlemci XL, derin kuyu plakaları için uyarlanmış)</td><td>Misonix Inc.</td><td></td><td>Gerekli değil. Tek başına lizozim normalde neredeyse tam lizis için yeterlidir.</td></tr><tr><td>DNaz&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2 mg / ml su stoku, filtre sterilize edilmiştir. Alikotları & eksi olarak saklayın; 20 derece >C.</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4)</td><td></td><td></td><td>2 M su stoğu, otoklavlanmış.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE veya Kaliper numune tamponu&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bağlayıcı tampon</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol pH 8 (veya tercih ettiğiniz tampon). 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8 (veya tercih ettiğiniz tampon). 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Elüsyon tamponu</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8 (veya tercih ettiğiniz tampon). 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>96 kuyulu Alıcı/Filtre Plakası 20 & mikro; m, 1.8 ml kapasiteli</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740686.4</td><td>http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td></tr><tr><td>200 &mu; l tek kullanımlık geniş delikli uçlar</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30 050 348</td><td>http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2</td></tr><tr><td>Ni Sefaroz 6 Hızlı Akışlı reçine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td>Hedef füzyon proteinlerinin saflaştırılması için. Kullanmadan önce yıkayın ve dengeleyin. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td></tr><tr><td>Tütün Aşındırma Virüsü (TEV) proteazı</td><td></td><td></td><td>İsteğe bağlı, bölünme için. 2 mg / ml, depolama tamponunda indirgeyici maddeler olmadan. & eksi adresinde saklayın; 80 derece >C.</td></tr><tr><td>96 kuyulu 0.22 & mikro; m filtre plakası</td><td>Millipore</td><td>MSGV N22 10</td><td>İsteğe bağlı. Bölünmeden sonra çözünür fraksiyonu filtrelemek için. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td></tr><tr><td>SDS-PAGE/nokta leke ekipmanı veya Kaliper Labchip GXII ekipmanı</td><td></td><td></td><td>Elektroforez cihazı ve jel tipi seçimi kullanıcıya aittir. 'nin takdirine bağlı olarak.</td></tr><tr><td>Spektrofotometre ve küvetler</td><td></td><td></td><td>Çözünür proteinlerin verimini hesaplamak için 280 nm'de (A280) absorbansı ölçmek için kullanılır. Analiz Kaliper üzerinde yapılırsa gerekli değildir.</td></tr><tr><td>ZipTip pipet uçları</td><td>Kırlangıç</td><td></td><td>İsteğe bağlı. ZipTip türü kullanıcının takdirine bağlıdır. Daha büyük proteinler için C4 reçinesi kullanılmalıdır, peptitler için ise C18 daha iyi olabilir. Daha fazla kalite kontrolünden önce numuneleri temizlemek için numunelerin tuzdan arındırılması için alternatif yöntemler de kullanılabilir. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td></tr><tr><td colspan="4">Malzemeler, Protokol bölümünde gerektiği sıraya göre listelenmiştir. Reaktifler, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında saklanabilir. Yazar için referans numaraları' Tercih edilen malzeme seçimi sağlanır, ancak eşdeğer ürünler de uygun olabilir. Markanın deneyin sonucunu etkilemeyeceği reaktifler için şirket detayları atlanmıştır.</td></tr></tbody></table>

Üretilen rekombinant disülfid zengin venom proteinler uygulanan yüksek randımanlı sayısal anlatım tarama ve arıtma<em&gt; e. coli</em

