Name: Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Öğrenin, çoklu hedef izleme algoritması kullanarak plazma membranında tek molekül takibini. Epidermal büyüme faktörü reseptörü modeliyle nanometre ölçekli membran dinamiklerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onların destek ve verimli tartışmalar için, ekibimizin üyeleri, teknik yardım için özellikle MC Blache yanı sıra M Irla ve B Imhof teşekkür ederiz. Deflasyon ve lohusalık ile ilgili rakamlar Doğa Yöntemleri izniyle çoğaltılamaz. Bu proje, CNRS, İNSERM ve Marseille Üniversitesi, ve Région Provence-Alpes-Côte-d&#39;Azur, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche (belirli hibe tarafından kurumsal hibelerle desteklenmektedir ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) ve Fondation pour la Recherche medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR Ligue Nationale Contre le Kanser bir burs ile desteklenmektedir.

Bu videoda, belirli bir membran reseptör hedefleyen kuantum noktaları kullanarak, tam bir tek parçacık izleme deneyi sunuyoruz. Bu deneyin temel amacı canlı hücrelerin plazma zarının içinde ölçülen moleküler difüzyon davranışları ayırt farklı tipte oluşur. Gerçekten de, membran ortaya çıkan moleküler hareketleri genellikle doğrusal olarak yönlendirilmiş veya örneğin nanodomains 26-29, içinde sınırlı kalarak Brownian difüzyon sapabilir. Biz canlı bir hücre zarı içinde meydana dinamikleri ortaya çıkan çeşitli bir anlık sağlamak için, aynı zamanda teknik olarak mümkün olduğunca çok sayıda reseptör olarak takip hedefliyoruz. Bu, nihai olarak hücre yüzey reseptörü sinyalleşme düzenleyen mekanizmalarının deşifre izin beklenmektedir. 1. Hücre Kültürü <ol><li> Hücresel örnek hazırlayın: endojen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) 30 ifade yapışık COS-7 hücreleri kullanır. Ne zamanantibiyotik hazırlanması sırasında her zaman uygun steril teknikleri kullanarak herhangi bir gizli alt saptanabilir kirlenme var emin olmadan canlı hücreleri ile çalışıyor. </li><li> Bunların sahip özen,% 7 CO 2 ile 37 ° C &#39;de, tam bir ortam (% 10 buzağı serumu ile DMEM,% 1 glutamin,% 1 HEPES ve% 1 sodyum piruvat, aşağıda özel reaktiflerin tablosu bakınız) hücre büyümesi Lab-Tek onları yayılmadan önce alt birleşmiş, üstel büyüme. </li><li> Gün deneyden önce, 8-kuyu odaları (Lab-Tek) in / de 5.000 hücreleri yayılmış ve bir gece inkübe edin. Hücrelerin sayılması, hücre başına kuantum nokta tekrarlanabilir bir oranı böylece sabit bir hücre yoğunluğu sağlar. </li></ol> 2. Hücre Etiketleme Özel bir kaplama ile kuantum noktalar hazırlayın. Kuantum-nokta yarıiletkenler oluşan floresan nanopartiküller vardır. Onlar klasik kıyasla çok parlak ve ışığa, çünkü bu nanopartiküller yüksek bir faiz sunmaktek bir molekül görüntüleme için gürültü oranı (SNR) için uygun bir sinyal başarı sağlayan floresan probların 31,32. