Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve konumlarını, hareketlerini ve supramoleküler kompleksler halinde dinamik ilişkilerini analiz etmektir. Bu, canlı hücrelerin yüzeyinde çok düşük seviyelerde snap etiketli reseptörlerin eksprese edilmesi ve tek molekül tespitine izin vermek için bunların parlak organik floroforlarla etiketlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hücreler, hücre yüzeyinde hareket eden bireysel reseptör parçacıklarının hızlı bir görüntü dizisinin elde edilmesini sağlayan toplam iç yansıma floresan mikroskobu ile görselleştirilir.

Daha sonra, her bir reseptör parçacığının zaman içindeki konumunu ve yoğunluğunu elde etmek için görüntü dizisine otomatik algılama ve izleme algoritmaları uygulanır. Bu örnekte reseptör komplekslerinin boyutunun kesin bir analizini gösteren sonuçlar elde edilir, beta iki adrenerjik reseptör, görüntü dizisinin başlangıcında parçacıkların yoğunluk dağılımının karışık bir Gauss uyumuna dayanır. Bu yöntem, reseptörlerimizin canlı hücrelerin yüzeyinin od alanlarında nasıl organize olduğu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Dimerler ve oligomerler oluşturmak için birbirleriyle nasıl etkileşime girerler ve reseptör sinyallemesinin temelindeki dinamik olaylar gerçekte nasıl gerçekleşir. Bu tekniğin standart biyokimyasal ve mikroskopi yöntemlerine göre en büyük avantajı, doğal ortamdaki tek reseptörlerin davranışını araştırması ve böylece tipik olarak topluluk ölçümlerinde gizlenen önemli yönleri incelememize izin vermesidir. Arka plan floresansını en aza indirmek için numuneler için lameller kapsamlı bir şekilde temizlenmelidir Görüntüleme sırasında, 24 milimetre çapında yerleştirmek için temiz cımbız kullanın.

Cam kapak, tek tek kapak fişlerini ayıran bir kapak fişi tutucusuna kayar. Kapak fişli tutucuyu bir behere koyun ve kapak fişleri kapanana kadar kloroform ekleyin. Banyoda buharlaşmayı azaltmak ve sonikat yapmak için beheri alüminyum folyo ile örtün.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca sonikate. Bir saat sonra, kapak kayma tutucusunu beherden çıkarın ve kapak kızaklarının kurumasını bekleyin. Ardından, tutucuyu kapak kızaklarıyla birlikte başka bir behere yerleştirin ve kapak kızakları kaplanana kadar beş molar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin.

Daha önce olduğu gibi, kabı folyo ile örtün ve oda sıcaklığında bir saat boyunca sonikat yapın, kapak kayma tutucusunu yeni bir behere aktarın ve üç kez damıtılmış su ile yıkayın. Son olarak, temizlenmiş lamel fişlerini %100 etanol ile doldurulmuş bir cam hücre kültürü kabına koyun. Burada, toplam iç yansıma floresansı veya çim mikroskobu ile görüntülenen, temizlikten önce ve sonra gösterilen kapak fişleri gösterilmektedir.

Cal kalibrasyon numuneleri, çim mikroskobu sırasında tek floresan moleküllerinin yoğunluğunu tahmin etmek için kullanılır. Numuneleri hazırlamak için floresan boyayı uygun çözücü içinde çözün. Floresan boyanın bir pikaMolar ile bir ano molar arasında değişen bir ila 10 seri seyreltmesini hazırlayın.

Filtrede sterilize edilmiş su. Önceden temizlenmiş kapak fişlerini, filtreyle sterilize edilmiş su ile doldurulmuş bir hücre kültürü kabına aktararak yıkayın. Bundan sonra, her bir kapak fişini altı kuyulu bir hücre kültürü plakasının bir kuyusuna yerleştirin ve her bir floresan boya seyreltmesinden 20 mikrolitre kuruyana kadar bekleyin, ayrı bir temizlenmiş kapak fişi üzerinde.

Kapağın steril bir başlık altında kurumasını bekleyin. Transfeksiyondan önce kullanana kadar kapak kızaklarını ışıktan ve tozdan koruyun. Altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakası hazırlayın: Temizlenmiş örtü fişlerini steril PBS ile yıkayın ve altı kuyucuklu hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna bir örtü fişi yerleştirin.

