Name: Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Öğrenin, 293F hücreleri kullanarak memeli glikoproteinlerinin hızlı ve verimli ekspresyon yöntemini. Hücre sağlığını izleyerek yüksek verimli protein üretimi ve kristalizasyon için yapısal çalışmalara uygun saflaştırma tekniklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R01-HL119813 (TJB'ye), Amerikan Akciğer Derneği RG-196051 (TJB'ye), CIMED Pilot ve Fizibilite hibesi (TJB'ye), Amerikan Kalp Derneği Doktora Öncesi Bursları 14PRE19970008 (Z.Y.'ye) ve 15PRE22110004 (DLK'ye) tarafından desteklenmiştir.

Büyük ölçekli geçici Transfeksiyonu için Plazmid DNA Miligram metrajlarının 1. Üretim <ol><li> Kısıtlama alanı klonlama ya da diğer uygun teknik kullanılarak yüksek bir kopya sayısı memeli ifade vektörüne ilgili proteini klonlama. <ol><li> En iyi sonuçlar için, sahip pHLsec 7 vektörü, kullanmak yerleşik C-terminal 6His-etiketi, güçlü bir promotör Kozak dizisi ve optimize salgılama sinyali. </li></ol></li><li> Yetkili hücreleri üzerine plazmid Transform. <ol><li> Plazmid DNA 1 ug üzerine E. coli hücreleri 20 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 42 ° C&#39;de ısı şoku hücreler 35 sn için, daha sonra 2 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın. </li><li> Mikrobiyal büyüme ortamı (SOC) 300 ul ilave edin ve 220 rpm&#39;de çalkalanarak, 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Uygun antibiyotik seçimi ile agar plaka üzerinde plaka hücreleri. <ol><li> Plazmid pHLsec vektörü ise 100 ug / ml karbenisilin kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> Luria Broth (LB) Medya 250 ml kültür koloni 220 rpm&#39;de çalkalanarak, 37 ° C&#39;de 100 ug / ml bir antibiyotik (karbenisilin) ​​O / N ile takviye edilmiştir. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak yüksek hızlı Plazmid Maxi Seti kullanılarak DNA kültürden saflaştınlır. <ol><li> Bunun yerine tamponu TE tampon EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) &#39;de DNA Zehir. </li><li> -20 ° C de transfeksiyon ve mağaza için gerekli miktarda saflaştırılmış plazmid alikotu. </li></ol></li></ol> 293F Hücreler 2. Büyük ölçekli kültür ve geçici transfeksiyonu <ol><li> 10 glutamin ml ve 5 ml Pen / Strep (her ikisi de 100x) ile Ek 1 L 293F ortam. 4 ° C&#39;de saklayın. 5 ml Pen / Strep protein verimi artırır, serum içermeyen koşullar ve düşük antibiyotik konsantrasyonu transfeksiyon sırasında hücre canlılığını artırır yeterli bir güçtür. </li><li> 1 L polikarbonat 300 mi ortam içinde kültür 293F hücreleri delikli kapaklı Erlenmeyer flasks bölmeli% 8 CO2 ile 37 ° C &#39;de s, standart bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde çalkalandı. </li><li> Hücreleri 5 x 10 5 / ml yoğunlukta Transfeksiyondan bir gün önce sulandırmak. </li><li> 293F ortam içinde hücre artışı ağırlık / hacim% 2,% 10 hacim ekleyerek transfeksiyon, ek Kültür aracı maddesi, günde. <ol><li> 500 mg / dL glukoz konsantrasyonu elde etmek için gerektiği gibi üreticinin talimatlarına ve kullanım takviyeleri göre glikoz monitörü kullanarak glikoz konsantrasyonu ölçün. </li></ol></li><li> Protein glikosilasyonu kontrol etmek için bu aşamada kifunensine (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ilave edilir. </li><li> DNA