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 21 deneyden önce, papain ile sindirim, hibridom hücre çizgisinden (mAb 108, ATCC HB-9764) gelen EGFR karşı Fab parçaları üretir. </li><li> Konjuge biotin ile Fab, üreticinin talimatlarına (EZ-link sülfo-NHS-LC-biyotinilasyon Kiti; Thermo Scientific, Şekil 1A.) Başı olarak. </li><li> 605 nm (hücresel otofloresans gelen parlaklık, algılama ve ayrılması için en uygun emisyon dalga boyu) streptavidin (Invitrogen) ve yayan ile fonksiyonelleştirilmiş kuantum nokta kullanın. </li><li> Kuantum nokta çevresinde Mevcut streptavidins yanı sıra, toplama ve hücrelere ve coverslip üzere spesifik olmayan bağlanma önlemek için doyurmak üzere, (spesifik reaktiflerin tablosu) tam medyum içinde etiketleme çözeltisi hazırlayın. </li><li> Iki ara çözümler hazırlayın:Kuantum-nokta-streptavidin biyotinile Fab ile başka biri, 20 nM her ile bir. </li><li> Bu iki çözüm eşit hacimde bir karıştırın: kuantum nokta kompleksi: 10 nM Fab son bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 1:1 oranında Fab ile kuantum noktalar karıştırın. Eşmolar bir oranı kullanılarak bir kuantum-noktalı ve bir biyotinile Fab parçası oluşan mono-fonksiyonlu kompleksleri oluşumu birleştirmektedir. Bu reseptör 33,34 çapraz bağ nedeniyle artifakı gözlemler sınırlayıcı monovalan, etiketleme yanadır. </li><li> Agregasyonunu önlemek için dakikada 1200 dönüş bir çalkalayıcı kullanarak, 25 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. Karışımı canlı hücreler üzerinde kullanıma hazırdır. </li><li> 7% CO 2 ile 37 ° C de 5 dakika için karışımın 100 ul hücre inkübe. </li><li> Olmayan autofluorescent görüntüleme ortamı (HBSS tampon,% 1 HEPES, özel reaktiflerin tabloya bakınız) 37 önceden ısıtılmış ° C hücreleri yıkayın </li><li> Dikkatle un önlemek için etiket aşırı kaldırmakGerekli geniş görüntüleme ortamı, son yıkama önce en az 5 dakika gecikme ile oda sıcaklığında tipik olarak 5 kez, her iyi yıkayarak, odak dışında kuantum nokta, ilişkisiz tarafından SNR bozulmadan. </li></ol> 3. Optik Ayarı Video-mikroskopi kurulum dört ana bölümden oluşmaktadır: <ol><li> Belirli bir floresan küp (FF01-457/50 uyarma, FF495-DI02 dikroik ve FF01-617/73 emisyon filtreleri, Semrock) ve yüksek sayısal açıklık (1.3 veya 1.49) yağ immersiyon 100x amacı ile bir inverted mikroskop. </li><li> A 100 W civa lambası (termoregülasyon engel kaçınarak, bir fiber optik aracılığıyla mikroskop akuple). </li><li> Bir 512 x 512 piksel yüksek hassasiyeti yeterli SNR ulaşmak için kamera EMCCD. </li><li> Deney süresince 37 ° C&#39;de biyolojik örnekler tutmak için bir kuluçka. </li></ol> 4. Edinme <ol><li> Izole ve iyi yayılmış hücreleri seçin. Buiyi membran moleküllerini düzlemsel hareket aramak için adapte güzel, düz lamellipodia, uzatılması yanadır. </li><li> Iletilen ışık ve floresan hem de görünüşü ile hücresel fizyolojik durumunu değerlendirin: yoğun veziküler trafik, nekrotik ya da apoptotik işaretler, düşük otofloresans ve ortalama güçlü kuantum nokta etiketleme (genellikle hücre başına en fazla 1.000 kuantum nokta olmaması, bkz Şek. 1B, C). </li><li> Aynı anda mümkün olduğunca çok reseptörleri izlenmesi için kritik bir yüksek etiketleme yoğunluğu seçin. Bu aslında her ikisi tarafından fizyolojik (yüzey ekspresyonu, epitop erişilebilirlik, yanal hareket) ve algoritmik parametreleri (örtüşmeyen noktadan yayılan fonksiyonları (PSF), hatta uygun algılama ve yeniden bağlanma izin vermek için, hareket nedeniyle hesap bulanıklık dikkate alınarak). Sınırlıdır </li><li> Her hücre, önce daha fazla, hücre yönü kontrol izin veren bir aydınlık alan görüntüsü (varsa tercihen, DIC kullanarak) eldeve lamellipodia mekansal sınırları. </li><li> Bu sözleşmeler ile bu yana, dic