Name: Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Keşfedin canlı ve elektron mikroskobu teknikleriyle Hydroides elegans deniz tüsolucanlarında kalsifikasyon olaylarının konum ve yapısını belirleme yöntemini. Bu teknik biyomineralizasyon süreçlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Clemson Broadcast Productions'a, J. Bright'ın ses kaydına, A. D. McQuiston'ın anlatımına, Ses tatlandırıcısına, K. Murphy'ye, G. Spake'in videografisine, T. Messervy'nin grafik sanatlarına, T. Messervy ve E. Rodgers'ın video düzenlemesine çok teşekkür etmek istiyor. Teknik yardım ve bilimsel danışmanlık, S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane ve R. Dineshram'ın tavsiyelerinden esinlenmiştir. Bu çalışma, HKSAR-RGC tarafından sağlanan üç GİF hibesi ile finanse edilmiştir (Hibe Numaraları: 705511P, 705112P ve 17304914).

<ol><li>Aizenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeleton+of+Euplectella+sp.%3A+structural+hierarchy+from+the+nanoscale+to+the+macroscale%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale.</a> Science. 309 (5732), 275-278 (2005).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.4319/lom.2008.6.610/abstract">Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS.</a> Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).</li>
<li>de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. <a target="_blank" href="http://www.biogeosciences.net/6/2669/2009/">Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida.</a> Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00227-013-2210-z">Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids.</a> Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).</li>
<li>Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1542509?seq=1#page_scan_tab_contents">Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae).</a> Biol. Bull. 194 (1), 14(1998).</li>
<li>Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022098197001056">Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+compositional+and+ultrastructural+shifts+during+the+development+of+calcareous+tubes+in+the+biofouling+tubeworm%2C+Hydroides+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans.</a> J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).</li>
<li>DOE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+methods+for+the+analysis+of+the+various+parameters+of+the+carbon+dioxide+system+in+sea+water.+Version+2%22">Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2</a>. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).</li>
<li>Chan, V. B. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.openaire.eu/search/publication?articleId=frontiers___::60dc3ff1cf8480f5672e61caa159856d">Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm.</a> Front Mar Sci. 2, 97(2015).</li>
<li>Bond, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+flow+cytometry+and+SNARF+to+calibrate+and+measure+intracellular+pH+in+NS0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells.</a> Cytometry A. 64, 43-50 (2005).</li>
<li>Lloyd, G. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/249849686_Atomic_Number_and_Crystallographic_Contrast_Images_with_the_SEM_A_Review_of_Backscattered_Electron_Techniques">Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques.</a> Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).</li>
<li>Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+electron+backscatter+diffraction+%28EBSD%29+data+from+calcite+biominerals+in+recent+gastropod+shells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells.</a> Micron. 42 (3), 246-251 (2011).</li>
<li>Bandli, B. R., Gunter, M. E. <a target="_blank" href="http://ammin.geoscienceworld.org/content/97/8-9/1269">Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification.</a> Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+techniques+of+electron+microscopy%3A+biological+applications%22">Principles and techniques of electron microscopy: biological applications</a>. , Cambridge University Press. (2000).</li>
<li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254108001940">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chem Geo. 261, 217-229 (2009).</li>
<li>Volkert, C. A., Minor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+microscopy+and+micromachining%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam microscopy and micromachining.</a> MRS Bull. 32, 389-399 (2007).</li>
<li>Kudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtexture+of+larval+shell+of+oyster%2C+Crassostrea+nippona%3A+A+FIB-TEM+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study.</a> J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Canlı optik görüntüleme, çok hücreli bir organizmadaki hücresel olayları gözlemlemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, mineralizasyon bölgelerindeki iyon akışını ölçmek için dahili pH ve kalsiyum iyonu göstergeleri kullanıldı. Bu bölgelerde, kalsifikasyonu 2,3 sağlamak için pH veCa2+ konsantrasyonunu yükseltmek için aktif iyon pompalama gereklidir. Bir organizmayı incelemek için floresan molekülleri uygularken, kullanılan konsantrasyonun ihmal edileb...

