Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Merhaba. Bu videoda, tam bir tekil kuantum izleme deneyi sunuyoruz. Özel bir algoritma, tamamen ISIS görüntü uzmanlarıyla iş birliği içinde tasarlanmıştır. Bu video boyunca, bu tekniğin yöntemini açıklamak için epidermal büyüme faktörü reseptörünü model olarak kullanacağız.

Epidermal büyüme faktörü reseptörü, bir transmembran proteindir. Bu reseptör, yalnızca A ve B fragmanlarını korumak için redükte edilmiş monoklonal bir antikor kullanılarak işaretlenecektir. Biotinillenmiş olan A ve B fragmanı, daha sonra kuantum noktasının streptavidinine bağlanacak ve böylece tüm sistem EGF reseptörünü hassas bir şekilde tanıyacaktır.

Amacımız, hücre yüzey reseptörlerinin dinamiklerine dair kapsamlı bir bakış sunmaktır. Gerçekten de, moleküler yörüngeler nano domenler içinde kısıtlanarak Brown difüzyonundan sapabilir. Örneğin bu durum, sinyal ortakları veya moleküler iskeleler gibi yapılarla gerçekleşen temel bir etkileşimin imzası olabilir.

Yüksek etiketleme yoğunluğu ile birlikte yüksek SPECT zamansal çözünürlükte çalışmayı gerektiren bu olayları, hücre genelinde haritalandırarak kapsamlı bir şekilde tanımlamayı amaçlıyoruz. Bu nedenle, bu yaklaşıma çoklu hedef izleme adını veriyoruz. Deneyin ilk adımı örneğin hazırlanmasıdır.

Antibiyotiksiz canlı hücreler üzerinde çalışıyoruz. Burada, endojen olarak EGF reseptörleri eksprese eden Cos-7 hücrelerini kullanıyoruz. Hücreleri ayırdıktan sonra, laboratuvardaki her kuyucukta aynı sayıda hücreye sahip olmak için bunu kesin olarak onaylamamız gerekir.

Hücre başına düşen kuantum nokta sayısının öngörülebilirliğini artırmak için kesin bir hücre sayısı çok önemlidir. Hücreleri H kuyucuğuna dağıttıktan sonra, lamı %7 CO2 içeren 37 °C sıcaklıkta 24 saat boyunca inkübe etmeniz gerekir. Bir sonraki adım, antikorlarla bağlanan kuantum noktaların hazırlanmasıdır. Kuantum noktalar, küçük floresan nanopartiküllerdir.

Bu partiküller, klasik floresan problara ve sinyallere kıyasla çok parlak ve stabil oldukları için burada büyük bir ilgi görmektedir. Gürültü oranı, bu tip deneyler için çok önemlidir. Bu durumda, kuantum noktalarının etrafındaki şerit kenarlarını doyurmak ve agregasyonu önlemek için tam besiyeri kullanıyoruz.

Ardından, istatistiksel olarak daha fazla monovalan kuantum nokta elde etmek amacıyla, kuantum noktalarını ilgili biyotinli protein veya antikorlarla bire bir oranda karıştırdık. Bu deneyde, laboratuvarda monoklonal antikorlardan üretilen ve biyotinle hedeflenen, EGF reseptörüne karşı bir Fab fragmanı kullandık. Yaklaşık 15 dakikalık inkübasyon süresi boyunca, dakikada 1.200 rotasyon ve 25 °C'de bir çalkalayıcı kullanarak agregasyonu ve homojenliği kontrol altında tutabilirsiniz.

Karışım hazır olduğunda, bunu hücrelerinize ekleyebilirsiniz. Hücrelerin laboratuvar tekniği üzerinde kopmasını önlemek için kuyucuktaki medyumu çok nazikçe uzaklaştırın ve deneyiniz için gereken miktarda karışım ekleyin. Bu durumda, kuyucuk başına 100 µL karışım ekleyeceğiz.

Karışımın eklenmesinden sonra, hücrenizi 15 dakika boyunca inkübe edebilirsiniz. Bu işlem %7 CO2 içeren 37 °C ortamda gerçekleştirilmelidir. Bu inkübasyonun ardından, besiyeri üzerinde süspansiyon halinde yüksek sayıda sık ikiz noktalar görebilirsiniz.