adlı bir alt klasörde, video-yığını (örneğin örneğin cell1.tif &amp; cell1.stk gibi) aynı ismi kullanarak bu görüntüyü kaydet, algoritma otomatik olarak eşleşen görüntüyü bulabilirsiniz Her yığını. </li><li> Tipik olarak 36-ms oranı, bu fotoğraf makinesi ile full frame ulaşılabilir en hızlı oranda, sürekli hücre başına 1 ila 3 videoları edinin. Ancak bir artmış duyarlılık ve / veya daha az piksel ile özel CCD kullanarak, yukarı 1-ms oranı, yüksek frekanslarda edinebilirler. Çerçeve aktarım teknolojisi kareler arasında ihmal edilebilir bir gecikme sağlar. </li><li> Elektron çarpma geliştirme her zaman, en az 20 dB (verimli doruk tespit 1) Yukarıda, yeterli SNR, tipik olarak yaklaşık 25-30 dB tek bir molekül hassasiyeti ulaşmasını sağlamak için azami (sadece doygunluk altında, ilgili ise) olarak ayarlanmalıdır. </li><li> Genellikle video, günah başına 300 kare eldece yörüngeleri çoğunlukla uzun yanıp sönen olayları ile sınırlı ortalama ~ 100 kare üzerinde yeniden inşa edilir. Video frekansı ve uzunluğu, örneğin daha uzun izleri gerektirebilir verilen bir ölçüsüdür için adapte edilebilir. </li></ol> 5.. MTT Analizi <ol><li> Matlab veya Octave verilen bir veri kümesi değerlendirmek video dosyalarını içeren dizinin yolunu seçin. </li><li> Tam automatized analiz 1,35 başlatmak için, Matlab Octave, ya MTT23i, komut detect_reconnex23 yazın. Bu program &quot;kullanıcı arayüzü ile, sürüm 2.3&quot; anlamına gelir ve 2.2 önceki sürümü ile birlikte yüklenebilir. Şek olarak ilk olarak, kullanılan tüm parametreleri listeleyen bir grafik ara gösterir. 2. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar MTT otomatik olarak daha da tamamlanan tespit ve tahmin hedeflerinin izleri, teslim etmek, her kaydedici video analizgibi kapatılma algılama gibi vestigations. Bu sonuçta hücre görüntüleri (Şekil 1C &amp; 3) üzerinden haritalama izleri sağlar. MTT Açıklama Çekirdek MTT analizi 3 ana görevleri (Şekil 3) çağırarak, her kare üzerinde gerçekleştirilir: <ol><li> Sürgülü iki hipotez karşılaştırıldığında arda her piksel etrafında bir alt bölge içinde bir hedef (kuantum nokta), varlığı veya yokluğunun tespiti: PSF ile varlığını ya bir sinyal, bir iki boyutlu bir Gauss pik olarak modelized veya kare başına daha az bir sahte algılama ile, yeterince düşük yanlış alarm sigortalanması bir eşik kullanarak sadece gürültü. Bu tespit bir olasılık haritası yol açar. Her yerel maksimum onun olasılık seviyesinde Yanlış Alarm (PFA) istenen Olasılık göre ayarlanmış bir minimum değer, daha yüksek olduğunu sigortalanması, varsayılan bir hedef olarak kabul edilir. Bu sınır verimli sig ayrımcılık yeterince düşük ayarlıGürültüden nals hala tespit yeterince yüksek bir olasılık verirken teorik olarak tahmin edilen optimum ulaşan 1, en ​​iyi sahte tespitleri (varsayılan olarak 10 -6 PFA, 512 x 512 piksel görüntülerde daha az bir hata sigorta) de kaçınmak. Bir alt-bölge kullanarak şartı görüntü sınırlarının (7 x 7 piksel varsayılan pencere için 3 piksel) değerlendirilemez ima ettiğine dikkat edin. </li><li> Gibi alt-piksel konumu ve sinyal yoğunluğu olarak ilgili parametreler, her tespit edilen hedefin, Tahmin,. Her tespit edilen hedefin, bir en-kare Gauss-Newton uyum yanındaki tespit Gauss pozisyonunu, genişliğini ve yüksekliğini tahmin etmek için yapılır. Bu