Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Bu videoda tam bir tek kuantum izleme deneyi Hi.In sunuyoruz. Özel bir algoritma tamamen görüntü IŞİD uzmanlarıyla işbirliği içinde tasarlandı. Bu video sırasında, bu tekniğin yöntemini açıklamak için epidermal büyüme faktörü reseptörünü bir model olarak kullanacağız.

Epidermal büyüme faktörü reseptörü bir transmembran proteinidir. Bu reseptör, sadece A a B fragmanını tutmak için indirgenen bir monoklonal antikor kullanılarak etiketlenecektir. A a B fragmanı biyotinile edilir ve bundan sonra, kuantum noktasının streptavidine bağlı olarak, duvar sistemi EGF reseptörünü tam olarak tanıyacaktır.

Amacımız, hücre yüzeyi reseptör dinamiklerinin kapsamlı bir görünümünü sağlamaktır. Gerçekten de, moleküler yörüngeler, nano alanlar içinde hapsedilerek brot difüzyonundan sapabilir. Örneğin, ve bu, örneğin sinyal ortakları veya moleküler iskeleler ile altta yatan bir etkileşimin imzası olabilir.

Bu tür olayları hücre üzerinde haritalandırarak detaylı bir şekilde tanımlamayı amaçlıyoruz, bu da yüksek etiketleme yoğunluğu ile birlikte yüksek SPECT zamansal çözünürlükte çalışmayı gerektiriyor. Bu nedenle bu yaklaşıma çok hedefli izleme adını veriyoruz. Deneyin ilk adımı numunenin hazırlanmasıdır.

Antibiyotiksiz canlı hücreler üzerinde çalışıyoruz. Burada, EGF reseptörlerini endojen olarak eksprese eden maliyet yedi hücre kullanıyoruz. Hücreyi ayırdıktan sonra, laboratuvarın h kuyusunda aynı sayıda hücreye sahip olmak için kesin olarak onaylamamız gerekiyor.

Hücre başına kuantum nokta sayısının öngörülebilirliğini artırmak için kesin bir hücre sayısı çok önemlidir Hücreyi H'de dağıttıktan sonra, laboratuvarı %7 CO2 ile 37 derecede 24 saat inkübe etmeniz gerekir. Bir sonraki adım, antikorlara bağlı kuantum noktasının hazırlanmasıdır. Kuantum noktaları küçük floresan nanoparçacıklardır.

Bu parçacıklar burada çok büyük bir ilgiye sahiptir çünkü klasik floresan prob ve sinyale kıyasla çok parlak ve kararlıdırlar. Bu tür bir deney için burun oranı çok önemlidir. Bu durumda, kuantum noktalarının etrafındaki şerit idelerini doyurmak ve toplanmayı önlemek için tam ortam kullanıyoruz.

Bundan sonra, istatistiksel olarak daha monovalent kuantum noktalarına sahip olmak için bioTE elated proteininde veya ilgilenilen antikorlarda bire bir oranında kuantum noktalarına sahip olduk. Bu deneyde, monoklonal antikorlardan laboratuvarda üretilen ve biotin ile hedeflenen EGF reseptörüne karşı a a b fragmanı kullanıyoruz. Yaklaşık 15 dakikalık inkübasyon sırasında, dakikada 1.200 dönüş ve iki beş derecede bir çalkalayıcı kullanarak kontrolü toplama ve homojenlik altında tutabilirsiniz.

Karışım hazır olduğunda, hücrelerinize ekleyebilirsiniz. Laboratuvar teknolojisinde hücre ayrılmasını önlemek için ortamı kuyudan çok nazikçe çıkarın ve deneyiniz için gerekli miktarda karışım ekleyin. Bu durumda, kuyu başına 100 mikrolitre karışım ekleyeceğiz.

Karışım eklendikten sonra hücrenizi 15 dakika inkübe edebilirsiniz. Bu durumda% 7 CO2 ile 37 derecede. Bu inkübasyondan sonra, ortamda süspansiyon halinde çok sayıda sık ikiz nokta bulabilirsiniz.