hesaplayın hacmi 1 x 10 6 hücre başına 1 ug plazmid için gereklidir. Steril koşullar altında, 5 ml serum barındırmayan ortam içinde DNA seyreltin. </li><li> Transfeksiyon reaktifi ul 2 için 1 ug plasmid için gereken transfeksiyon reaktifi hacmini hesaplar. Steril koşullar altında, 5 ml serum barındırmayan ortam içinde transfeksiyon reaktifi (PEI-TMC-25) seyreltin. </li><li> Eklemek1 ml artışlarla, DNA çözeltisi içine transfeksiyon reaktifi karıştırmanın. Oluşturulması için reaktif DNA kompleksleri, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra damla damla bir tarzda hücreler üzerine çözeltisi ilave edilir. </li><li> Transfekte hücreler 72-96 saat boyunca protein ifade etmek için izin verin. ~ 10% hacim Cell Boost günlük Media, ya da gerekli olan Supplement glikoz 400-600 mg / dl okumaya devam. </li></ol> 3. Arıtma <ol><li> Pelet hücreleri ve süpernatan toplamak için 1300 x g&#39;de 20 dakika süre ile, bir santrifüj şişesi içine santrifüj kültürünün süzün. Gerekirse, ikinci bir kez spin ve / veya yüzer netleştirmek için 0.22 mikron filtre kullanın. </li><li> % 10 hacim 10x Ni-NTA bağlayıcı tampon ekleme (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0.1 M Tris, pH 8.5, 50 mM imidazol). </li><li> Bir kolon içinde Ni-NTA bulamacın 2 ml ilave edilmesi ve 1 x bağlanma tamponu 10 kolon hacminde (CV) ile dengeye bir yerçekimi sütunu hazırlayın. Mümkünse, 4 ° C odasındaki tüm sütun adımları. Alternatively, soğuk protein ve sütun safhasından önce buz üzerinde tüm tamponlar ve protein tutmak ve toplanan akış buz üzerinde. Not: Ni-NTA bulamaç hacmi ile% 50 reçine ve üreticinin belirttiği bağlama kapasitesi 50 mg / ml&#39;dir. Ni-NTA boncuklar çoklu kullanım için yeniden şarj edilebilir </li><li> Reçine üzerinde süpernatant akış ve flow-through toplamak. Bu adımı yineleyin. </li><li> Yıkama tamponu, 10 CV ile yıkayın (300 mM NaCI, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazol, pH 8). </li><li> Elüsyon tampon çözeltiden 5 CV protein Zehir (300 mM NaCI, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazol, pH 8). </li><li> Eğer deglikosilasyon gereklidir: <ol><li> 0,5 ml&#39;lik bir son hacim için, bir santrifüjleme konsantratör kullanılarak 0,43 ml elüat konsantre edilir. Çökeltiler için, 16.000 x g ve 4 ° C ısıda santrifüj ile pislikleri pelet. </li><li> 500 mM Na-sitrat pH 5.5, 50 ul ekle. </li><li> EndoHf (1 x 10 6 U / ml) 20 ul ekle. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Değile: Enzim konsantre proteini toplamak için neden olabilir, 37 ° C &#39;de en iyi şekilde çalışır. SDS-PAGE veya immunoblotting tarafından değerlendirilen deglikosilasyon, eksik ise, RT inkübasyon uzatın. Enzim 4 ° C&#39;de aktivitesi bulunmamaktadır. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da nihai depolama tamponu içinde yıkayın Amiloz Reçine 3 kez: EndoHf kaldırın. 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca reçineyle protein inkübe edin. Boncuk pelet ve süpernatant toplamak için 1000 xg&#39;de 5 dakika Spin. </li><li> Uygun molekül ağırlıklı akış kesici santrifüj filtresi kullanılarak protein konsantre edin ve depolama tamponu (150 mM NaCI ve 20 mM HEPES pH 7.5) içine tampon değişimine. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