özellikle boyanın alt-piksel pozisyonlar (tipik SNR değerleri ve hareketsiz veya yavaş difüzyon boyalar için 10 ila 20 nm doğruluğu, 0.1 mikron 2 / s difüzyon boyalar için ~ 100 nm kadar artan) sağlar. </li><li> Ile yeni hedeflerin Reconnectionizleri zaten önceki çerçeve üzerine inşa. Yeni hedeflerin seti önceki izleri seti ile eşleşti. Bu amaç için, bir iz üzere her bir hedef tayin etmek için mümkün olduğunca, algılama adımda elde edilen mevcut tüm istatistiksel bilgi pozisyonu sadece, kullanılabilir, fakat, aynı zamanda yoğunluğu, genişliği, yanıp sönen ve ilişkili istatistikleri edilir. Bu nedenle, hedefler, sadece en yakın iz atanmamış: geçen izleri, yoğunluk, hız, genişlik ve yanıp sönmesi durumunda dikkate alınacaktır. Bu istatistiksel optimum yeniden bağlanma skoru sunar. Yakın komşularına karşı yeniden bağlanma kutuplama mümkün olduğunda, bu strateji, kaçınır. </li></ol> Tespit zirveleri kendi tahmin veya yeniden bağlanma başarısız olursa reddedilir sonradan olabilir. Özel bir test yeni izleri önerge sunacağını yeni zirveler tespiti, işler. Bu test, daha sıkı PFA (10 -7) kullanan bir iz için bir zirve yeniden bağlamadan yana bir doğrulama o gibi fiili yorumlanabilir<html> f alaka (bu kriter yeni zirveleri için geçerli değildir tanımı olmak üzere). Yörünge Analizi Olası geçici doğumdan sonraki ters yerel difüzyon 24-29 ile ilgili bir fonksiyon tarafından değerlendirilir. Bir eşik uygulamak bölüm sınırlı tanımlamak veya olmayan sağlar. Bütün izlerini üzerinden bu yineleme, biz geçici hapsetme açısından / olayları yavaşlatmak, membran dinamikleri eşleyebilirsiniz. Bu alternatif ikili veya doğumdan indeksi ayrık değerler kullanılarak temsil edilebilir. Varsayılan olarak, MTT otomatik olarak bir metin dosyasına 8 zirve kaydetme parametrelerini, bu görevleri gerçekleştirir: kare sayısı, i ve j konum, sinyal şiddeti, yarıçapı, ofset ve videonun her karesini (7 satır grubu) ve eser (sütun) için, yanıp sönmeye . Örneklendiği gibi bu çıkış parametreleri, Matlab veya Octave fazla yani izleri veya sinyal yoğunlukları analizi için fread_data_spt alfabeyi kullanarak tekrar edilebilir<html> Ekinde &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example komut. Ayrıca analizler her hücrenin üzerinde izleri eşlemek için (Şekil 1C &amp; 3) ve ilgili parametreleri (örneğin pik şiddetlerini, SNR veya yerel difüzyon değerleri gibi) için histogram dağılımını sağlamak için yol. Her dosya için, ortalama ve her parametrenin standart sapma histogramlarının bir görüntü ile birlikte, bir metin dosyasına kaydedilir. Böyle r 2 kare yer değiştirme gibi Logaritmik dağılımları, geometrik ortalama yol açar. Difüzyon katsayısı D MSD eğrisinin ilk beş puan üzerinden bir doğrusallaştırma hesaplanır. Bu değerler, hücresel reaksiyonlar veya membran organizasyonu etkileyen ilaç / enzimatik tedavilerin örneğin kinetiği için içeren bir deney genel bir bakış sağlar. MTT bir açık kaynak kodu olduğu için, bu yönü kolayca herhangi bir özel soruşturma adapte edilebilir. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;/&gt; Şekil 1.. MTT ile membran reseptörleri dinamikleri izlenmesi. Gibi EGFR (A) Membran bileşenleri, olan biyotinile Fab parçaları (her molekülün yaklaşık olarak doğru ölçeklendirme ile şematik çizim) ile birleştiğinde kuantum nokta ile etiketlenmiş. (B) Tipik floresan görüntüyü tek tek etiketli reseptör karşılık kırınım-sınırlı zirveleri gösteren, 36-ms pozlama süresi ile, canlı bir COS-7 hücre elde. (C) MTT analiz çıktısı hücrenin aydınlık görüntü üzerinde kaplanmış reseptörlerinin rekonstitüe yörüngeleri, görüntülenmesi. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. MTT giriş parametreleri. MTT23i Koşu olarak bizim daha önceki yayın 1 açıklanan tüm giriş parametreleri, adları ve varsayılan değerleri listeleyen bir grafik kullanıcı arayüzü açılır. Algoritması, uzay ve zaman parametreleri (arama pencereler, tepe çapı, maksimum difüzyon<html> ve yanıp sönen) boyutsuz standart birimleri, piksel ve çerçeveler bulunmaktadır. Kalibrasyon çıkış sonuçlar dönüştürmek için sonradan uygulanabilir. 156 nm / pxl ve çerçeve gecikmesi: 36 ms / çerçeve 100x büyütme ile Cascade 512BFT karşılık Varsayılan değerler, piksel boyutu vardır. Müfettişler bu beklenen maksimum difüzyon katsayısı (&quot;Fark max&quot;) ve maksimum yanıp yok (&quot;T kapalı&quot;) gibi birkaç kritik parametreleri, optimize gerekir. Bu iki uzay ve zaman sınırları hemen hemen belli bir deneysel durum için, diğerleri sağlam varsayılan değerlerine ayarlı yeniden ele alınması gereken tek olanlardır. Örneğin, yanlış alarm sayısını doğrudan çoğu durumda tatmin edici kare başına bir daha dolayısıyla daha az milyon piksel başına daha az bir hata sağlamak için ayarlanır. Tüm parametreler kullanıcılar analiz için kullanılan hangi ayarları daha sonra doğrulamak için izin çıktı klasöründe bir metin dosyasına kaydedilir. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 3 &quot;/&gt; Şekil 3. MTT analizi önemli adımlar atıldı. Floresans görüntülerin deneysel bir yığın başlayarak, zirveleri sırayla ve otomatik olarak algılandı, bir Gauss uyum ve çerçeveler üzerinden yeniden (operasyonlarının ilk aralığı, akış şeması üst kısmı) tarafından tahmin edilmektedir. Izleri daha sonuçta ilgili tanımlayıcıları (operasyonların saniye aralığında, alt kısım) ile dinamik bir haritası yol açan, örneğin olası sınırlandırıcı için analiz edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Etiketleme değerlik MTT etkilemez. Artefactual multivalan etiketleme ile getirilen olası yanıltıcı değerlendirmek için, MTT analizi yörüngeleri haritaları oluşturmak ve analiz etmek için, 2 farklı şemaları kullanarak tagged endojen EGFR izlemek için yapıldı. Protokolü açıklandığı gibi (A) Reseptör, biyotin Fab ve kuantum-dots605-streptavidin etiketlenen.Bu durumda, kuantum-noktalar ve streptavidins bir çok-değerliği tek bir boya için birçok reseptör birleştirme ile sonuçlanabilir. (B) reseptörleri doğrudan organik bir boya, Atto647N akuple Fab etiketlenmiş edildi. Bu durumda, bir Fab, dolayısıyla bir reseptörü, birden fazla boyası ile bağlanabilmektedir. (C) kare yer değiştirme (MSD) eğrisi kuantum nokta veya ATTO boyalar (sol ve sağ grafikler, sırasıyla) ile ya etiketli, her hücre için tüm izleri için hesaplanmıştır ortalama. Difüzyon katsayıları MSD (kırmızı noktalı çizgi) beş ilk puan üzerinden doğrusallaştırma tarafından hesaplanmıştır. Benzer difüzyon değerleri (merkez grafik) neden etiketleme Her düzen. Qdot: kuantum dots605 (n = 5 hücreleri), ATTO: Atto647N (n = 7 hücreleri), ns: anlamlı değildi (Student t-testi p&gt; 0.05).