Biyomineralizasyon zarif sipariş mineral 1 üretimi ile sonuçlanan hücre faaliyetlerinin bir paketi köprü etkinlikleri kompleks dizisidir. meydan dinamik hücresel süreci ve optik ve elektron mikroskopisi yöntemleri bir arada kullanarak sofistike mineral yapıları hem karakterize etmektir. Hücre içi pH yükselmesi dolayısıyla, artan bir pH değerine sahip döneminde ortaya tanımlayan kalsifikasyon 2, 3 meydana olması muhtemeldir zaman ortaya Caco 3 kristallerin oluşumunu desteklemektedir. Etti Serpulidae gelen tüp kurtları okyanus 4 ortak calcifiers bulunmaktadır. Özellikle biyolojik kirliliğe 5, 6, aynı zamanda deniz araştırmaları için popüler bir omurgasız modelidir. Bu çalışmada, hidrotermal bölümlerinde kalsifikasyon süreci During Biyomineralizasyon görülmektedir. Metamorfoz hızlı işlem kalsiyum karbonat yapıları 7, 8 çıkmasını içerir. Biz tubeworm yapılabilir nasıl iç pH ölçümleri göstermek ve yaşam evreleri ve kalsifikasyon hakkında dokular nasıl taranabilir. ilgi hayat aşaması tanımlandıktan sonra, kireçlenme sorumlu doku elektron mikroskopisi yöntemleri kullanılarak daha yüksek bir çözünürlükte karakterize edilebilir. Floresan mikroskobu kullanarak, metamorfik indüksiyondan sonra görünmesi kalsiyum karbonat için gereken zamanı belirler. hayatın benzer bir sahne daha sonra element bileşimi dağıtımı için SEM-EDS ile görüntülendi ve biriken mineral, iki farklı elektron mikroskopi yöntemleri, özellikle SEM-EBSD ve FIB-TEM kullanılarak analiz edildi.

<table><tbody><tr><td>Heksametildisilazanan & nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit %2 Sulu Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-İzobutil-1-metilksantin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin, Serbest Asit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>35 mm çaplı çanak, delik boyutu 27 mm, Cam No.0, Kaplamasız</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5- (ve-6) -Karboksi SNARF-1, Asetoksimetil Ester, Asetat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH Potasyum Klorür, ACS Sınıfı</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit reaktif sınıfı, kristalin</td><td>Hacimsel Analiz için Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hidroklorik Asit</td><td>Wako Saf Kimyasal Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>Hacimsel Analiz için 0.05 M Sodyum Hidroksit Çözeltisi</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Marine Karışık</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz Ester Membranları; 47 mm çap, 0.45 & m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>DOE (1994) SOP06 ile</td><td>tamponlar</td><td></td><td></td> için yapay deniz suyu, cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür Heksahidrat</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sülfat</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol (tris)</td><td>Wako Saf Kimya Sanayi, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-aminopiridin</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Orion 5 yıldızlı Plus pH metre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS Mikro Kombinasyon pH Elektrodu 8220BNWP</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aksivizyon, Sürüm 4.6, Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 Odaklanmış İyon ve Elektron Işını (FIB-SEM) sistemi</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir deniz tubeworm canlı optik ve elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak kalsifikasyon olaylar karakterizasyonu

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Kalsiyum karbonatın biyolojik üretiminin ilk olayını karakterize etmek, mikroskopi yaklaşımlarının bir kombinasyonunu gerektirir. İlk olarak, hücre içi pH dağılımı ve kalsiyum iyonları zaman içinde canlı mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilir. Bu, daha ileri elektron mikroskobu çalışmaları için ilgilenilen özelliğe sahip yaşam evresinin ve dokunun tanımlanmasına izin verir. Yaşam evresi ve ilgilenilen dokular tipik olarak pH ve Ca sinyallerinde daha yüksektir. 