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli), yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için rekombinant proteinlerin üretimi için en yaygın olarak kullanılan sentezleme sistemidir. Birçok protein çözünmeyen bir biçimde ifade edilmiştir Bununla birlikte, bazen proteinlerin saflaştırılması zordur. Zor veya çoklu hedefleri ile çalışırken bu nedenle hızla çözünür ifade için şartları tanımlamak üzere yüksek verim (SDP), küçük bir ölçekte protein ekspresyon tarama (1-4 ml kültür) kullanılması tavsiye edilir. Laboratuar çeşitli yapısal genomik programları, (rekombinant proteinin 0.1-100 mg / L kültür aralığında) nicel ve HTP protein ifadesi tarama protokolü proteinlerin binlerce uygulanan ve geçerliliği ile başa çıkmak için. Protokoller bir sıvı taşıma robot kullanımı ile otomatik ama aynı zamanda özel ekipman olmadan manuel olarak yapılabilir. Disülfit zengin zehir proteinler kazanıyorterapötik ilaç potansiyel olarak onların potansiyeli için bilinirliğinin artması. Bunlar son derece güçlü ve seçici olabilir, ancak bunların karmaşık disülfid bağı ağların üretilmesi için, zor hale. 7.ÇP, Avrupa Venomics projesi (bir üyesi olarak <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), bizim meydan fonksiyonel karakterizasyonu için yeni venom proteinlerinin binlerce üretmek amacı ile başarılı üretim stratejileri geliştirmektir. Disülfid bağı izomeraz DsbC redoks özellikleri yardımıyla, biz E okside, fonksiyonel zehir peptitlerin sentezlenmesi için HTP üretim boru hattı uyarlanmış coli sitoplazma. Protokolleri de çeşitli disülfid açısından zengin proteinlerin üretimi için de geçerlidir. Burada bizim boru hayvansal zehir proteinlerin üretiminde uygulanan göstermektedir. Protokolleri ile, burada tarif edilen bu çözünür disülfid zengin proteinler bir hafta gibi kısa bir sürede elde edilebilir olasıdır. Hatta küçük ölçekli, inci kullanmak için potansiyel vare pilot çalışmalarda, veya hassas mikro deneyleri için karakterizasyon için, kütle spektrometresi ile oksidasyon durumunu doğrulamak için proteinler saflaştırılmıştır.

Örnek sonuçlar VENOMICS boru hattından 96 disülfid açısından zengin proteinlerin ifadesi taranması için, Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. Proteinler kalıntılarının sayısını artırmak disülfid bağların artan sayıda düzenlenir. Peptitler, bir His-tag ve DsbC füzyon ortağı ile sitoplazma içerisinde ifade edilmiştir. Tavsiye edilen kültür koşulları kullanırken, 12 bir OD 600 normal olarak elde edilir. Peptidler, nikel afinite reçinesi 50 ul nihai hacim ile protokol 8.2-B kullanılarak saflaştırılmıştır, bu ~ 25 mg / L füzyon proteininin maksimum Bu deneyde tespit edilebilir. Şekil 6A, kaliper LabChip sistemi (ayrılmasından önce, füzyon gösteriliyor) ve füzyon proteinin mg / L kültür elde etmek için ekstrapolasyon dayalı skorlama sistemi (0,1-2 mg / L kültür seviyelerinde, 2 den elektroforez sonuçlarını gösterir 10 mg / L kültür, 10-25 mg / L kültür no<html> t algılandı.) beklendiği gibi yarılan DsbC etiketi normalde yerine 27 kDa&#39;dan, yaklaşık 32 kDa&#39;da çalıştığını unutmayın. Benzer şekilde, DsbC füzyonları da beklenenden daha yüksek bir yaklaşık 5 kDa çalıştırın. Hedeflerin bir sürü için biz sağlam füzyon (üst bant) görmek değil sadece, aynı zamanda füzyon partneri yalnız (alt bant). Bu hedeflerin bazıları için kültür koşulları optimize tek başına DsbC nihai verimle bir artış sağlayan kıyasla bozulmamış füzyon (üst band) oranını artırabilir. Skorlama sadece sağlam füzyon seviyesine dayanmaktadır. Sadece 16 96 dışında proteinler füzyon düzeyde tespit edilememiştir. Bu% 83 genel başarı düzeyine karşılık gelmektedir. Algılanabilir 80 proteinleri arasında, bunlardan 45 2 mg / L kültür (% 56) daha yüksek düzeylerde tespit edildi. (Bu örnekte protokol 8.2 B ~ 25 mg / L füzyon proteininin en fazla tespit edilebilir kullanılarak olsa da) hedef ve füzyon bağlı olarak, protein verimleri 2-100 mg / L kültür aralığında genellikle. t &quot;&gt; mevcut disülfür bağlarının sayısı (Şekil 6B gösterilen) tarafından başarı analizi düşük başarı düzeyi 6 disülfit içeren hedefler için% 66 olmak üzere, (1 ve 7 arasında) test disülfit bağlarının tüm numaralar için makul bir başarı gösterir bağlar. izoelektrik noktası ve artıklarının sayısı (Şekil 6C&#39;de gösterilmektedir) göre ifade başarı dağılımının bir analizi her iki başarılı bir şekilde eksprese hedefleri ve