Bu kuantum noktaları görüntüleme öncesinde uzaklaştırılmalıdır. Çünkü beraberinde gürültü getirirler. Bu nedenle her kuyucuğun, bu durumda beş kez, birkaç kez yıkanması gerekir.

Otofloresan özelliği olmayan görüntüleme ortamı kullanın. Burada aps içeren HBSS tamponu kullanıyoruz. Artık hücreleriniz hazır.

Görüntüleme düzeneğine geçme zamanı. Düzenek dört ana parçadan oluşmaktadır: ters bir mikroskop, göz duyarlılığına sahip bir kamera, güçlü bir cıva lambası ve hücreleri 37 derece sıcaklıkta tutmak için bir inkübatör. Cıva lambasından gelen ışık, örneği aydınlatmadan önce bir fiberden ve bir filtre tekerleğinden geçer.

Numunenin floresan sinyali filtrelenir ve soldaki bir E-M-C-C-D kamera tarafından toplanır. Şu anda 1,3 ve 1,49 sayısal açıklıklı yağ daldırma objektifler kullanmaktayız. Bu deneyin merkezi adımı, görüntünün kendisinin elde edilmesidir.

Hücreler odaklandığında, güçlü etiketlemesi olan temsilci bir hücreyi inceleriz. Kuantum noktalarında, önce iletilen beyaz ışık altında tek bir görüntü alırız; bu görüntü daha sonra hücre görünümünü ve LA podyumlarının özel sınırını kontrol etmek için kullanılabilir. Ardından, genellikle tam karede izin verilen en yüksek hız olan 36 milisaniye hızında video kaydı yaparız.

Tek molekül hassasiyetine ulaşmak için, sinyal-gürültü oranı en az 20 desibelin üzerinde olan bir elektron çarpanlı CCD kullanıyoruz. Bu oran tipik olarak 25 desibel civarındadır ve genellikle 300 kare kaydediyoruz. Belirli bir veri setini değerlendirmek için, yalnızca video dosyalarını içeren dizinin yolunu belirtmeniz yeterlidir.

Ardından komut yazıldığında, MetLab'de metin yeniden bağlanır veya öncelikle parametrelerin listelendiği bir grafik arayüz görüntüleyen MTT 23 I komutu, kullanılan tüm parametrelerle birlikte tam otomatik analizi başlatacaktır. Temel MTT analizi her kare üzerinde gerçekleştirilir ve üç ana görevi çağırır; bunlardan ilki, her piksel için hedef kuantum borcunun varlığı veya yokluğunun tespiti işlemidir.

Ardından, her bir tespit için hedefin piksel konumu, sinyal yoğunluğu ve benzeri ilgili parametrelerin tahmini yapılır. Son olarak, her piksel için önceki kareler üzerinden halihazırda oluşturulmuş izler kullanılarak yeni hedeflerin yeniden bağlanması gerçekleştirilir.

Yerel bir alt bölge dikkate alındığında, yalnızca gürültünün mevcut olduğu veya bir sinyalin bulunduğu şeklinde iki hipotezi karşılaştırırız. Nokta yayılım fonksiyonu ile ModuLite ince bir tepe noktasına sahiptir. Tespit edilen her hedef için kare başına birden az hatalı tespit olacak şekilde, yeterince düşük yanlış alarm oranını sağlayan bir eşik değer kullanırız.

Sırada, tespit edilen Gaussiyenlerin konumunu, genişliğini ve yüksekliğini tahmin etmek için en küçük kareler yöntemiyle bir Gaussiyen uydurma işlemi gerçekleştiriyoruz. Bu işlem, özellikle boyanın hassas hücre konumunu sağlar; yüksek yoğunluktaki pikler için tipik sinyal-gürültü oranlarında genellikle 10 ila 20 nanometre civarında bir doğruluk elde edilir. Pikler genellikle birbirine çok yakın olabilir ve güçlü pikler daha zayıf olanların tespitini engelleyebilir; bunu gidermek için, başlangıç görüntüsü üzerinde tespit edilen pikleri deflasyon yöntemiyle çıkarıyoruz.

Ayrıca, kalıntı üzerinden yapılan tespit tipik olarak piklerin %10'ini yeniden kaydırabilir. Neredeyse kapsamlı bir tespite ulaşmak, doğru yeniden bağlantı için oldukça verimlidir. Ardından, yeni hedefler kümesi, bu pupil için önceki izler kümesiyle eşleştirilir.