HEK 293F hücreleri post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren proteinlerin üretimini sağlam sunuyoruz. Bu sistem disülfıdlere, glikosilasyon, aksi takdirde daha rutin ifade araçlarını kullanarak yokluğunda olacağını fosforilasyon içeren özgün katlanmış proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir bir ifade verir. Buna ek olarak, bu sistem, sadece birden fazla plazmidin birlikte transfeksiyonu ile ekspresyonu ve çoklu protein kompleksleri saflaştırılması için de kullanılabilir. TREM2 Bunun yanı sıra, bu sistem yoğun bir labor...

Atomik düzeyde protein yapısını anlamak biyolojik yollar ve hastalıkların moleküler temelini açığa çıkarmak için bir anahtardır. X-ışını protein kristalografisi makromoleküler yapıları belirlemek için en yaygın olarak kullanılan / uygulanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin en önemli sorun uygun bir şekilde katlanmış, saf protein yeterli miktarda elde edilmesidir. Bu durum, özellikle, belirli post-translasyonel modifikasyonlar maruz salgılanan memeli proteinlerinin birlikte çalışan bir sorun haline gelir. Bakteriyel-ifade proteinler Protein Bilgi Bankası 1 yatırılır kristalize proteinlerin başlıca kaynağıdır. Bunların pahalı olmayan, hızlı ve tipik olarak proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi için bakteriyel ekspresyon sistemleri büyük ölçüde tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bakteriler içinde ifade edilen memeli proteinlerinin hücre dışı alanları genellikle düzgün fo homojen elde edilmesi için, bu durumda katlama ve kapsamlı saflaştırma adımları gereklidir katlanmış edilmezlded proteini. Ayrıca, birçok memeli proteinleri düzgün katlanmasına 2 elde etmek için post-translasyonel glikozilasyon gerektirir. Maya ya da böcek hücrelerinde ekspresyonu ve glikosilasyon katlama sorunun üstesinden de, glikosilasyon içeren post-translasyonel modifikasyonlar, yanlış ya da homojen olmayan modifikasyonlara sahip proteinlerin, sonuçta memeli hücreleri 3 kişilerce önemli ölçüde farklıdır. Memeli hücreleri, uygun post-translasyonel modifikasyonları ve katlama sağlamak için gereken tüm moleküler yapıların ifade ederler; Bununla birlikte, bu ifade sistemleri tipik olarak, sınırlı miktarlarda ve reaktifler ve sarf maliyetlerinin yüksek, en çok laboratuarlar tarafından tercih edilmemektedir. Polietilenimin (PEI), standart transfeksiyon reaktifi nispeten ucuz ama önemli bir sitotoksisite ve düşük transfeksiyon verimi, hücre ortamı, DNA artan maliyeti ile sonuçlanır ve ekipman kültürlenmesi getirir. PEI Birçok alternatifler pahalıya bulunmaktadır. Biz elegeliştirilmiş hücre kültürü bir araç kombinasyonu tanımlama ve kimyasal olarak tek aşamalı saflaştırma ile salgılanan bir memeli proteinlerinin ifadesi için hızlı ve nispeten pahalı olmayan yöntemi için değiştirilmiş PEI, bu sorunlar. Bu sağlam bir yöntem, fonksiyonel ve biyokimyasal çalışmalar 4 için yeterli verim sağlar ve bazı durumlarda, daha fazla arıtılmadan kristalleştirme için uygun bir protein ile sonuçlanır. Bu protokol ekspresyonunu maksimize etmek ve süspansiyon içinde yetiştirilmiş insan embriyonik böbrek (HEK) &#39;de salgılanmış proteinleri memeli hücreleri için 293F elde etmek için çeşitli teknikler tarif eder. Transfeksiyon verimliliği (ve maliyet), protein üretimi ve saflaştırılması tüm büyük ölçüde bu protokolü takip ederek geliştirilmiştir. Tek basamaklı halka açma reaksiyonu yoluyla karbamatlar eklenmesiyle tadil PEI (PEI-TMC-25, ref 5 ayrıntılı olarak tarif edilen sentez ve özellikleri) büyük ölçüde, transfeksiyon verimi iyileştirir katyonik gelen sitotoksisitesini azaltırbuna göre membran bozulması ve deney maliyetlerini azaltır. Bundan başka, hücre canlılığı ve protein ifadesi büyük ölçüde glukoz ve vitamin temin etmek için kültür takviyelerinin eklenmesiyle geliştirilmektedir. Önemli kifunensine ile glikosile proteinlerin, tedavi üretimi için, Manosidaz I&#39;in bir toksik olmayan kimyasal inhibitörü yerine tek bir N-asetilglukosamin proteinleri üretmek üzere endoglikosidaz EndoHf çıkarılabilir tanımlanan, olgunlaşmamış glikanlar ile proteinler üretir Tam uzunlukta bir glikanın 6 N-bağlantılı. Son olarak, serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış ortam içine proteinleri salgılanmaktadır yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için, hızlı ve kolay saflaştırılmasını sağlar. Tek aşamalı nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) reçinesi saflaştırma, bazı durumlarda, kristalizasyon için yeterli saflıkta bir proteini elde edilebilir, üstte kalan sıvı türlerin kirletici ve çoğunu çıkarır.

<table><tbody><tr><td>Kültür Şişeleri</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Yaşam Teknolojileri</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td>Glutamin</td></tr><tr><td>Hype 5 transfeksiyon reaktifi</td> yerine kullanım <td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293fektin transfeksiyon reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>PEI transfeksiyon reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz Reçine</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Hücre Kültürü Takviyesi</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Biyomühendislik</td><td>DG2032</td><td>Glikoz İzleme Sistemi</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>519850.91</td><td>Serumsuz Ortam DNA transfeksiyonu için</td></tr><tr><td>Luria Suyu (LB Media)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Yetkili Hücreler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

verimli memeli hücre ekspresyon ve kristalizasyon için hücre dışı glikoproteinlerin tek aşamalı saflaştırma