<ol><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).</li>
<li>Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+molecule+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).</li>
<li>Lommerse, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+the+H-ras+membrane-anchor+reveals+domains+in+the+cytoplasmic+leaflet+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane.</a> Biophys. J. 86, 609-616 (2004).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+dynamics+of+glycine+receptors+revealed+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking.</a> Science. 302, 442-445 (2003).</li>
<li>Harms, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+l-type+Ca%282%2B%29+channels+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells.</a> Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).</li>
<li>Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+of+green+fluorescent+proteins+in+living+cells%3A+E-cadherin+forms+oligomers+on+the+free+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface.</a> Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).</li>
<li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+EGFR+signalling+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells.</a> Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).</li>
<li>Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+microdomains+in+a+muscle+cell+membrane+visualized+by+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy.</a> Embo. J. 19, 892-901 (2000).</li>
<li>Seisenberger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+of+the+infection+pathway+of+an+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus.</a> Science. 294, 1929-1932 (2001).</li>
<li>Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+fluid+mosaic+model+of+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Revisiting the fluid mosaic model of membranes.</a> Science. 268, 1441-1442 (1995).</li>
<li>Saffman, P. G., Delbruck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brownian motion in biological membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Papoulis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapoulis%2C+A+%22Probability%2C+Random+Variables+and+Stochastic+Process+277%22">Probability, Random Variables and Stochastic Process 277</a>. , McGraw Hill. (2001).</li>
<li>Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).</li>
<li>Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mountains+yield+nanoscale+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mountains yield nanoscale cell images.</a> Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Andrew, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).</li>
<li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E.+Stat.+Nonlin.+Soft.+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+effects+of+corrals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li>
<li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li>
<li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li>
<li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li>
<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li>
<li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labelling+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li>
<li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li>
<li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li>
<li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li>
<li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li>
<li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions%3A+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tek parçacık izleme, hücre ve mikroskop yönleri yanında, analiz çalışmalarının önemli bir bölümünü temsil eder. , Tespit tahmin ve her kare üzerinde zirve reconnecting: Bu üç ana görevleri gerçekleştirmek için kullanılan algoritma giderir. Ama bu işin sonucu yönü son, ekstra adımlar (örneğin, hareket tarzları, etkileşimleri veya stokiyometri deşifre gibi) için aslında herhangi bir yeni özel soruşturma için adapte edilmesi gerekebilir algoritması kendisi, tertipleyerek bulunur. Ancak, bir kez...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> COS-7 hücre hattı </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5.000 hücreler / kuyu </td></tr><tr><td> Ca 2 olmadan HBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> % 0.05 Tripsin EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Lab-Tek 8-iyi </td><td> Nunc </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Tinile Fab (Fab sentezi için, referans 21) </td></tr><tr><td> MAb 108 den Fab </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 mikrogram </td></tr><tr><td> NHS-Biotin<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18.5 mikrogram </td></tr><tr><td colspan="4"> Orta tamamlayın </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Görüntüleme orta </td></tr><tr><td> Ca 2 ile HBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 ul </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Referans </td></tr><tr><td> Inverted mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000U </td></tr><tr><td> Floresan lambası </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1.3 NA 100x objektif </td><td> Nikon </td><td> Fluor 1.30 planlayın </td></tr><tr><td> 1.49 NA 100x objektif </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1.49 </td></tr><tr><td> Kamera </td><td> Roper Bilimsel </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Termostatlı kutusu </td><td> Yaşam Görüntüleme Hizmetleri </td><td> Kutu </td></tr></tbody></table> Ek: MTT ek analiz örneği script fonksiyonu MTT_example (file_name) MTT çıkış sonuçlarını nasıl kurtarılacağını gösteren%%% Temel örnekleri %%% Her trac çizmek içine ve histogram oluşturmak için Floresans yoğunluğu%%% nargin &lt;% 1 eğer hiç file_name sağlanmaktadır? Dosyaları = dir (&#39;* stk.&#39;); Boşsa (dosya), disp (&#39;simdiki veri yok&#39;), dönüş, sonu ise . file_name = dosya (1) adı;% varsayılan: İlk stk dosyası disp ([&#39;varsayılan&#39; file_name &#39;kullanarak&#39;]) son file_param = [file_name &#39;_tab_param.dat&#39;];% çıktı dosyası %% Yük verileri versiyonuna göre bir CD (&#39;output23&#39;)% veya (&#39;output22&#39;), kullanılan % Yasal Uyarı: sürüm 2.2, sadece 7 parametre üretir % Ekstra bir parametre, gürültü, sürüm 2.3 &#39;de eklendi Tek bir tabloda, aynı anda tüm parametreleri okumak için% % Tab_param = fread_all_param (file_param); % Tab_i = tab_param (02:08: sonunda :); tab_j = ... Ayrı tablolarda tüm parametreleri (frame_number hariç) okumak için% % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); eser sayısı ve kare sayısı, bilgilendirici olmayan, atılır, çünkü% dizini 3&#39;tür! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); Iz üzerinden%% Döngü N_traces = boyut (tab_i, 1); % Tablolar N_frames kolon tarafından N_traces hatları N_traces: ITRC = 1 için No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0; sadece% dışı yanıp adımları arsa (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (piksel)&#39;), ylabel (&#39;j (piksel)&#39;) başlık ([&#39;iz #&#39; num2str (ITRC)]) disp (&#39;sonraki izleme için herhangi bir tuşa grev Lütfen&#39;), duraklatma son %% Fluo histogram N_datapoints = sum (tab_blk (:)&gt; 0);% dışı yanıp adımlar yalnızca 2sqrt (N) kutuları kullanılarak geçmiş (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% xlabel (&#39;yoğunluğu (au)&#39;), ylabel (&#39;olay&#39;) title (&#39;parçacıkların floresans şiddetinin histogram&#39;)

Çoklu hedef İzleme (mtt) tarafından plazma membran moleküler difüzyon haritalama

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Amacımız farklı biyolojik fonksiyonları hücre zarının meydana gelen moleküler süreçlerin kapsamlı bir açıklaması elde etmektir. Çoklu Hedef İzleme (MTT) 1: Biz yüksek yoğunlukta Tek Parçacık Takibi (SPT) adanmış analitik araçları geliştirerek, tek-molekül düzeyinde karmaşık organizasyon ve plazma zarı dinamikleri karakterize hedefliyoruz. Milisaniye ve nanometrik 1-11 çözünürlük sunan tek-molekül videomicroscopy, doğru, hücre reseptörlerine lokalizasyonu, mobilite, tutuklama veya etkileşimleri gibi tanımlayıcılar eşleyerek membran organizasyonu 12-14 ayrıntılı bir temsilini sağlar. Biz hem deneysel hem de algoritmik, SPT gözden. Deneysel açıdan moleküler dinamik dinamik bir anlık sağlamak için, mümkün olan en yüksek etiketleme yoğunluğu ulaşan özel bir vurgu ile, kurulum ve hücre etiketleme optimize dahilHepsi bu zarının içinde oluşur. Tepe algılama, tahmin ve yeniden bağlanma, görüntü analiz 15,16 belirli araçları tarafından ele: Algoritmik sorunları yörüngeleri yeniden inşası için kullanılan her adımı ilgili. Algılama sonra deflasyon Uygulama tahlisiye zirveleri başlangıçta komşu, güçlü zirveleri tarafından gizli sağlar. Not olarak, algılama geliştirerek doğrudan yörüngeleri içindeki boşlukları azaltarak, yeniden bağlanma etkiler. Performans genellikle yüksek zamanmekansal çözünürlükte paralel ölçümleri için iki büyük sınırlama temsil eden çeşitli etiketleme yoğunluğu ve gürültü değerleri, Monte-Carlo simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir. Photoswitching veya non-lineer optik on / off ya arda kullanarak, tek moleküllerin için elde edilen nanometrik doğruluk 17, ayrıntılı gözlemler sunabilirsiniz. Bu tür 17 STORM 18, PALM 19,20, 21 ya da RESOLFT 22,23 STED, WHI olarak nanoscopy yöntemlerin temelich genellikle görüntüleme sabit örnekleri gerektirebilir. Merkezi görevi tek moleküllerin kaynaklanan kırınım-sınırlı pik tespit ve tahmin edilmesidir. Bu yüzden böyle Brown hareketi yerine sürekli bir pozisyon hassasiyetini ele almak gibi yeterli varsayımlar sağlayarak, MTT ve sade bir dille Ortaölçek analizleri için uygundur. Dahası, MTT temelde herhangi bir ölçekte kullanılabilir: moleküller için değil, aynı zamanda hücreleri veya hayvanlar için değil, sadece örnek olarak sayılabilir. Bu nedenle, MTT, moleküler ve hücresel ölçeklerde uygulamaları bulur güçlü bir izleme algoritması olduğunu.