Bu kuantum noktaları görüntülemeden önce kaldırılmalıdır. Getirdiğimiz gürültü yüzünden. Bu yüzden her birini, bu durumda birkaç kez, kendinizi yıkamak için beş kez yıkamamız gerekiyor.

Otofloresan olmayan görüntüleme ortamı kullanın. Burada aps ile HBSS buffer kullanıyoruz. Artık hücreleriniz hazır.

Satın alma için kuruluma gitme zamanı. Kurulum, dört ana bölüm, ters çevrilmiş bir mikroskop, göz hassasiyetine sahip bir kamera, güçlü bir cıva lambası ve hücreyi 37 derecede tutmak için bir inkübatörden oluşur. Cıva lambasından gelen ışık, numuneyi aydınlatmadan önce bir fiberden ve bir filtre tekerleğinden geçer.

Numunenin grip eSense'i filtrelenir ve soldaki bir E-M-C-C-D kamera tarafından toplanır. Şu anda hedeflerin 1.3 ve 1.49 sayısal açıklıklı yağ tüccarı kullanıyoruz. Bu deneyin merkezi adımı, kendi başına edinimdir.

Hücreler odaklandıktan sonra, güçlü bir etikete sahip temsili bir hücreye bakarız. Kuantum noktalarında, önce iletilen beyaz ışıkta tek bir görüntü elde ederiz, bu da daha sonra LA podia'nın hücre yönünü ve özel sınırını kontrol etmek için kullanılabilir. Daha sonra, videoyu tipik olarak, tam karede izin verilen en yüksek hız olan 36 milisaniye hızında elde ederiz.

En az 20 desibelin üzerinde yeterli bir sinyal-kuzey oranı ile tek molekül duyarlılığına ulaşmak için elektron çarpan bir CCD kullanıyoruz. Tipik olarak 25 desibel civarında, genellikle 300 kare elde ederiz. Belirli bir veri kümesini değerlendirmek için, yalnızca video dosyalarını içeren dizine geçiş sağlamanız gerekir.

Ardından komutu yazarak, metin MetLab'a veya önce bir grafik arayüz listesi görüntüleyen MTT 23 I komutuna yeniden bağlanır. Kullanılan tüm parametreler tam otomatik analizi başlatacaktır. Çekirdek MTT analizi, her kare üzerinde gerçekleştirilir ve üç ana görevi çağırır: ilk olarak bir hedef kuantum borcunun varlığı veya yokluğu için her piksel için algılama.

Ardından, hedefin her algılama tahmini için piksel konumu, sinyal yoğunluğu vb. gibi ilgili parametreler. Yeni hedeflerin son yeniden bağlanması. Her piksel için önceki karelerin üzerine zaten oluşturulmuş izlerle.

Yerel bir alt bölge göz önüne alındığında, yalnızca gürültü veya bir sinyal olmak üzere iki hipotezin varlığını karşılaştırırız. Nokta yayılma fonksiyonu ile ModuLite bir hin tepe noktasına sahiptir. Tespit edilen her hedef için kare başına birden az perus algılama ile yeterince düşük yanlış alarmlar sağlayan bir eşik kullanıyoruz.

Daha sonra, tespit edilen Goshen'in konumunu, genişliğini ve yüksekliğini tahmin etmek için en az kare hayalet besin ayakları gerçekleştiriyoruz. Bu, özellikle boyanın spic hücre konumunu sağlar, tipik olarak yaklaşık 10 ila 20 nanometre doğrulukta, yüksek yoğunluklu tepe noktalarındaki tipik sinyal-gürültü oranları genellikle çok kapalı olabilir ve güçlü tepeler, en zayıf olanların bununla başa çıkmasını engelleyebilir. Algılanan tepe noktalarını çalışan ilk görüntüden itibaren söndürüyoruz.

Yine, kalıntı üzerindeki algılama tipik olarak tepe noktalarının %10'unu yeniden çarpıtabilir. Neredeyse kapsamlı bir algılamaya ulaşmak, doğru yeniden bağlantı için çok verimlidir. Daha sonra yeni hedefler kümesi, bu öğrenci için önceki izler kümesiyle eşleştirilir.

