İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Bu prosedürün genel amacı, timik epitel hücrelerini veya teknolojisini izole etmek, tanımlamak ve saflaştırmaktır. Bu, teknolojiyi tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için önce enzimatik olarak, timusun sindirilmesi ve mekanik olarak parçalanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, teknoloji akış sitometrisi ile analiz edilebilir veya bir kaydırma stratejisi ile zenginleştirilebilir.

Sonuç olarak, timik epitel alt kümeleri floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile saflaştırılabilir. Bu yöntem, T hücresi gelişimi alanındaki birçok önemli soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, timik epitel hücreleri timik seçimi nasıl teşvik eder? Yaşlanan hayvanlarda timik disfonksiyona ne sebep olur ve in vitro olarak T hücresi sulandırmasını nasıl sağlayabiliriz?

Bu tekniğin temel avantajları, değişken emmik germa hücrelerinin yüksek oranda geri kazanılması, emmik epitel hücrelerinin tarafsız bir şekilde zenginleştirilmesi ve sonuçta hücre sınıflandırması ile elde edilebilecek yüksek saflıktır. Timik stromal hücreleri izole etmek için, önce kaburgaların hemen altında bulunan ve kalbin üzerinde iki ince beyaz lob gibi görünen timusu tanımlayın. Daha sonra timusu çevreleyen bağ dokusunu ayırın ve timik lobları nazikçe çekmek ve çıkarmak için kavisli tırtıklı forseps kullanın.

Lobları beş mililitre orta içeren altı oyuklu bir plakaya yerleştirin ve çevredeki yağ ve bağ dokusunu kesin. Daha sonra kesilmiş lobları beş mililitre taze hazırlanmış enzim çözeltisi içeren yeni bir kuyuya aktarın ve dokuda küçük kesikler yapmak için ince makas kullanın. Plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

20 dakika sonra, bulamacı tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için dokuyu beş mililitrelik bir pipetle birkaç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Enzimleri nötralize etmek için süpernatan fraksiyonu, buz üzerinde 10 mililitre soğuk albümin açısından zengin tampon içeren 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Daha sonra kalan dokuya 2,5 mililitre enzim çözeltisi ekleyin.

Plakayı 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, herhangi bir agregayı parçalamak için dokuyu 18 gen iğnesi ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga ile hafifçe çalkalayın. Ardından toplama tüpüne aktarın.

Daha sonra kalan dokuya 2,5 mililitre enzim çözeltisi ekleyin. Plakayı 15 dakika inkübe edin. Üçüncü inkübasyondan sonra, mekanik çalkalamayı 20 5G iğne ile tekrarlayın.

Dokuyu son beş ila 10 dakika inkübe ettikten sonra, geri kazanılan teknolojiyi akış sitometrisi ile tanımlamak için süpernatanı santrifüjleme için toplama tüpüne aktarın Standart antikor boyama prosedürlerini takiben, numuneleri çok parametreli bir akış sitometresinde çalıştırın ve teknolojiyi kaydırma yöntemiyle daha da zenginleştirmek için uygun faks analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. İlk olarak, hücreleri zenginleştirme için uygun antikorla inkübe edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu önceden kodlanmış bir kaydırma plakasına ekleyin ve ardından plakayı döndürün ve oda sıcaklığında inkübe edin.

30 dakika sonra, plakayı kuvvetlice döndürün ve ardından süpernatanı konik bir tüpe aktarın. Plakayı taze, orta ile iki kez durulayın, yıkamaları toplama tüpünde toplayın. Daha sonra, hücreleri döndürdükten sonra, peleti beş mililitre taze, orta sıcaklıkta yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu yeni bir kaydırma plakasına aktarın, zenginleştirilmiş teknolojiyi timik hücre alt kümelerine daha fazla saflaştırmak için gösterildiği gibi döndürüldükten ve inkübe edildikten sonra hücreleri toplayın.

Uygun antikorlarla etiketlendikten sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile teknolojiyi 100 mikrometrelik bir nozuldan sıralayın ve hücreleri ortamda hacim FBS başına% 30 hacimde toplayın. Teknolojiyi akış sitometrisi ile tanımlamak için bu temsili geçit stratejisinde, teknoloji tarafından CD 45'in değil, epca'nın ifadesi gözlemlenebilir. Bu nedenle, teknoloji ep, camm ve CD'lerine göre kapılanabilir, 45 ekspresyon teknolojisi kortikal veya CEC ve medüller veya mtech timik epitel alt kümelerinden oluşur.

Bu alt kümeler, ctec tarafından eksprese edilen G glutamil amino peptidazı tanıyan canlı 51 antikoru ve yüzeylerinde hem ctech hem de Mtech eksprese MHC Sınıf iki'ye bağlanan lektin UEA antikoru ile ayırt edilebilir. Her ne kadar mtech, mtech düşük ve mtech yüksek popülasyonlar olarak daha fazla sınıflandırılabilse de, MHC iki ekspresyon seviyelerine bağlı olarak, kollajenaz ve disk boşluğu içeren bir protokole kıyasla, az önce gösterilen liaz enzim bazlı protokol kullanılarak yaklaşık sekiz kat daha fazla teknoloji geri kazanılabilir. geri kazanılan stromal hücreler. Kaydırma, tam olarak hazırlanmış timus hücrelerine kıyasla timosit bölgelerini tüketmek için gösterildiği gibi kullanılabilir.

Zenginleştirilmiş hücre popülasyonunda teknoloji oranı %0,5'ten azdan %15'in üzerine çıkmaktadır. Kaydırmadan sonra, teknoloji alt kümelerinin oranları değiştirilmez, bu da kaydırma sırasında hiçbir alt kümenin seçici olarak kaybolmadığını gösterir. Preen zenginleştirme numunesi ile karşılaştırıldığında, teknolojinin geri kazanım oranı yaklaşık %85'tirBu videoyu izledikten sonra, tematik germ hücrelerinin panikle daha fazla nasıl zenginleştirileceğini ve ayrıca akış sitometrisi ile daha fazla tematik epitel alt tabakasını nasıl tanımlayacağınızı ve saflaştıracağınızı iyi anlamalısınız.