arsa dağılmış saptanmamış hedefleri, teknik için belirli bir sapma gösterir. Şekil 6D DTT ile örnek indirgenmesi önce ve sonra, tek bir hedef için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi (ESI-MS) için elde edilen kütle spektrometresi sonuçları bir örneğini göstermektedir. Normal olarak, böyle bir kapsamlı kütle spektrometrisi analizi, ancak tam bir demonstratio amaçları için, (düşük bir örnek analiz edilmesi gerekir değil) gerçekleştirilmesi gerekir olmazn biz sonuçlar hem göstermiştir. Gösterilen hedef 4, disülfür bağları ile bir 5.7 kDa disülfid zengin zehir proteindir. Soldaki spektrumu bundan başka müdahalesi olmadan bölünmesi ve tuz giderme sonra olduğu gibi, önce DTT ile indirgeme için protein için sonuçları göstermektedir. Sağ taraftaki spektrumu herhangi bir fazla DTT çıkarmak için tuzunun giderilmesi, ardından DTT ile indirgemeden sonra proteini göstermektedir. Deney kitlelere karşılık gelen iyonların her biri iyonu için spektrum ve belirlenmesi ile ilgili oklarla işaretlenmiştir yeşil gösterilir. Bu iyonlar için hesaplanan deneysel ebeveyn kütlelerin (proteinin için ön indirgeme (= DTT) ve indirgeme (+ DTT) sonra) tabloda gösterilmiştir. Kitleler 8 Da&#39;lık bir kütle farkı gösterirler (önce indirgenmesi ve indirgenmiş numune için 5717,6 Da örnek için 5709,6 Da). 2 Da&#39;lık bir kütle farkı, 1 oksitlenmiş disülfid bağının varlığında karşılık gelen (beklendiği gibi), bu nedenle 8 Da&#39;lık bir kütle farkı 4 disülfid bağların varlığına işaret olarakindirgenmemiş örneği. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Açıklanan yarı otomatik ekipman ile yüksek verimlilik ifade tarama protokolü Şekil 1.. Şematik., Bu protokolü kullanarak, 96-384 koşulları manuel yöntemlerle bir hafta içinde tek bir kişi tarafından test edilebilir, ya da en fazla 1.152 koşullar. İfade plazmidleri çok sayıda hedef bir seferde alt klonlanabilir, böylece rekombinant klonlama teknolojisi kullanılarak inşa edilmektedir. Bir kez çözünür ifade koşullar belirlenmiş ve gerçekleştirilen bölünme, istenirse, protein oksidasyonunu ve saflık, microassays ve / veya büyük ölçekli üretim kontrol etmek için kalite kontrol devam edebilirsiniz. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 2,. Genel rekombinasyonel klonlanması için şematik ve tasarım oluştururlar. Hedef giriş klonlardan, çoklu ekspresyon vektörleri, bir yüksek verimli bir şekilde (bir hafta kadar 6 x 96 giriş klon) ve tek bir deneyde alt klonlanabilir. Ifade edilen protein, nikel afinite saflaştırılması için bir HIS etiketi kodlar. DsbC (sitoplazmik ifade için periplazmik sinyal dizisini içermeyen) füzyon partneri, çözünürlük ve / veya yardım katlama ve hedef proteinin doğru oksidasyonunu artırmak için kullanılır. Etiket bölünme isteniyorsa hedef kodlama dizisi, bir N-terminal TEV proteaz sitesi (ENLYFQ) içermesi gerektiğini not edin. Sol üst ek PCR ya da gen sentezi ile elde edilebilir bir verici vektör ve hedef sekansları kullanılarak giriş klonlarının üretimi gösterilmektedir. Entry klonlar da ticari giriş klon koleksiyonlarından elde edilebilir. Birden rekombinasyonel klonlama sistemleri mevcuttur, ancak biz Geçidi syste kullanmakm, şemada gösterildiği gibi. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Birden çok disülfid zengin hedefler için Şekil 3,. Yüksek verimli tarama hattı. Hedefleri ilk BL21 (DE3) pLysS E. sitoplazmasında HIS-DsbC füzyonları olarak ifade edilmiştir oto-indüksiyon ortamı (ZYP-5052) kullanılarak 37/17 ° C coli. Saflaştırma HTP elektroforezi (veya nokta lekeleme / SDS-PAGE ile birlikte) ile çözünür konstruktların saptanması, ardından nikel reçinesi üzerinde gerçekleştirilir. Ifade tarama ilk turda başarısız olursa, alternatif kültür koşulları çalışılmıştır. Yapılar, yeterince yüksek verim, microassays ve kalite kontrol çözünür proteinlerin üretilmesi durumunda gerçekleştirilebilir ve gerekirse, büyük ölçekli üretim takip edilebilir. Çözünür verimleri yeterince yüksek değildir hedefler için, ifade tarama alternatif stra ile devam edebilirsinizins ve sonra sıcaklıklar diğer füzyon ortakları ve periplasmik ifade. İsteğe bağlı adım noktalı kutularla gösterilir. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> HTP platformu için Şekil 4.. Robot Worktable kurulum. Alternatif işyerleri de kullanılabilir olmasına rağmen bizim sıvı taşıma robot tezgahının düzeni gösterilir, mevcut eşdeğer siteler bulunmaktadır sağladı. Kur (8-kanal, sıvı taşıma kafası (LIHA)), 4 pozisyonları ile iki mikrotablaya taşıyıcıların her (MP4, 1-4 ve 5-8 pozisyonları), 2 pozisyonlu bir vakum istasyonu için bir yıkama istasyonu (WS) oluşur Bir taşıyıcı (Te-Çalkalayıcılar 14-15 ve 16-17 pozisyonları) 2 pozisyon iki plaka karıştırıcısı her 3 pozisyonlu bir mikrotablaya taşıyıcı (MP3, 11-13 pozisyonları), (Te-elektrikli süpürgeler, 9 ve 10 pozisyonları) ve 3 pozisyonları ile tek ipuçları (DITI, 18-20 pozisyonları). Ek olarak,Yeniden iki otel derin kuyu plakaları için olan taşıyıcılar ve (gösterilmemiş olan) için, bir mikro bulunmaktadır. Sıvı taşıma robot yüklü donanım tek kullanımlık uçları, etrafında tabaklar / ekipman hareket sabit ipuçları ile 8-kanal, sıvı taşıma kafası (LIHA) ve bir robot manipülatör (RoMa) ile kullanmak için bir 96-kanallı kol (MCA96) olduğunu çalışma tezgahı. Kutup numaralandırılması protokol boyunca adlandırılır. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Dört adet 24 oyuklu plakalar tek bir 96-yuvalı plaka aktarmak için şematik. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6.. Temsilcisi sonuçları 96 disülfür zengin zehir pro ifadesi ekran için gösterilirproteinlerden. Proteinler sitoplazmada HIS-DsbC füzyonları olarak ifade edilir ve nikel reçinesi 50 ul (Protokol 8.2-B) kullanılarak saflaştırılmıştır. A) ifade tarama sonucu, sanal jel gösteren ve ifade verimi için puanlama. Sanal jel kontrast çok soluk veya yoğun bantları telafi etmek için şerit-to-şeritli ayarlandı. Bazı hedefler için iki bant üst bant disülfid bağların sayısı ile karşılaştırıldığında). B, tek başına füzyon etiketine karşılık gelen bozulmamış füzyon proteini ve alt bant için her ekspresyon seviyesinde ifade edilen proteinlerin oranı karşılık gelen görülebilir unutmayın protein. Her gruptaki proteinlerin gerçek sayısı grafik. ° C) üzerine yerleştirilmiştir, izoelektrik noktası (pl) ve kalıntıların sayısına göre ekspresyon düzeylerinin dağılımı. D), bir 5.7 kDa disülfid zengin zehir için kütle spektrometresi sonuçları örnek 4, disülfür bağları ile protein. Üzerinde spektrumSol taraftaki önce DTT ile indirgeme ve sağ taraftaki spektrumuna protein DTT ile indirgendi ve daha sonra tuzu giderilir protein sini göstermektedir. Deney kitlelere gelen iyonları oklarla işaretlenmiştir ve atamaları yeşil gösterilmiştir. Indirgemeden önce ve sonraki indirgeme tabloda gösterilen ve indirgeme maddesi ilave edilmeden önce okside protein varlığında tekabül eden, 8 Da&#39;lık bir kütle farkı sergileyen olan proteini için deneysel kütleleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Yemek tarifi </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g tripton 5 g maya hülasası 925 ml su </td><td> Mix ve daha sonra sterilize etmek için otoklav. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 mi 49.3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml su </td><td> Çözülene kadar karıştırın sonra sterilize etmek için otoklav. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g gliserol 730 ml su 25 g glukoz 100 g α-laktoz </td><td> , Sırayla Ekle eriyene kadar ısı boyunca karıştırıldı daha sonra sterilize etmek için otoklav. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml su 66 g (NH4) 2 SO4 136 g KH 2 PO 4 142 g Na 2 HPO 4 </td><td> Sırayla ekleyin ve bütün çözülmüştür sterilize etmek için otoklav kadar karıştırın. </td></tr></tbody></table> ZYP-5052 ortam bileşenleri için Tablo 1 &#39;. Tarif.

Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, otomatik bir sıvı işleme robotu kullanarak e coli'de çözünür proteinlerin seviyesini ölçmek için yüksek verimli bir ifade tarama protokolü kullanmaktır. Bu, ilk aşılama ile gerçekleştirilir.96. Ertesi gün hedef füzyon proteinlerini kodlayan plazmitlerle dönüştürülmüş hücrelere sahip kuyu ön kültürleri, otomatik indüksiyon ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu plaka, ekspresyon oluşturmak için gece boyunca ön kültürlerle aşılanır.Hasattan sonra kültürler ve ekspresyon kültürlerinden çözünebilir proteinler dondurulduktan sonra immobilize metal afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Sonuç olarak, protein üretimi ve başarılı hedeflerin oluşturulması için en uygun ekspresyon koşullarını belirlemek için her bir bozulmamış hedef füzyon için çözünürlük seviyeleri ölçülebilir. Bu tekniğin geleneksel artan verimlilik yöntemlerinin avantajlarından, partiden partiye radyasyonun sınırlı olması ve veri işleme ve izlemenin basitliği Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.Otomatikleştirilmiş adımlar, metnin prosedürün hızını veya basitliğini iletmediği için göz korkutucu ve tek başına metin biçiminde anlaşılması zor görünebilir. Bakterilerin dönüşümünden sonra, ilk 24 kuyulu LB agar plakasının kapağını bir kenara koymak için robotik tutucuyu kullanarak başlayın. Daha sonra, 96 kuyulu bir dönüşüm plakasından 50 mikrolitre dönüşüm karışımını karıştırmak ve ardından aspire etmek için sekiz kanallı sıvı işleme kolunu kullanın.Sıvı işleme kolunun ilk dört kanalındaki dönüşüm karışımını LB agar plakasının ilk sütununa ve son dört kanaldaki dönüşümleri LB agar plakasının ikinci sütununa dağıtın. Dağıtımdan sonra tüm uçları iyice yıkayın ve ardından dönüşüm karışımını 96 oyuklu plakadan LB agar plakasının sonraki dört sütunundaki tüm kuyucuklara aktarmaya devam edin. O tabak bitti. İlk plakaya aktarım tamamlandıktan sonra, kapağı değiştirin ve bir sonraki plaka için aktarıma başlayın. Tüm dönüşümler kaplandıktan sonra, dönüşüm karışımının homojen bir dağılımını oluşturmak için tüm plakaları 1200 RPM'de bir dakika çalkalayın.Daha sonra karıştırdıktan sonra, 96 oyuklu plakadan kalan dönüşüm karışımının 60 mikrolitresini aspire etmek için 96 çok kanallı kolu kullanın ve karışımı LB suyu içeren derin bir kuyu 96 plakasına dağıtın. Kültür havalandırmasının havalandırılmasına izin vermek için derin kuyu 96 ön kültürü nefes alabilen yapışkan filmle kapatın ve ardından plakayı gece boyunca maksimum hızda 37 santigrat derece çalkalama inkübatörüne yerleştirin. Ön kültürler inkübatöre girdikten sonra, LB agar plakalarını kapakları kapalı olarak yaklaşık 10 dakika boyunca bir başlık içinde sürün.Daha sonra plakaları gece boyunca 37 santigrat derecelik bir plaka inkübatörde ters çevirin. Ertesi gün, gece boyunca 100 mikrolitre ön kültürü derin bir kuyu 96 plakasına aspire etmek için sıvı işleme kolunu kullanın ve ekspresyon kültürlerini daha önce olduğu gibi aynı şemayı kullanarak, sıvı işleme kolunu yıkama istasyonunda iyice yıkayın. Aşılama bittiğinde, ekspresyon kültürlerini dört saat boyunca nefes alabilen yapıştırıcı ile kapatılmış 37 derece Santigrat derece çalkalama inkübatöre yerleştirin.Ardından, gece boyunca inkübasyon için sıcaklığı 17 santigrat dereceye düşürün. Ertesi sabah, derin kuyu 24 plakasını 3000 Gs'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı bir antimikrobiyal ajan içeren bir atık kabına atın ve ardından kültürlerin doğru