Bu çalışma için transfekte edilecek CHO hücreleri, tripsin sonrası %10 fetal sığır serumu, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş, bire bir, ECCO'lar modifiye kartal besiyeri besin karışımı F 12'de %5 CO2'de 37 santigrat derecede kültürlenir ve standart yöntemler izlenerek hücrelerin sayımı, oyuk başına üç kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda tohumlanır. Örtü kaymalarını içeren altıncı kuyucuklu hücre kültürü plakasında, optimum hücre yoğunluğu olan yaklaşık% 80 co akıcılığı elde etmek için hücrelerin 24 saat boyunca bir inkübatörde büyümesine izin verin. Transfeksiyon için.

Bu protokolün en zor yönü, başarıyı sağlamak için hücre yüzeyinde zar reseptörlerinin son derece düşük ekspresyon seviyesine ulaşmaktır. Transfeksiyon durumu. Örneğin, artı ortam NA miktarı ve transfeksiyondan sonraki süre transfeksiyon gününde optimize edilmelidir.

Transfeksiyon reaktiflerini, her biri için hazırlayın, istenen ekose DNA'nın iki mikrogramını başka bir tüpte 500 mikrolitre optimum ortamda seyreltecektir. Her kuyucuk için altı mikrolitre Lipectomy 2000'i 500 mikrolitre Optum ortamında seyreltin. Her iki tüpü de oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, her iki çözeltiyi de bir tüpte birleştirin ve bir transfeksiyon karışımı elde etmek için karıştırın. Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bu arada, CHO hücrelerini hazırlayın.

Hücreleri önceden uyarılmış PBS ile iki kez yıkayın İkinci yıkamadan sonra, PBS'yi% 10 FBS ile desteklenmiş, ancak antibiyotik içermeyen% 12 fenol kırmızısı içermeyen D-M-E-M-F 12 ortamı başına bir mililitre ile değiştirin. Transfeksiyon karışımından bir mililitre ekleyin, her bir oyuğa damla damla ekleyin ve tam karışımı sağlamak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın. Hemen protein etiketlemesine geçmeden önce 37 santigrat derecede% 5 CO2'de iki ila dört saat inkübe edin.

Bu prosedüre başlamak için, bir mikrolitre floro dört konjuge benzo guine türevi veya floro dört BG stok çözeltisinin bir mililitresinde seyreltin% 10 FBS ile desteklenmiş bir mililitre DMMMF 12 ortamında bir mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için. Transfekte edilmiş hücreleri inkübatörden alın ve ön ısıtma PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi bir mililitre bir mikromolar floro dört BG çözeltisi ile değiştirin ve 37 santigrat derecede% 5 CO2'de 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri her seferinde% 10 FBS ile desteklenmiş D-M-E-M-F 12 ortamı ile üç kez yıkayın, ardından 37 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyon yapın. Etiketli hücrelere sahip kapak fişlerini bir görüntüleme odasına aktarmak için cımbız kullanıldı. 300 mikrolitre görüntüleme tamponu ile iki kez yıkayın.

300 mikrolitre taze görüntüleme tamponu ekleyin ve hemen görüntüleme görüntüleri elde edilir. Yağa daldırma, yüksek sayısal açıklık objektifi, uygun lazerler, elektron çarpımı yük bağlantılı cihaz, kamera ve inkübatör ve bir sıcaklık kontrolü ile donatılmış bir çim mikroskobu kullanma. Lazer çizgisi, çim açısı, pozlama süresi, kare hızı ve film başına görüntü sayısı gibi istenen mikroskop parametrelerini ayarlayın.

Mikroskobun 100 x hedefine bir damla daldırma yağı koyun. Etiketli hücrelerin bulunduğu görüntüleme odasını mikroskobun örnek tutucusuna yerleştirin ve hücreleri odak noktasına getirin. Parlak alan aydınlatması kullanma.

Çim aydınlatmasına geçin. İstenen hücreyi aramaya izin vermek için lazer gücünü mümkün olduğunca düşük tutun, ancak aynı zamanda foto ağartmayı en aza indirin. İstediğiniz hücreyi seçin ve ince yapın.