Burada, H. elegans kullanarak, taramalı elektron mikroskobu (SEM) üzerinde biyolojik bir örnekte kalsiyum karbonat yapılarının varlığını karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz, element bileşimini görselleştirmek için enerji dağıtıcı X-ışını spektroskopisi (EDS) kullanarak, kristal yapıların varlığını belirlemek için elektron geri saçılma kırınımını (EBSD) kullanarak ve malzemenin bileşimini ve yapısını analiz etmek için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak. Bu protokolde, TEM analizine uygun boyuttaki numuneleri izole etmek için odaklanmış bir iyon demeti (FIB) kullanılır. FIB sahaya özgü bir teknik olduğundan, önceki tekniklerden elde edilen bilgilerin, Ca sinyallerinin en yüksek olduğu ilgili bölgeyi belirlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Aşağıdakiler, tüp solucanının metamorfozu sırasındaki kalsifikasyon sürecine ilişkin bazı gözlemlerdir. Şekil 1, metamorfoz sonrası yaka bölgesi yakınındaki pH değerlerinin diğer dokulardan daha yüksek olduğunu göstermektedir. Şekil 2i, Ca'nın homojen dağılımına sahip bir tüp solucanını göstermekte olup, bu durum önemli kalsifikasyon olaylarının henüz başlamadığını düşündürmektedir; Şekil 2ii, daha uzun süre kalsifiye olmuş bir tüp soluca...

Bir tüp kurdunun, Hydroides elegans'ın kalsifikasyonunu gözlemlemenin yanı sıra ilk kalsifiye materyalin yerini belirlemede ve karakterize etmede yararlı olan çeşitli mikroskopi yöntemlerinin kullanımını gösteriyoruz. Canlı mikroskopi ve elektron mikroskobu, biyomineralizasyonun incelenmesinde önemli olan fonksiyonel ve materyal bilgileri sağlamak için birlikte kullanılır.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Bu prosedürün genel amacı, optik ve elektron mikroskopi yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanarak kalsifikasyon olayının konumunu ve yapısını belirlemektir. Bu, hücre içi pH ve kalsiyum sinyallerine duyarlı floresan indikatörler kullanılarak tespit edilebilen ve kalsifikasyondan sorumlu yaşam evresi olan metamorfoz sırasında, canlı larval tüp solucanının izlenmesiyle gerçekleştirilir. Hücre içi pH görüntüleme, kalsifikasyon sürecinde sitoplazmaya giren ve sitoplazmadan çıkan proton konsantrasyonunu incelememize olanak tanır.Marine tüp solucanı larvalarında hücre içi pH görüntülemesine başlamak için, uygun yüzme yeteneğine sahip larvalar hücre içi pH gösterge boyası olan SNARF-1 AM ile boyanır. Larvalar daha sonra, ince bir cam gözlem penceresine sahip ve deniz suyu içeren IBMX dolu bir kaba aktarılır ve boya tarafından absorbe edilen 488 nanometre dalga boyundaki ışığa maruz kalacakları bir floresan mikroskoba yerleştirilir. Boyadan gelen 580 nanometre ve 640 nanometre emisyonlar toplanır. Hücre içi pH değerleri, bu değerlerin oranlarından hesaplanabilir.Optik mikroskopi, daha yüksek pH seviyesi ile ilişkili zamanı ve doku bölgesini belirlememize olanak tanır. Bu, daha ileri analizler için ilgilenilen zaman noktalarını belirlemenin ilk adımıdır. İkinci adımda, tüp solucanını elektron mikroskobisi için ilgili zaman noktalarında fiksatiflerle koruyun.Yeni mineralize olan bir yaşam evresi, kalsiyum sinyali için SEM-EDS haritalama kullanılarak tanımlanır. Ardından, yüksek kalsiyum sinyaline sahip bölgeler SEM/EBSD ile taranarak kristalin mineral varlığı belirlenir. Son olarak, odaklanmış iyon demeti kullanılarak mineral kesilip çıkarılır ve TEM gözlemi için ince bir kesit hazırlanır.Bu