Test Görsel Fonksiyonu için Basit Bir Davranış Testi

Bu prosedürün genel amacı, hayvanın test tankının siyahla kaplı olan yarısında geçirdiği süreyi kaydederek iribaşların görsel fonksiyonlarını test etmektir. Bu işlem, öncelikle iribaşların 45 ila 50. evrelere kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise davranış analizi için yarısı siyah, yarısı beyaz bir tankın ve bir kameranın kurulmasıdır.

Ardından, içinde bir iribaş bulunan ikinci bir tankı dış tankın içine yerleştirin. Her bir iribaş için, çevresindeki arka plan değiştirilirken görme güdümlü davranışı kaydedin. Son adım, iribaşlara retinal eksodomi uygulamak ve ardından davranış analizini tekrarlamaktır.

Nihayetinde, bu basit ve düşük maliyetli deneyden elde edilen veriler, fototopik görme testleri altında iribaşların tankın bir tarafında yüzmeyi diğerine tercih ettiğini göstermek için kullanılır. Bu yöntemi, optik kinetik yanıt veya kuyruk çevirme deneyi gibi diğer tekniklere tercih etmenin temel avantajı; çoğu laboratuvarda kolayca bulunabilen ekipmanların kullanıldığı, ucuz ve basit bir yöntem olmasıdır. İribaşları hazırlamak için öncelikle döllenmiş Xenopus embriyoları temin edin; ardından mark's, modifiye ringers veya 10 kat seyreltilmiş MMR çözeltisini, 50 µg/mL konsantrasyonda olacak şekilde 60 mm'lik Petri kaplarına koyun.

Blastula aşamasından nöral plak aşamasına kadar olan embriyoları Gentamisin antibiyotiğine yerleştirin. Petri kaplarında, 18 °C'de 2 ile 15. aşamalar arasında tutun. Embriyolar yaklaşık 27 ila 30. aşamalar civarında yeni bir kap aşamasına ulaştığında, bağırsak bakteriyel büyümesine izin vermek için onları antibiyotiksiz 0.1 XMMR'ye aktarın.

İribaşlar yaklaşık 45. evre civarında beslenme aşamasına geldiğinde, onları 0.1 XMMR içeren 100 milimetrelik Petri kaplarına taşıyın. Ertesi gün, onlara ısırgan otu tozu süpernatantı ile besleme yapın. 100 milimetrelik Petri kabında bir hafta geçirdikten sonra, yarım galonluk bir tankı kurbağa suyu ile doldurun.

Hayvanları tanka taşıyın ve ısırgan otu tozu süpernatant besleme programına devam edin, ancak suyu haftada sadece iki veya üç kez değiştirin. Hayvanlar yarım galonluk tanklarda olduğunda, ışıkların sabah saat 06:00'da açıldığı 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık döngüsünde tutun. Testten önce, deneklerin bulunduğu yarım galonluk tankı, testten en az 12 saat önce gece boyunca beyaz bir yüzey üzerine yerleştirin. Davranış analizi, standart floresan aydınlatmalı, sessiz ve trafiğin az olduğu bir alanda gerçekleştirilmelidir.

İç tank olarak kullanılacak tankın dış köşelerine iki adet iç içe geçen yarım galonluk test tankı hazırlayın. Bir Sharpie kalemi kullanarak, tabandan beş santimetre yüksekliğe su hattını işaretleyin. Ayrıca, iç tankın iç kısmındaki tüm çöküntüleri belirleyin.

Irbaşlarının içlerinde oyalanmasını önlemek için buraları inert bir bileşik ile doldurun. Şimdi dikkatinizi ikinci dış tanka verin. Bir sonraki adım için siyah elektrik bandı ve beyaz peçete temin edin.

Şurada gösterildiği gibi, tankın bir yarısının dış kısmını bantla, diğer yarısının dış kısmını ise pelür kağıdıyla kapatın. Tanklar hazırlandıktan sonra, bir inokülasyon döner tablası kurun ve iç içe geçmiş tankları üzerine yerleştirin. Kameranın tankların iç kısmını yukarıdan görüntüleyebilmesi için bir tripod ve web kamerası konumlandırın.

Web kamerasını, video yakalama ve oynatma yazılımı yüklü bir bilgisayara bağlayın. Kamerayı açın ve yeni bir film kaydı yapmaya hazırlanın. Ardından, kameranın ve tankların üzerine hafif pamuklu bir kumaş örtün.

İribaşlar için dışsal uyaranları azaltmak amacıyla, bir lüminansmetre kullanın ve örtü altındaki lüminansın metrekare başına 35 ila 50 mum arasında olduğunu kontrol edin. İç test tankını çıkararak davranış analizini başlatın. Tankı beş santimetre işaretine kadar kurbağa suyu ile doldurun.