Mümkün olduğunca her izi bir hedefe atamak ve olası yanıp sönmeleri (blinking) yönetmek için, tespit adımından elde edilen tüm mevcut istatistiksel bilgileri kullanıyoruz. Bu nedenle, hedefler sadece en yakın ize atanmaz. İzlerin kesişebileceği, yani ilgili araştırma bölgelerinin örtüştüğü çakışma durumlarında, hem izler hem de hedefler için yoğunluk, hız, genişlik ve yanıp sönme istatistiksel değerlerini dikkate alacağız.

Bu, istatistiksel olarak optimal yeniden bağlantı skorunu sağlar. Bu strateji, mümkün olduğunda yeniden bağlantının en yakın komşulara, yani en yavaş harekete doğru yanlılaşmasını önlemeye olanak tanır. Ardından, yörüngeler içindeki olası geçici hapsolmayı değerlendirmek için bir fonksiyon kullanırız.

Bu fonksiyon, Sexton Simpson ve çalışma arkadaşları tarafından belirlendiği üzere, yerel difüzyon ile ters orantılıdır. Bir eşik değerinin uygulanması, hapsedilmiş veya hapsedilmemiş bölümlerin tanımlanmasını sağlar. Bu işlemin tüm izler üzerinde tekrarlanmasıyla, membran dinamiklerini geçici hapsedilme ve yavaşlama kanıtları açısından haritalandırabiliriz ve bu durum temsil edilebilir.

Alternatif olarak, bu sınırlama indeksinin ikili veya ayrık değerleri kullanıldığında, MTT varsayılan olarak bu görevleri otomatik olarak gerçekleştirecek; her video için her bir pikle ilgili satır parametrelerini ileri düzey incelemeler için bir eski dosyasına kaydedecektir. Her hücre üzerindeki izlerin haritası ve ilgilenilen parametrelerin histogram grafikleri, pik şiddetleri, sinyal-gürültü oranı, yerel eksiklik değerleri gibi tipik sonuçlar elde edilir ve böylece bu yönü herhangi bir özel incelemeye kolayca uyarlanabilir. Bu video şimdi MTT ile elde edilen tipik sonuçları özetleyecektir.

Çalışmanın önemli bir kısmı, hareketin kısıtlanma modları veya etkileşimler gibi özel araştırmalara uyarlanması gerekebilecek algoritmanın geliştirilmesinden oluşmaktadır. Ancak MTT'yi çalıştırmak oldukça kolaydır. Kullanıcıların yalnızca uzay ve zaman sınırları gibi birkaç parametreyi optimize etmeleri yeterlidir.

MTT'yi geliştirirken, her bir görev için kullanılan analitik seçenekleri tamamen yeniden değerlendirmeyi hedefledik. Süreci iki zorlu eksen boyunca optimize ediyoruz. Birincisi, yüzey üzerinde en iyi uzamsal bilgiyi elde etmek için yüksek yoğunluklarla çalışmak; ikincisi ise, tipik olarak düşük eliminasyon ve yüksek hızda çalışmaya olanak tanıyan zayıf SNR ile başa çıkmaktır; burada sınırlama, alttaki bir etkileşimin imzası olarak yorumlanabilir.

Membran reseptörleri, örneğin, membran altı hücre iskeleti veya pro lipid domenlerle etkileşime girebilir. Bu tür olaylar, uzay ve zamandaki sınırlanma varyasyonları aracılığıyla incelenebilir. Dinamik ölçümler, FRAP, FCS veya FRET gibi tamamlayıcı yaklaşımlarla karşılaştırılabilir.

Açık kaynak kod akademik araştırmalar için mevcuttur. Ekipler sayfamızda yer alan ve indirme bağlantısı sunan CML dot univ adresindeki web sayfamızdan indirilebilir. İlgilenen endüstriyel kuruluşların da bizimle iletişime geçmesinden memnuniyet duyarız.

Ekibimizin üyelerine ve ortak tesis çalışanlarına destekleri ve verimli tartışmaları için özel olarak teşekkür ederiz. Bu proje, CNRS'in c MAA University Pac Region National de La'dan sağladığı finansmanla ve Medical Vakfı'nın lig kontrolörü tarafından desteklenmektedir. İzlediğiniz için teşekkürler.