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Amacımız, farklı biyolojik fonksiyonlarda hücresel membranlarda meydana gelen moleküler süreçlerin kapsamlı bir tanımını elde etmektir. Yüksek yoğunlukta Tek Parçacık İzleme (SPT) için özelleştirilmiş analiz araçları geliştirerek; Çoklu Hedef İzleme (MTT) aracılığıyla plazma membranının karmaşık organizasyonunu ve dinamiğini tek molekül düzeyinde karakterize etmeyi hedefliyoruz. Milisaniye ve nanometrik çözünürlük sunan tek molekül video mikroskopisi; hücre reseptörlerinin lokalizasyonu, mobilitesi, sınırlanmışlığı veya etkileşimleri gibi tanımlayıcıları doğru bir şekilde haritalandırarak membran organizasyonunun ayrıntılı bir temsilini sağlar. SPT'yi hem deneysel hem de algoritmik olarak yeniden ele aldık. Deneysel yönler; membran içerisinde gerçekleşen moleküler dinamiğin dinamik bir anlık görüntüsünü sunabilmek adına, özellikle mümkün olan en yüksek etiketleme yoğunluğuna ulaşmaya odaklanılarak, düzeneğin ve hücre etiketlemesinin optimize edilmesini içeriyordu. Algoritmik meseleler ise görüntüler analizinden gelen spesifik araçlarla ele alınan; pik tespiti, kestirimi ve yeniden bağlantılandırma gibi yörüngelerin yeniden oluşturulmasında kullanılan her bir adımı kapsıyordu. Tespit sonrası deflasyonun uygulanması, başlangıçta komşu ve daha güçlü pikler tarafından gizlenen piklerin kurtarılmasını sağlar. Özellikle, tespitin iyileştirilmesi, yörüngeler içindeki boşlukları azaltarak yeniden bağlantılandırmayı doğrudan etkilemektedir. Performanslar, yüksek uzay-zamansal çözünürlükteki paralel ölçümler için genellikle iki temel kısıtlamayı temsil eden çeşitli etiketleme yoğunluğu ve gürültü değerleri için Monte-Carlo simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir. Ardışık açma/kapama fotosviçleme veya doğrusal olmayan optikler kullanılarak tek moleküller için elde edilen nanometrik doğruluk, kapsamlı gözlemler sağlayabilmektedir. Bu; genellikle fikse edilmiş örneklerin görüntülenmesini gerektirebilen STORM, PALM, RESOLFT veya STED gibi nanoskopi yöntemlerinin temelini oluşturur. Merkezi görev, tek moleküllerden yayılan difraksiyon sınırlı piklerin tespiti ve kestirimdir. Bu nedenle, Brownian hareketi yerine sabit bir konum doğruluğunun ele alınması gibi uygun varsayımlar sağlandığında, MTT nanoskopik analizler için doğrudan uygundur. Ayrıca MTT, temel olarak herhangi bir ölçekte kullanılabilir: sadece moleküller için değil, örneğin hücreler veya hayvanlar için de kullanılabilir. Dolayısıyla MTT, moleküler ve hücresel ölçeklerde uygulamaları bulunan güçlü bir izleme algoritmasıdır.

Merhaba. Bu videoda, tam bir tekil kuantum izleme deneyi sunuyoruz. Özel bir algoritma, tamamen ISIS görüntü uzmanlarıyla iş birliği içinde tasarlanmıştır. Bu video boyunca, bu tekniğin yöntemini açıklamak için epidermal büyüme faktörü reseptörünü model olarak kullanacağız.Epidermal büyüme faktörü reseptörü, bir transmembran proteindir. Bu reseptör, yalnızca A ve B fragmanlarını korumak için redükte edilmiş monoklonal bir antikor kullanılarak işaretlenecektir. Biotinillenmiş olan A ve B fragmanı, daha sonra kuantum noktasının streptavidinine bağlanacak ve böylece tüm sistem EGF reseptörünü hassas bir şekilde tanıyacaktır.Amacımız, hücre yüzey reseptörlerinin dinamiklerine dair kapsamlı bir bakış sunmaktır. Gerçekten de, moleküler yörüngeler nano domenler içinde kısıtlanarak Brown difüzyonundan sapabilir. Örneğin bu durum, sinyal ortakları veya moleküler iskeleler gibi yapılarla gerçekleşen temel bir etkileşimin imzası olabilir.Yüksek etiketleme yoğunluğu ile birlikte yüksek SPECT zamansal çözünürlükte çalışmayı gerektiren bu olayları, hücre genelinde haritalandırarak kapsamlı bir şekilde tanımlamayı amaçlıyoruz. Bu nedenle, bu yaklaşıma çoklu hedef izleme adını veriyoruz. Deneyin i

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin, çoklu hedef izleme algoritması kullanarak plazma membranında tek molekül takibini. Epidermal büyüme faktörü reseptörü modeliyle nanometre ölçekli membran dinamiklerini inceleyin.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Daha fazla video keşfet