İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması
8 Ağustos 2014
Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, timik epitel hücrelerini veya teknolojisini izole etmek, tanımlamak ve saflaştırmaktır. Bu, teknolojiyi tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için önce enzimatik olarak, timusun sindirilmesi ve mekanik olarak parçalanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, teknoloji akış sitometrisi ile analiz edilebilir veya bir kaydırma stratejisi ile zenginleştirilebilir.
Sonuç olarak, timik epitel alt kümeleri floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile saflaştırılabilir. Bu yöntem, T hücresi gelişimi alanındaki birçok önemli soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, timik epitel hücreleri timik seçimi nasıl teşvik eder? Yaşlanan hayvanlarda timik disfonksiyona ne sebep olur ve in vitro olarak T hücresi sulandırmasını nasıl sağlayabiliriz?
Bu tekniğin temel avantajları, değişken emmik germa hücrelerinin yüksek oranda geri kazanılması, emmik epitel hücrelerinin tarafsız bir şekilde zenginleştirilmesi ve sonuçta hücre sınıflandırması ile elde edilebilecek yüksek saflıktır. Timik stromal hücreleri izole etmek için, önce kaburgaların hemen altında bulunan ve kalbin üzerinde iki ince beyaz lob gibi görünen timusu tanımlayın. Daha sonra timusu çevreleyen bağ dokusunu ayırın ve timik lobları nazikçe çekmek ve çıkarmak için kavisli tırtıklı forseps kullanın.
Lobları beş mililitre orta içeren altı oyuklu bir plakaya yerleştirin ve çevredeki yağ ve bağ dokusunu kesin. Daha sonra kesilmiş lobları beş mililitre taze hazırlanmış enzim çözeltisi içeren yeni bir kuyuya aktarın ve dokuda küçük kesikler yapmak için ince makas kullanın. Plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.
20 dakika sonra, bulamacı tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için dokuyu beş mililitrelik bir pipetle birkaç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Enzimleri nötralize etmek için süpernatan fraksiyonu, buz üzerinde 10 mililitre soğuk albümin açısından zengin tampon içeren 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Daha sonra kalan dokuya 2,5 mililitre enzim çözeltisi ekleyin.
Plakayı 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, herhangi bir agregayı parçalamak için dokuyu 18 gen iğnesi ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga ile hafifçe çalkalayın. Ardından toplama tüpüne aktarın.
Daha sonra kalan dokuya 2,5 mililitre enzim çözeltisi ekleyin. Plakayı 15 dakika inkübe edin. Üçüncü inkübasyondan sonra, mekanik çalkalamayı 20 5G iğne ile tekrarlayın.
Dokuyu son beş ila 10 dakika inkübe ettikten sonra, geri kazanılan teknolojiyi akış sitometrisi ile tanımlamak için süpernatanı santrifüjleme için toplama tüpüne aktarın Standart antikor boyama prosedürlerini takiben, numuneleri çok parametreli bir akış sitometresinde çalıştırın ve teknolojiyi kaydırma yöntemiyle daha da zenginleştirmek için uygun faks analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. İlk olarak, hücreleri zenginleştirme için uygun antikorla inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu önceden kodlanmış bir kaydırma plakasına ekleyin ve ardından plakayı döndürün ve oda sıcaklığında inkübe edin.
30 dakika sonra, plakayı kuvvetlice döndürün ve ardından süpernatanı konik bir tüpe aktarın. Plakayı taze, orta ile iki kez durulayın, yıkamaları toplama tüpünde toplayın. Daha sonra, hücreleri döndürdükten sonra, peleti beş mililitre taze, orta sıcaklıkta yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu yeni bir kaydırma plakasına aktarın, zenginleştirilmiş teknolojiyi timik hücre alt kümelerine daha fazla saflaştırmak için gösterildiği gibi döndürüldükten ve inkübe edildikten sonra hücreleri toplayın.