Mümkünse her bir izi bir hedefe atamak ve olası yanıp sönmeyi ele almak için, algılama adımından elde edilen mevcut tüm istatistiksel bilgileri kullanırız. Bu nedenle, hedefler sadece en yakın ize atanmaz. Çatışma durumunda, izler kesişebildiğinde, yani örtüşme araştırmasının ilgili ilgili bölgeleri söz konusu olduğunda, hem izler hem de hedefler için yoğunluk, hız, genişlik ve göz kırpmanın istatistiksel değerini dikkate alacağız.

Bu, istatistiksel olarak en uygun yeniden bağlantı puanını verir. Strateji, mümkün olduğunda kaçınmaya izin verir, yeniden bağlantıyı en yakın komşulara doğru yönlendirir, bu da en yavaş hareket anlamına gelir. Daha sonra, yörüngeler içindeki olası geçici hapsi değerlendirmek için bir fonksiyon kullanırız.

Bu işlev, Sexton Simpson ve işbirlikçileri tarafından kurulan yerel yayılma ile ters orantılıdır. Bir eşik uygulamak, sınırlı veya sınırlı olmayan bölümleri tanımlamaya izin verir. Bu genel izleri yineleyerek, nihayet zar dinamiklerini geçici hapsetme, yavaşlama kanıtı açısından haritalayabiliriz ve bu temsil edilebilir.

Alternatif olarak, bu hapsetme dizininin ikili veya ayrık değerlerini kullanarak, varsayılan olarak, MTT bu görevleri otomatik olarak gerçekleştirecek, her video için, eski bir dosyadaki her tepe noktası için satır parametrelerini ve daha ileri düzey araştırmalar için kaydedecektir. Her hücre üzerindeki izlerin haritası ve ilgilenilen parametreler, tepe yoğunlukları, sinyal-gürültü oranı, yerel eksik değerler için histogramlar gibi tipik sonuçlar ve bu nedenle bu yön, herhangi bir özel araştırmaya kolayca uyarlanabilir. Bu video şimdi MTT tarafından elde edilen tipik sonuçları özetleyecektir.

Çalışmanın önemli bir kısmı, acı çeken hareket modları veya etkileşimler gibi özel araştırmalara uyarlanması gerekebilecek algoritmanın detaylandırılmasında bulunur. Ancak MTT'yi çalıştırmak çok basittir. Kullanıcılar yalnızca alan ve zaman sınırları gibi birkaç parametreyi optimize etmelidir.

MTT'yi detaylandırırken, her görev için kullanılan analitik seçenekleri tamamen yeniden gözden geçirmeyi amaçladık. Süreci iki zorlu eksende optimize ediyoruz. Birincisi, yüzey yüzeyi üzerinde en iyi özel bilgiyi elde etmek için yüksek yoğunluklarla uğraşmak ve ikincisi, tipik olarak düşük eliminasyon ve yüksek hızlı sınırlamada çalışmaya izin veren zayıf SNR'yi kullanmak, altta yatan bir etkileşimin imzası olarak yorumlanabilir.

Membran reseptörleri, örneğin alt membran hücre iskeleti veya pro lipid alanları ile etkileşime girebilir. Bu tür olaylar, uzay ve zamandaki hapsetme varyasyonları yoluyla araştırılabilir. Dinamik ölçümler, FRA, F, C'ler veya navlun gibi tamamlayıcı yaklaşımlarla karşılaştırılabilir.

Açık kaynak kodu akademik araştırmalar için kullanılabilir. Ekipler sayfamızda bir S fr varsa, indirme için bir bağlantı sağlayan CML dot univ adresindeki web sayfamızdan indirilebilir. İlgilenen sanayiciler de bizimle iletişime geçebilirler.

Ekibimizin üyelerine ve ortak tesislere destek ve verimli tartışmalar için özellikle teşekkür etmek isteriz. Bu proje, c MAA Üniversitesi Pac Bölgesi National de La'daki CNRS'den sağlanan finansmanla desteklenmektedir ve Foundation Medical lig kontrolörü tarafından desteklenmektedir. İzlediğiniz için teşekkürler.