Bir hayvanı, yarım galonluk kabından bilgisayarın yanındaki iç test tankına aktarmak için bir ağ kullanın. Kayıtların tutulması amacıyla kayıt yazılımının açık olduğundan ve test alanını kaydettiğinden emin olun. Hayvanın adını, tarihi ve saati bir kağıda yazın.

Kayıt için bunu kameranın altına yerleştirin. Bu işlem tamamlandıktan sonra, iki dakikaya bir zamanlayıcı ayarlayın. Ardından, dış tankı, siyah tarafı sağda kalacak şekilde döner tabla üzerinde konumlandırın.

Şimdi test tankını dış tankın içine yerleştirin. Kayıt alanındaki perdeyi kapatın ve dış tankın yönelimini doğrulamak için bilgisayar ekranını kullanın. Videonun kaydedildiğinden emin olun ve zamanlayıcıyı başlatın.

Zamanlayıcı öttüğünde, örtüyü konumunda tutun ve iç test tankını çıkarın. Ardından, siyah taraf sola gelecek şekilde dış tankı 180 derece döndürün. Test tankını dış tanka geri yerleştirin ve iki dakikalık zamanlayıcıyı başlatın.

İç tankı tekrar çıkarın. Dış tankı 180 derece döndürün ve toplam 10 kez olmak üzere her iki dakikada bir iç tankı yerleştirin. İşlem tamamlandığında video kaydını durdurun.

İribaşıyı yarım galonluk tankına geri koyun. Retinol eksonomisini gerçekleştirmek için bir mikroskop hazırlayın. 60 milimetrelik bir Petri kabını 0.1 XMMR içinde eritilmiş %1 agar ile doldurun ve katılaşmaya bırakın.

Aros'tan iribaş boyutunda küçük dikdörtgen bir parça kesin. Devam etmeye hazır olduğunuzda, deney hayvanını alın ve %0,02 Trica içerisine yerleştirin. Hayvan, üç numara pens ile kuyruk sıkıştırmasına tepki vermediğinde işleme devam edin.

Ardından hayvanı kaba aktarın. Petri kabını mikroskopa yerleştirerek işleme devam edin. Hayvanı bir taraftan forseps ile sabitlemeye hazır olun.

Karşı tarafta, gözün dorsal bölgesinin arkasındaki deriyi 45 derecelik bir açıyla delmek için 25 gauge iğne kullanın, beş numara pensle delikten içeriye dikkatlice girin ve yanındaki vene dikkat ederek optik siniri kesin. Siniri kenara çekin ve cerrahi işlem sonrası pensi geri çekin. Hayvanı, 0.7 XMMR ve 50 µg/mL içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirerek iyileşmeye bırakın.

20 dakika boyunca Gentamycin uygulayın. Ardından, iribaşı kurbağa suyu içeren bir toparlanma tankına aktarın. Tankı, test hazırlığı için beyaz bir yüzeye yerleştirin.

Hayvanın gece boyunca dinlenmesini sağlayın. Ertesi sabah, görsel fonksiyonu test etmek için davranışsal analizi uygulayın. Bu video, deney için temsili verileri göstermektedir.

Solda cerrahi işlem öncesindeki hayvanlar, sağda ise her iki gözden gelen retinal aksonlar kesildikten sonraki aynı hayvanlar yer almaktadır. Bu durum, alt köşelerdeki şematik çizimlerle belirtilmiştir. Hayvanları siyah taraftan uzaklaştıracak veya beyaz tarafa çekecek herhangi bir madde eklenmediğini göstermek için su hareketlendirilmiştir.

Ameliyat öncesi iribaşlar arka plan rengine 30 saniyeden kısa sürede tepki verirken, kör iribaşlar tankın etrafında amaçsızca yüzerler. Bu grafik, üç farklı koşul altındaki tek bir hayvanın beyaz ve siyah bölgelerde geçirdiği sürenin yüzdesini göstermektedir. İlk olarak, hayvan herhangi bir cerrahi işlemden önce analiz yöntemi kullanılarak gözlemlenmiştir.

Sağ optik sinir kesildikten sonraki iki ardışık günde, davranış iki günlük test süresince gözlemlendi. Son olarak, her iki optik sinir de kesildikten sonra, analizle iki günlük daha gözlem yapıldı. En az bir optik sinir sağlam olduğunda, hayvan tankın beyaz tarafında daha fazla gün geçirdi.

Bu videoyu izledikten sonra, çoğu kurbağa laboratuvarında bulunan basit reaktifler ve ekipmanlar kullanarak iribaşların görme yeteneğinin nasıl test edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Deneylerinizde başarılar dileriz.