Uygun antikorlarla etiketlendikten sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile teknolojiyi 100 mikrometrelik bir nozuldan sıralayın ve hücreleri ortamda hacim FBS başına% 30 hacimde toplayın. Teknolojiyi akış sitometrisi ile tanımlamak için bu temsili geçit stratejisinde, teknoloji tarafından CD 45'in değil, epca'nın ifadesi gözlemlenebilir. Bu nedenle, teknoloji ep, camm ve CD'lerine göre kapılanabilir, 45 ekspresyon teknolojisi kortikal veya CEC ve medüller veya mtech timik epitel alt kümelerinden oluşur.
Bu alt kümeler, ctec tarafından eksprese edilen G glutamil amino peptidazı tanıyan canlı 51 antikoru ve yüzeylerinde hem ctech hem de Mtech eksprese MHC Sınıf iki'ye bağlanan lektin UEA antikoru ile ayırt edilebilir. Her ne kadar mtech, mtech düşük ve mtech yüksek popülasyonlar olarak daha fazla sınıflandırılabilse de, MHC iki ekspresyon seviyelerine bağlı olarak, kollajenaz ve disk boşluğu içeren bir protokole kıyasla, az önce gösterilen liaz enzim bazlı protokol kullanılarak yaklaşık sekiz kat daha fazla teknoloji geri kazanılabilir. geri kazanılan stromal hücreler. Kaydırma, tam olarak hazırlanmış timus hücrelerine kıyasla timosit bölgelerini tüketmek için gösterildiği gibi kullanılabilir.
Zenginleştirilmiş hücre popülasyonunda teknoloji oranı %0,5'ten azdan %15'in üzerine çıkmaktadır. Kaydırmadan sonra, teknoloji alt kümelerinin oranları değiştirilmez, bu da kaydırma sırasında hiçbir alt kümenin seçici olarak kaybolmadığını gösterir. Preen zenginleştirme numunesi ile karşılaştırıldığında, teknolojinin geri kazanım oranı yaklaşık %85'tirBu videoyu izledikten sonra, tematik germ hücrelerinin panikle daha fazla nasıl zenginleştirileceğini ve ayrıca akış sitometrisi ile daha fazla tematik epitel alt tabakasını nasıl tanımlayacağınızı ve saflaştıracağınızı iyi anlamalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fare timus epitelyal hücrelerinin (TEC'ler) izolasyonu, tanımlanması ve saflaştırılması için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, timus fonksiyonu, T hücre gelişimi ve timus işlev bozukluğu üzerine yapılan çalışmaları kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Timüs Fonksiyonu
Arka Plan
- Timüs epitelyal hücreleri, T hücre gelişiminde önemli bir rol oynar.
- TEC'leri anlamak, timus seçimi süreçlerine dair bilgiler sağlayabilir.
- Timüs işlev bozukluğu yaşlanma ve çeşitli hastalıklarla ilişkilidir.
- T hücrelerinin yeniden oluşturulması terapötik stratejiler için hayati öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Detaylı analiz için TEC'leri izole etmek ve saflaştırmak.
- Timüs seçilim mekanizmalarını araştırmak.
- Yaşlanmada timus işlev bozukluğunun nedenlerini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Timüsün enzimatik sindirimi ve mekanik parçalanması.
- TEC'lerin analizi için akış sitometrisi.
- TEC'lerin zenginleştirilmesi için panlama stratejisi.
- TEC alt gruplarının saflaştırılması için floresans aktif hücre sıralama.
Ana Sonuçlar
- TEC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi ve saflaştırılması.
- T hücre gelişiminde rol oynayan önemli TEC alt gruplarının tanımlanması.
- Timüs seçilim mekanizmalarına dair bilgiler.
- T hücre yeniden oluşturma terapileri için potansiyel etkiler.
Sonuçlar
- Açıklanan yöntem, TEC'leri incelemek için etkilidir.
- Bulgulara timus fonksiyonu ve işlev bozukluğunun anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Gelecek araştırmaları bu protokol üzerine inşa edilerek T hücre gelişimini araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