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Yapısal ve biyofiziksel çalışmalar için salgılanan memeli proteinlerinin üretimi zorlu, zaman alıcı ve maliyetli olabilir. Burada, memeli hücrelerinde salgılanan protein ekspresyonu için zaman ve maliyet açısından verimli bir protokol ve nikel afinite kromatografisi kullanılarak bir adımlı saflaştırma açıklanmaktadır. Sistem, ekspresyon virüsleri geliştirme veya kararlı eksprese edici hücre hatları oluşturma gibi adımları ortadan kaldırdığı için protein üretme süresini büyük ölçüde azaltan, süspansiyon halinde memeli hücrelerinin büyük ölçekli geçici transfeksiyonuna dayanmaktadır. Bu protokol, basit kimyasal modifikasyonla kolayca yapılabilen ucuz transfeksiyon ajanları veya artan transfeksiyon verimliliği ve azalmış sitotoksisite yoluyla verimi artıran orta fiyatlı transfeksiyon ajanları kullanır. Ortam glikoz seviyelerinin dikkatli bir şekilde izlenmesi ve sürdürülmesi protein verimini artırır. Ekspresyon adımında doğal glikanların olgunlaşmasının kontrol edilmesi, X-ışını kristalografisini sürdürmek için ideal özellikler olan uygun şekilde katlanmış ve fonksiyonel memeli proteinlerinin nihai verimini arttırır. Bazı durumlarda, tek aşamalı saflaştırma, kristalizasyon için yeterli saflıkta protein üretir, bu da burada örnek bir durum olarak gösterilmiştir.

Burada miyeloid hücreler 2 (hTREM2, kalıntılar 19-132) ifade insan proteini tetikleme reseptöründen salgılanan 13 kDa immünoglobin (Ig) etki uygulandığında, bu sentezleme sisteminin sonuçlar izler. TREM2 iki disülfid bağları ve iki tane N-bağlantılı glikosilasyon sitesi olan tek bir hücre dışı Ig alanı içeren bir tip I transmembran proteindir. Birçok Ig proteinleri 8 farklı olarak, TREM2 bakteriyel inklüzyon cisimcikleri 9&#39;dan yeniden katlama için uygun değildi. Daha sonraki mutagenez teyit N b...