Odağı ayarlayın. Lazer gücünü, tek flora dörtlüsünün görüntülenmesine izin verecek bir seviyeye yükseltin. Bir görüntü dizisi alın ve ham görüntü dizisini kalibrasyon için bir tiff dosyası olarak kaydedin.

Her kalibrasyon örneğini görüntüleme odasına monte edin ve mikroskobun üzerine yerleştirin. İyi ayrılmış kırınım içeren bir numune seçin. Tek bir adımda ağartıcı olan sınırlı noktalar.

Çim görüntü dizileri daha sonra etiketli hücreler için gösterildiği gibi elde edilir. Bir görüntü dizisi hazırlamak için, görüntüleri kırpmak üzere Image J gibi bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Tek tek kareleri, her görüntüdeki kare numarasını belirten yeni bir klasöre ayrı TIFF görüntüleri olarak kaydedin.

Partikül tespiti ve takibi, MATLAB ortamında U Track gibi ticari olmayan bir yazılım ile gerçekleştirilir. MATLAB komut isteminden film seçici, GUI yazın. Film seçimi arayüzünü açmak için, önceden kaydedilmiş ayrı görüntülerden başlayarak yeni bir film veritabanı oluşturmak için talimatları izleyin.

Parçacık algılama ve izleme için gerekli olan nanometre cinsinden piksel boyutunu, saniye cinsinden zaman aralığını, sayısal diyafram açıklığını, kamera bit derinliğini ve floroforun emisyon dalga boyunu sağlayın. Film veritabanını film seçim arayüzünden kaydedin. Nesne türü olarak tek parçacıkları seçerek analizi çalıştırın.

Algılama algoritmasını çalıştırın, ardından izleme algoritmasını çalıştırın. Parçaları görselleştirmek ve algılama ve izlemenin kalitesini kontrol etmek için URAC paketinde bulunan film görüntüleyici rutinini kullanın. Her karede izlenen parçacıkların konumunu ve genliğini görmek için nokta MAT dosyasını açın.

Parçacıkların boyutu, elde edilen verilerden de hesaplanabilir. Burada gösterilen, çıtçıt etiketli beta iki adrenerjik reseptör ile transfekte edilmiş ve bir floro dört konjuge benzil guine türevi ile etiketlenmiş bir hücrenin tipik bir çim görüntü dizisinin ilk karesidir. Noktalar, tek reseptörleri veya reseptör komplekslerini temsil eder.

Aynı görüntü dizisine bir algılama algoritması uygulanır ve algılanan her parçacık, bir izleme algoritmasının mavi daire uygulamasıyla gösterilir. Aynı görüntü dizisine, mavi ile gösterilen tek tek parçacıkların yörüngeleri ile sonuçlanır. Yeşil segmentler birleştirme olaylarını, kırmızı segmentler ise bölme olaylarını temsil eder.

Bu yöntem aynı zamanda dinamik olayları da yakalar. Bu örnekte, iki parçacık geçici bir etkileşime girer, birkaç kare için birlikte hareket eder ve tekrar bölünür. Tek tek parçacıkların yörüngeleri, difüzyon katsayılarını hesaplamak için kullanılır.

Bu temsili sonuç, beta iki adrenerjik reseptörün yüksek hareketliliğe sahip olduğunu göstermektedir. Gaba B reseptörü sınırlı hareketliliğe sahipken, reseptör komplekslerinin boyutu, parçacık yoğunluklarının dağılımlarının karışık bir Gauss modeli ile uydurulmasıyla kesin olarak tahmin edilebilir. Bu analiz aynı zamanda monomerlerin ve dimerlerin bir arada bulunmasını da ortaya çıkarabilir.

Burada, bir adımda bir monomerik reseptör partikülü ağartma ve iki adımda bir çap reseptör partikülü ağartma örnekleri gösterilmiştir. Bu prosedürler, diğer hücre yüzey proteinleri, seviyelendirme yöntemleri ve hücre modelleri ile çalışmak üzere genişletilebilir ve uyarlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, temiz örtü uykusunun nasıl üretileceğini, parlak organik floros ile düşük ekspresyon seviyelerinin ve verimli etiketlemenin nasıl elde edileceğini ve ayrıca başarılı tek molekül için tüm önemli adımları temsil eden çim görüntülerinin nasıl elde edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.