şekilde büyüdüğünü doğrulamak için herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için plakaları emici kağıda baş aşağı vurun. Derin kuyuda pelet olup olmadığını kontrol edin.Daha sonra 125 mikrolitre lizis tamponunu aspire edin ve tamponu derin kuyunun her bir kuyucuğuna iki kez, her bir oyuğa dört uçlu 24 plaka dağıtın. Peletleri yeniden süspanse etmek için bir mililitre lizis tamponunun son hacmine ulaşmak için, plakaları beş dakika boyunca 1200 RPM'de çalkalayın. Robotta, hücre süspansiyonlarını derin bir kuyu 96 plakasının uygun kuyularına geri aktarın ve plakaları en az bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede kapalı olarak saklayın.Bu gösteri için, hedef füzyon proteinlerinin saflaştırılması için 50 mikrolitre nikel boncuklu protokolü kullanacağız. İlk olarak, derin kuyu 96 plakasını bir su banyosunda yaklaşık 15 dakika çözdürün. Daha sonra resus, hücre lizatlarını çalkalama inkübatöründe maksimum hızda 10 dakika daha askıya alır, kültürler viskoz hale gelmelidir.Daha sonra, DNA'ları ve magnezyum sülfatı dağıtmak için manuel sekiz kanallı bir pipet kullanın Derin kuyu 96 plakasının her bir oyuğuna, sırasıyla mililitre ve 20 milimolar başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar karıştırın. Plakayı 15 dakika daha kapalı olarak çalkalayın, bu sırada kültür viskoz olmamalıdır. Saflaştırma sırasında filtre plakasının tıkanmasını önlemek için, lizatların hiçbirinin artık viskoz olmadığını dikkatlice görsel olarak kontrol etmek çok önemlidir.Sıvı taşıma robotunda, 200 mikrolitre bulamacın lizat içeren derin kuyu 96 plakasına aktarılmadan önce reçine bulamacını iyice karıştırmak için 200 mikrolitre geniş delikli uçlar kullanın. Bağlanmayı sağlamak için derin kuyu 96 plakasını 1400 RPM'de ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayın ve ardından 1200 mikrolitre reçine lizat bulamacının tamamını 200 mikrolitrelik alikotlarda karıştırmak için geniş delikli uçları kullanın ve ardından filtre plakasına aktarın. Şimdi, lizatı plakadan süzmek ve akışı derin bir kuyuda toplamak için vakumu yaklaşık 30 saniye açın.Derin kuyunun altında 96 akış içeren 96 filtre plakasının altından çıkarılır ve deneyin sonuna kadar bir rafta saklanır. Daha sonra reçineyi ikinci yıkamadan sonra her seferinde 800 mikrolitre bağlayıcı tampon ile iki kez yıkayın, 50 milimolar I midaz yıkamasını toplamak için filtre plakasının altına taze, derin, kuyulu 96 bir plaka yerleştirmek için robotik tutucuyu kullanın. Filtre plakasına 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tampon 96 içeren derin kuyudan geçene kadar vakumu tekrar uygulayın.Yıkama, filtre plakasının altından çıkarılır ve deneyin sonuna kadar bir rafta saklanır. Daha sonra, bağlayıcı tampon yıkamaları için gösterildiği gibi 800 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez daha yıkadıktan sonra, mikroplakayı çalışma masasına aktarmak için robotik tutucuyu kullandı ve elucian'ı toplamak için SPE bloğunu ve filtre plakasını mikroplakanın üzerine geri koydu. Daha sonra filtre plakasındaki reçineye 190 mikrolitre Elucian tamponu ekleyin.Üç dakika sonra, tüm tamponun geçmesine izin vermek için vakumu bir dakika uygulayın. Hızlıca, Ellucian ciltlerinin doğru olup olmadığını görsel olarak kontrol edin. Son olarak, çözünür ekspresyon seviyesinin ölçülmesi için Ellucian yıkama ve akış numunelerinin plakalarından geçmesini engelleyin.