Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Bu memeli protein ekspresyon tekniğinin genel amacı, yapısal, biyofiziksel ve fonksiyonel çalışmalar için uygun olan, doğal katlanmış proteinleri miligram miktarlarda üretmektir. Bu tekniğin temel avantajı, salgılanan memeli proteinlerini elde etmek ve yapısal çalışmalar için gerekli olan saflıkta bir konsantrasyon sağlamak için hızlı ve basit bir protokol olmasıdır. Genel olarak, protein verimiyle ilgili çoğu sorunun hücre sağlığı ve canlılığından kaynaklandığını görmekteyiz.

Hücre canlılığını ve aynı zamanda besiyeri şeker seviyelerini yakından izleyerek, hem protein verimini önemli ölçüde artırabilir hem de hücrelerin kullanışlılık süresini uzatabilirsiniz. Hücre yoğunluğunu izlemek de oldukça önemlidir. Transfeksiyondan önceki herhangi bir zamanda hücrelerin mililitre başına 2 milyon hücreyi aşması durumunda, protein veriminin büyük ölçüde azaldığını gözlemlemekteyiz. 2 93 F hücrelerinin büyük ölçekli kültürünü gerçekleştirmek için, bir litre 2 93 F besiyerini 10 mililitre 100 x glutamin ve beş mililitre 100 x pen strep ile destekleyin.

Antibiyotik, serumsuz koşullarda yeterli güçtedir ve azaltılmış antibiyotik konsantrasyonu, transfeksiyon sırasında hücre canlılığını artırarak kültürdeki protein verimini iyileştirir. Transfeksiyondan bir gün önce, 2 93 F hücrelerini 300 ml medyada, havalandırmalı kapaklı bir litrelik polikarbonat bölmeli erlenmeyer flasklarda, standart bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de %8 karbondioksit altında çalkalayarak büyütün. Transfeksiyon gününde hücreleri 0,5 milyon hücre/ml yoğunluğuna seyreltin. Kültür medyumunu, 2 93 F medyumunda %2 ağırlık/hacim oranındaki cell boost'un %10 hacmindeki miktarını ekleyerek destekleyin.

Protein glikozilasyonunu kontrol etmek için bu adımda kafu ekleyin. DNA ve transfeksiyon reaktanı çözeltilerini serumsuz medyada hazırlayıp beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, transfeksiyon reaktanını, karıştırarak birer mililitre artışlarla DNA çözeltisine ekleyin.

Reaktif DNA komplekslerinin oluşması için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazikçe inkübe edin. Ardından çözeltiyi hücrelerin üzerine damla damla ekleyin; glikoproteini saflaştırmak için transfekte edilen hücrelerin 72 ila 96 saat boyunca protein eksprese etmesine izin verin. Öncelikle kültürü bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri çöktürmek için 1300 Gs'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve gerekirse, süpernatantı berraklaştırmak için ikinci kez santrifüjleyin ve/veya 0.22 mikron filtre kullanın.

Ardından, %10 hacminde 10 x nikel nitro yükleme, tri asetik asit veya nikel NTA bağlama tamponu ekleyin. Daha sonra, bir kolona iki mililitre nikel NTA süspansiyonu ekleyerek ve dört santigrat derecede çalışan 1 x bağlama tamponunun 10 kolon hacmi ile dengeleyerek dört santigrat derecede bir yerçekimi kolonu hazırlayın. Süpernatantı reçine üzerinden akıtın ve geçiş sıvısını toplayın.

Süpernatan akışı boşaldıktan sonra, kolonu 10 kolon hacmi yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından, proteini beş kolon hacmi elüsyon tamponu ile elüe edin. Final hacmi 0,5 ml olacak şekilde deglikozilasyon gerekiyorsa, bir santrifüj konsantratörü kullanarak EIT'yi 0,43 ml'ye konsantre edin; herhangi bir kalıntıyı 16.000 xg ve 4 °C'de santrifüjle çöktürün.

Ardından 50 µL 500 mM sodyum sitrat, pH 5.5 ve 20 µL endo HF ekleyin. Endo HF'yi uzaklaştırmak için karışımı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin; ardından amiloz reçinesini fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın. Proteini, yıkanmış reçine ile birlikte 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, reçineyi çöktürmek için 1000 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın. Proteini uygun bir moleküler ağırlık kesim sınırı olan santrifüj filtresi kullanarak konsantre edin ve belirtilen saklama tamponuna tampon değişimi yapın. İşte nikel afinite kromatografisi sonrası, cine uygulanmış hücrelerde eksprese edilen salgılanmış bir protein için temsili SDS-PAGE sonuçları.

İlk şerit deglikozilasyon öncesindeki proteini, ikinci şerit ise endo hf ile deglikozilasyon sonrası proteini göstermektedir. Glikozillenmiş protein yaklaşık 10 kilodalton daha yüksekte yer alırken, tek aşamalı saflaştırma işleminin ardından deglikozilasyon sonrası beklenen moleküler ağırlıkla uyumlu tek bir banda düşmektedir. Kristal taramaları, asılı damla yöntemi kullanılarak kurulmuştur.

Üstteki görüntü ilk kristal hitini ve alttaki görüntü optimize edilmiş kristalleştirme koşullarını göstermektedir. Bu durum, ilgilenilen proteinin biyokimyasal homojenliğinin kristalleştirme başarısı için belirleyici bir faktör olabileceğini ve optimize edilmiş bir memeli ekspresyon sisteminin bu kristalleştirmeye uygun proteinler ürettiğini kanıtlamaktadır. Nikelle saflaştırılmış proteinin ileri saflaştırması, boyut dışlama kromatografisi ile kolayca gerçekleştirilir.

Bu, protein üretimini değerlendirmek ve düzgün katlanmış proteinler elde etmek için koşulları optimize etmek adına da faydalı bir adımdır. İlgilenilen protein, kromatografik elüsyondaki ana tür olmalı ve elüsyon hacmi proteinin moleküler ağırlığı ile uyumlu olmalıdır. Daha erken EEU zamanları, proteinin agregasyonuna veya yanlış katlanmasına işaret edebilir. Uzmanlaşıldığında.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında dört günde tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, hücre kültürü için steril koşulların korunması önemlidir. Proteinin oligomerizasyon durumunu ve termal stabilitesini değerlendirmek için boyut dışlama kromatografisi, çok açılı ışık saçılımı ve diferansiyel tarama florometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.