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Bu memeli protein ekspresyon tekniğinin genel amacı, yapısal, biyofiziksel ve fonksiyonel çalışmalar için uygun olan, doğal katlanmış proteinleri miligram miktarlarda üretmektir. Bu tekniğin temel avantajı, salgılanan memeli proteinlerini elde etmek ve yapısal çalışmalar için gerekli olan saflıkta bir konsantrasyon sağlamak için hızlı ve basit bir protokol olmasıdır. Genel olarak, protein verimiyle ilgili çoğu sorunun hücre sağlığı ve canlılığından kaynaklandığını görmekteyiz.Hücre canlılığını ve aynı zamanda besiyeri şeker seviyelerini yakından izleyerek, hem protein verimini önemli ölçüde artırabilir hem de hücrelerin kullanışlılık süresini uzatabilirsiniz. Hücre yoğunluğunu izlemek de oldukça önemlidir. Transfeksiyondan önceki herhangi bir zamanda hücrelerin mililitre başına 2 milyon hücreyi aşması durumunda, protein veriminin büyük ölçüde azaldığını gözlemlemekteyiz. 2 93 F hücrelerinin büyük ölçekli kültürünü gerçekleştirmek için, bir litre 2 93 F besiyerini 10 mililitre 100 x glutamin ve beş mililitre 100 x pen strep ile destekleyin.Antibiyotik, serumsuz koşullarda yeterli güçtedir ve azaltılmış antibiyotik konsantrasyonu, transfeksiyon sırasında hücre canlılığını artırarak kültürdeki protein verimini iyileştirir. Transfeksiyondan bir gün önce, 2 93 F hücrelerini 300 ml medyada, havalandırmalı kapaklı bir litrelik polikarbonat bölmeli erlenmeyer flasklarda, standart bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de %8 karbondioksit altında çalkalayarak büyütün. Transfeksiyon gününde hücreleri 0,5 milyon hücre/ml yoğunluğuna seyreltin. Kültür medyumunu, 2 93 F medyumunda %2 ağırlık/hacim oranındaki cell boost'un %10 hacmindeki miktarını ekleyerek destekleyin.Protein glikozilasyonunu kontrol etmek için bu adımda kafu ekleyin. DNA ve transfeksiyon reaktanı çözeltilerini serumsuz medyada hazırlayıp beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, transfeksiyon reaktanını, karıştırarak birer mililitre artışlarla DNA çözeltisine ekleyin.Reaktif DNA komplekslerinin oluşması için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazikçe inkübe edin. Ardından çözeltiyi hücrelerin üzerine damla damla ekleyin; glikoproteini saflaştırmak için transfekte edilen hücrelerin 72 ila 96 saat boyunca protein eksprese etmesine izin verin. Öncelikle kültürü bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri çöktürmek için 1300 Gs'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve gerekirse, süpernatantı berraklaştırmak için ikinci kez santrifüjleyin ve/veya 0.22 mikron filtre kullanın.Ardından, %10 hacminde 10 x nikel nitro yükleme, tri asetik asit veya nikel NTA bağlama tamponu ekleyin. Daha sonra, bir kolona iki mililitre nikel NTA süspansiyonu ekleyerek ve dört santigrat derecede çalışan 1 x bağlama tamponunun 10 kolon hacmi ile dengeleyerek dört santigrat derecede bir yerçekimi kolonu hazırlayın. Süpernatantı reçine üzerinden akıtın ve geçiş sıvısını toplayın.Süpernatan akışı boşaldıktan sonra, kolonu 10 kolon hacmi yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından, proteini beş kolon hacmi elüsyon tamponu ile elüe edin. Final hacmi 0,5 ml olacak şekilde deglikozilasyon gerekiyorsa, bir santrifüj konsantratörü kullanarak EIT'yi 0,43 ml'ye konsantre edin; herhangi bir kalıntıyı 16.000 xg ve 4 °C'de santrifüjle çöktürün.Ardından 50 µL 500 mM sodyum sitrat, pH 5.5 ve 20 µL endo HF ekleyin. Endo HF'yi uzaklaştırmak için karışımı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin; ardından amiloz reçinesini fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın. Proteini, yıkanmış reçine ile birlikte 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, reçineyi çöktürmek için 1000 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın. Proteini uygun bir moleküler ağırlık kesim sınırı olan santrifüj filtresi kullanarak konsantre edin ve belirtilen saklama tamponuna tampon değişimi yapın. İşte nikel afinite kromatografisi sonrası, cine uygulanmış hücrelerde eksprese edilen salgılanmış bir protein için temsili SDS-PAGE sonuçları.İlk şerit deglikozilasyon öncesindeki proteini, ikinci şerit ise endo hf ile deglikozilasyon sonrası proteini göstermektedir. Glikozillenmiş protein yaklaşık 10 kilodalton daha yüksekte yer alırken, tek aşamalı saflaştırma işleminin ardından deglikozilasyon sonrası beklenen moleküler ağırlıkla uyumlu tek bir banda düşmektedir. Kristal taramaları, asılı damla yöntemi kullanılarak kurulmuştur.Üstteki görüntü ilk kristal hitini ve alttaki görüntü optimize edilmiş kristalleştirme koşullarını göstermektedir. Bu durum, ilgilenilen proteinin biyokimyasal homojenliğinin kristalleştirme başarısı için belirleyici bir faktör olabileceğini ve optimize edilmiş bir memeli ekspresyon sisteminin bu kristalleştirmeye uygun proteinler ürettiğini kanıtlamaktadır. Nikelle saflaştırılmış proteinin ileri saflaştırması, boyut dışlama kromatografisi ile kolayca gerçekleştirilir.Bu, protein üretimini değerlendirmek ve düzgün katlanmış proteinler elde etmek için koşulları optimize etmek adına da faydalı bir adımdır. İlgilenilen protein, kromatografik elüsyondaki ana tür olmalı ve elüsyon hacmi proteinin moleküler ağırlığı ile uyumlu olmalıdır. Daha erken EEU zamanları, proteinin agregasyonuna veya yanlış katlanmasına işaret edebilir. Uzmanlaşıldığında.Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında dört günde tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, hücre kültürü için steril koşulların korunması önemlidir. Proteinin oligomerizasyon durumunu ve termal stabilitesini değerlendirmek için boyut dışlama kromatografisi, çok açılı ışık saçılımı ve diferansiyel tarama florometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

efficient-mammalian-cell-expression-single-step-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Burada, yüksek verimde saf, tamamen glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif proteaz üreten HEK293T hücreleri kullanan uygun maliyetli bir granzim ekspresyon sistemini açıklıyoruz.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Öğrenin, 293F hücreleri kullanarak memeli glikoproteinlerinin hızlı ve verimli ekspresyon yöntemini. Hücre sağlığını izleyerek yüksek verimli protein üretimi ve kristalizasyon için yapısal çalışmalara uygun saflaştırma tekniklerini keşfedin.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Daha fazla video keşfet