Önce ellucian plakasını analiz edin ve sadece gerektiğinde, ilgili yıkamayı ve fraksiyonlardan akışı kontrol edin. Bu veriler, kaliper laboratuvar çip sisteminden elde edilen bir elektroforez sonucunu göstermektedir. Sağlam bölünmüş füzyon proteinleri, üst bantlar tarafından temsil edilir ve bölünmüş protein fragmanları alt bantlar olarak temsil edilir.Her bir hedef protein için füzyon verimlerinin, litre kültür seviyeleri başına 0.1 ila iki, iki ila 10 ve 10 ila 25 mikrogram aralığında olduğu belirlendi veya bazı durumlarda tespit edilmedi. Protein ekspresyonunun başarısının, her bir füzyon proteini fragmanı içinde bulunan diss sülfür bağlarının sayısı ile değerlendirilmesi, test edilen tüm disülfür bağlarının sayısı için makul bir başarı gösterir ve en düşük başarı seviyesi, altı disülfid bağı içeren hedefler için %66'dır. İzoelektrik noktaya ve kalıntı sayısına dayalı olarak ifade başarısının dağılımının analizi, hem başarılı bir şekilde ifade edilen hedefler hem de çizim boyunca dağılmış olarak tespit edilmeyen hedefler ile teknik için özel bir yanlılık göstermez.Füzyonlar tespit edildikten ve parçalandıktan sonra, saflaştırılmış hedefler elektrosprey iyonizasyonu, kütle spektrometresi ile kalite kontrolüne tabi tutulur. Burada gösterilen temsili hedef, dört disülfid bağına sahip 5.7 kilodalton dis sülfür açısından zengin bir zehir proteinidir. Bu spektrum, daha fazla müdahale olmaksızın bölünme ve tuzdan arındırma işleminden sonra olduğu gibi, DTT ile indirgemeden önce proteinin sonuçlarını gösterir.Bu spektrum, DTT ile indirgendikten sonra proteini ve ardından fazla DTT'yi çıkarmak için tuzdan arındırmayı gösterir. Oklar, deney kütlelerine karşılık gelen iyonları gösterir ve her iyonun tanımı yeşil renkle gösterilir. Bu iyonlar için hesaplanan deneysel ana kütleler tabloda gösterilmiştir ve dört oksitlenmiş kalıp sülfür bağına eşdeğer sekiz Daltonluk bir kütle farkına karşılık gelir.Kurulduğunda, tam protokol bir hafta içinde binden fazla kültürde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek verimli yöntemler kullanarak çözünür protein üretimi için gerekli başarılı koşulları belirlemek için küçük ölçekli e coli kültürlerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Bu el yazması mikrobiyal yetiştirme ortamının terzi tasarımı için genel bir yaklaşımı açıklar. Bu güvenilirlik ve sıvı ortam işleme hızı artırmak için laboratuvar robot tarafından desteklenen yeterli ekimi verimi için deneysel tasarım ve microbioreactor teknoloji Kriging tabanlı birleştiren yinelemeli bir iş akışı tarafından etkin hazırlık.

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Bu protokol, hücre dışı membrana bağlı veziküller içinde paketlenmiş, tipik olarak çözünmeyen veya disülfür bağı içeren proteinler de dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin bakteriyel üretimi için ayrıntılı bir yöntem açıklamaktadır. Bu, uygulamalı biyoteknoloji ve tıp da dahil olmak üzere çok yönlü bilimsel araştırma alanlarına uygulanma potansiyeline sahiptir.

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Bu protokol, rekombinant insan SLFN14 ribonükleazının üretimini ve kütle fotometrisiyle stoikiyometrik analizini tanımlar.<br...

Rekombinant İnsan SLFN14 ribonükleazının hızlı üretimi ve kütle fotometrisi ile stoikiyometrik analiz

Öğrenin, E. coli kullanarak disülfid açısından zengin hayvan zehir proteinlerinin yüksek verimli ifade taraması ve arıtma yöntemini. Otomatik sıvı işleme robotu ile çözünür protein seviyelerini nicelendirin.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma

Daha fazla video keşfet