Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Bu memeli protein ekspresyon tekniğinin genel amacı, yapısal, biyofiziksel ve fonksiyonel çalışmalar için uygun, doğal olarak katlanmış proteinlerin miligram miktarlarını üretmektir. Bu tekniğin temel avantajı, salgılanan memeli proteinlerinin elde edilmesi için hızlı ve basit bir protokol olması ve yapısal çalışmalar için gerekli saflıkta bir konsantrasyon olmasıdır. Genel olarak, protein verimi ile ilgili sorunların çoğunun hücre sağlığı ve canlılığından kaynaklandığını görüyoruz.

Hücre canlılığını yakından izleyerek ve ayrıca ortam şeker seviyelerini izleyerek, hem protein verimini büyük ölçüde artırır hem de hücrelerin kullanışlılığını uzatırsınız. Hücre yoğunluğunu izlemek de çok önemlidir. Transfeksiyondan önce herhangi bir zamanda hücreler mililitre başına 2 milyon hücreyi aşarsa, protein veriminin büyük ölçüde azaldığını bulduk 2 93 F hücrenin büyük ölçekli kültürünü gerçekleştirmek için, bir litre 2 93 F ortamını 10 mililitre 100 x glutamin ve beş mililitre 100 x kalem strep ile destekleyin.

Antibiyotik, serumsuz koşullarda yeterli güçtedir ve azaltılmış antibiyotik konsantrasyonu, transfeksiyon sırasında hücre canlılığını artırır, bu da protein verim kültürünü iyileştirir. Bir litrede 300 mililitre ortamdaki 2 93 F hücresi, polikarbonat şaşkın erlenmeyer şişeleri, transfeksiyondan bir gün önce standart bir doku kültürü inkübatöründe çalkalanırken %8 karbondioksit ile 37 santigrat derecede havalandırmalı kapaklara sahip şişeler, hücreleri transfeksiyon gününde mililitre yoğunluk başına 0.5 milyon hücreye seyreltir. 2 93 F ortamda hacim hücre takviyesi başına %10 hacim %2 ağırlık ekleyerek kültür ortamını destekleyin.

Protein glikozilasyonunu kontrol etmek için bu adımda görülen kafu ekleyin. DNA ve transfeksiyon reaktif çözeltilerini serum içermeyen ortamda hazırlayın, beş dakika inkübe edin. Daha sonra, transfeksiyon reaktifini bir mililitrelik artışlarla karıştırarak DNA çözeltisine ekleyin.

Reaktif DNA komplekslerinin oluşması için oda sıcaklığında 30 dakika nazikçe inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi hücrelerin üzerine ekleyin Damla damla bir şekilde, transfekte edilmiş hücrelerin glikoproteini saflaştırmak için 72 ila 96 saat boyunca proteini eksprese etmesine izin verin. İlk önce kültürü 1300'de 20 dakika boyunca bir santrifüj şişesi santrifüjüne boşaltın, Gs.To hücreleri peletleyin, süpernatı toplayın ve gerekirse ikinci kez döndürün ve veya süpernatanı netleştirmek için 0.22 mikron filtre kullanın.

Ardından, %10 hacimce 10 x nikel nitro yükü, tri asetik asit veya nikel NTA bağlama tamponu ekleyin. Daha sonra, bir kolona iki mililitre nikel NTA bulamacı ekleyerek ve dört santigrat derecede çalışan bir x bağlayıcı tamponun 10 kolon hacmi ile dengeleyerek dört santigrat derecede bir yerçekimi sütunu hazırlayın. Süpernatanı reçinenin üzerinden akıtın ve akışı toplayın.

Süpernatan akışını kolon üzerine döktükten sonra, 10 kolon hacmi yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra proteini beş sütun hacminde elüsyon tamponunda elüte edin. 0,5 mililitrelik bir nihai hacim için deglikosilasyon gerekiyorsa, 16.000 GS ve dört santigrat derecede santrifüjleme yoluyla herhangi bir kalıntıyı bir santrifüjleme yoğunlaştırıcısı kullanarak EIT'yi 0,43 mililitreye konsantre edin.

Daha sonra 50 mikrolitre 500 milimolar sodyum sitrat, pH 5.5 ve 20 mikrolitre endo hf ekleyin. Endo HF'yi çıkarmak için karışımı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin, önce amiloz reçinesini fosfat tamponlu salin içinde üç kez yıkayın. Proteini yıkanmış reçine ile dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, reçineyi peletlemek ve süpernatanı toplamak için 1000 Gs'de beş dakika döndürün. Proteini, uygun bir moleküler ağırlık kesmesi, santrifüj filtresi ve gösterilen depolama tamponuna tampon değişimi kullanarak konsantre edin. İşte nikel afinite kromatografisini takiben sine ile muamele edilmiş hücrelerde eksprese edilen salgılanan bir protein için temsili SDS sayfası sonuçları.

İlk şerit, deglikosilasyondan önceki proteindir ve ikinci şerit, endo hf ile deglikosilasyondan sonraki proteindir. Glikosile edilmiş protein yaklaşık 10 kilodalton daha yükseğe çıkar ve daha sonra tek saflaştırma adımını takiben deglikosilasyonu takiben tahmin edilen moleküler ağırlıkla tutarlı olarak tek bir banda çöker. Kristal ekranlar asılı damla yöntemi kullanılarak kuruldu.

Üstteki resim ilk kristal vuruşunu gösterir ve alttaki resim optimize edilmiş kristalleşme koşullarını gösterir. Bu, ilgilenilen proteinin biyokimyasal homojenliğinin kristalleşme başarısı için belirleyici bir faktör olabileceğini ve optimize edilmiş bir memeli ekspresyon sisteminin bu kristalleşme için uygun proteinler ürettiğini göstermektedir. Nikel saflaştırılmış proteinin daha fazla saflaştırılması, boyut dışlama kromatografisi ile kolayca yapılır.

Bu aynı zamanda protein üretimini değerlendirmek ve uygun şekilde katlanmış proteinler elde etmek için koşulları optimize etmek için yararlı bir adımdır. İlgilenilen protein, kromatografik elüsyondaki ana tür olmalı ve elüsyon hacmi, proteinin moleküler ağırlığına karşılık gelmelidir. Önceki. EEU zamanları, bir kez ustalaştıktan sonra proteinin toplanmasını veya yanlış katlanmasını önerebilir.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde dört gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, bu prosedürü takiben hücre kültürü için steril koşulların korunması önemlidir. Proteinin olizasyon durumunu ve termal stabilitesini değerlendirmek için boyut, dışlama kromatografisi, çok açılı ışık saçılımı ve diferansiyel tarama, florometri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.