bölüm, seçili alan difraksiyon deseni elde etmek için kullanılır. Bu tekniğin veya geleneksel kütle X-ışını difraksiyon spektroskopisi gibi test yöntemlerinin temel avantajı, optik ve elektron mikroskopi yöntemleriyle gözlemlenmiş spesifik yapıların doğrudan gözlemlenmesini sağlamasıdır; böylece ayrı kalsifikasyon olayları hem zamansal hem de mekansal düzeylerde doğrudan incelenebilir. Kalsifikasyon, kalsiyum ve hücre içi pH belirteçleri ile çalışıldığında, bu ilgili fizyolojik olayların zaman ölçeği belirlenebilir.Numunenin doğru zamanda korunması, verimli bir SEM analizi için kritik öneme sahiptir. Biyolojik kalsifikasyonun ilk olayı araştırılırken, kalsiyumun elementel dağılımını taramak için SEM/EDX kullanılabilir. Kalsiyum miktarının daha fazla olduğu bir konum, kalsiyum karbonat varlığına işaret edebilir; ancak, kristal bir yapının mevcut olduğunu yalnızca bir X-ışını kırınımı deseniyle onaylamak mümkündür.Bu tür bilgiler EBSD ve TEM kullanılarak elde edilebilir. Elektron geri saçılma kırınımı, mikro yapı ve elektron REM açısı Bragg kırınım koşulunu sağladığı sürece, kristal veya polikristal malzemeleri tanımlamak için kullanılan bir kristalografik karakterizasyon tekniğidir. Tipik olarak, geri saçılan elektronlar, tane veya kristal yönelim haritaları içeren cilalanmış bir numune üzerinde 70 derecelik bir eğim açısıyla toplanır.Parlatılmamış bir numune için, bu tür düzensiz yüzeylerden böyle bir harita oluşturmak zordur çünkü tüm yüzey serileri EBSD açı gereksinimlerini karşılamaz. Bununla birlikte, EBSD açı gereksinimi karşılandığı sürece, nokta IG formunda bu düzensiz yüzeylerden hala bir Cacucci kırınım deseni toplanabilir. Cacucci kırınım deseni, kristalin mineralin mevcut olduğunun kesin onayını sağlar.Yöntemimiz doğrudan ve hızlıdır ve diğer mineralize dokulara da uygulanabilir. Burada, bir TEM kesiti hazırlamanın oldukça doğrudan bir yöntemi olan mikroörnek üretmek için odaklanmış iyon demeti kullanılmıştır. Metamorfoz sürecini incelemek için boru solucanları laboratuvarda yaklaşık beş gün boyunca kültüre edilmiştir.Yetkin larvalar, dairesel hareket yerine ileriye doğru yüzeceklerdir. Bu, metamorfoza hazır oldukları anlamına gelir. Yetkin larvaları deniz suyundaki floresan çözeltide inkübe edin, fotoblancışı önlemek için kapları folyo ile kapatın ve hayvanları gece boyunca inkübe edin.Tüp solucanı larvaları, larvaları tutacak ancak solüsyonun geçmesine izin verecek olan naylon ağa karşı yıkanır. Fazla boya solüsyonunu uzaklaştırmak için larvalar filtrelenmiş deniz suyu ile iki kez yıkanır. Yıkama solüsyonunu atmadan önce, sızdırmaz bir mühür oluşturmak için süzgeç Petri kabına bastırılır ve ardından mühür serbest bırakılır.Larvaların kurumamasına dikkat edin. Ardından, 10 ila 20 larvanın her birini IBMX içeren ince, cam tabanlı bir kaba yerleştirin ve görüntüleme aşamasına kadar kabın üzerini kapatın. Sonrasında, floresan sinyallerini tespit etmek için uygun dikroik aynalara sahip uygun filtre küplerini yerleştirin.Canlı bir organizmadan görüntü almak için yeterince hızlı olacak şekilde perde hızını optimize edin. Ardından, Z-Stack seçeneğindeki optik kesit alma parametrelerini seçin, görüntüleme işleminin başlangıç ve bitiş konumlarını belirlemek için mikroskop tablasını yukarı ve aşağı hareket ettirin. Katmanlar arasına bir mikrometre mesafe ayarlayın.Görüntüleme işleminden sonra, tüm verileri gri tonlamalı TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Bu işlem, Dosya, Dışa Aktar seçilerek gerçekleştirilebilir. Dosya türlerinin TIF görüntüleri olarak göründüğünden emin olun, ardından Başlat'a tıklayın.Z-Yığın'ın her katmanındaki her kanala ait gri tonlamalı görüntüler, görüntü analizi için hazır halde aynı görüntü klasöründe yer alacaktır. Son olarak, ImageJ kullanarak floresan kanallarının her biri için kompozit bir görüntü oluşturun. Aşağıdaki JoVE videoları, hücre içi pH için kalibrasyon ve ölçümlerin nasıl yapılacağını göstermektedir.Metamorfoz geçiren boru solucanlarını, deniz suyunda %4 paraformaldehit içeren bir çözelti kullanarak çapraz bağlayıcı bir fiksatif ile koruyun. Bir birim %16 paraformaldehidi üç birim deniz suyu ile karıştırmanız ve fiksasyonun gece boyunca gerçekleşmesini sağlamanız yeterlidir. Birincil fiksatifi atın ve doku yapılarını daha fazla stabilize etmek için örneği %1 osmiyum tetroksit sulu çözeltisinde 30 dakika boyunca yeniden fikse edin.Çeker ocak altında çalıştığınızdan ve net bir şekilde etiketlenmiş ayrı atık şişelerinizin bulunduğundan emin olun; formaldehitleri ve osmiyum tetraoksiti hazırlayın. Ardından, değişimler arasında beş dakika bekleyerek, örnekleri kademeli bir etanol serisi kullanarak dehidre edin. Bir sonraki adım, örnekleri, numuneyi örtecek miktarda 1:1 oranında etanol ve HMDS çözeltisi ile dehidre etmektir.Numunenin çeker ocak içerisinde tamamen kuruması için bekleyin, ardından işlemi saf HMDS ile tekrarlayın. Numunede kontrollü bir kırılma oluşturmak için, birkaç bireyi kapsayacak şekilde üçgen bir kesik yapmak üzere elmas bıçağı petri kabına doğru sürün. Petri kabının kapağı kapalıyken, kültür kabını bir alüminyum stub'a dayayın ve kontrollü bir kırılma oluşturmak için hafifçe bastırın.Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak gözlemleyin, içinde birkaç sağlam tüp solucanı bulunan bir kırık parçayı dikkatlice alın. Gümüş boya ile örneği SEM örnek tutucuya yapıştırın ve şarjlanmayı azaltmak için kenarlarını gümüş boya ile boyayın. Örnek artık SEM-EDS analizi için görüntülenmeye hazırdır.Numuneyi tutucuyla birlikte mikroskoba yerleştirin. Numuneyi yönlendirin ve elektron kolonunun altına yerleştirin. Numuneyi VP SEM modunda analiz edin.Gerektiği şekilde odaklamayı ve astigmatizmayı optimize edin. Tek bir organizmanın tüm görüş alanını dolduracağı bir büyütme seçin. Tüm görüş alanının bir haritasını çıkartarak örnek üzerindeki kalsiyumun elementel dağılımını analiz edin; haritalamayı 15 dakika veya daha uzun süre ya da veriler organizma içinde belirgin bir kalsiyum lokalizasyonu gösterene kadar çalıştırın.Bir ilgi bölgesinin nokta kantifikasyonunu elde etmek için Tek Nokta aracını kullanarak Nokta Kimliği seçeneğini seçin. Bir tarama gerçekleştirmek için ilgi duyulan alanın üzerine tıklayın. Azalan büyütmelerle bir dizi görüntü yakalayarak konumu dikkatlice kaydedin.Numuneleri EBSD için hazırlamak amacıyla, numuneyi düz SEM tutucudan çıkarın ve gümüş boya kullanarak 45 derece ön eğimli bir stub'a yapıştırın. Referans SEM görüntülerini kullanarak ilgili hayvanı ve hayvanın incelenecek olan tam bölgesini belirleyin. Numune yüzeyi elektron demetine yaklaşık 70 derece açı yapacak şekilde sahneyi 25 derece eğin.Sahneyi yükseltin. AZtec yazılımında EBSD modunu seçin. İlgi duyulan fazlar olarak aragoniti seçin.EBSD kamerasını yerleştirin, yaklaşık %90'lık bir sinyal elde etmek için kamera koşullarını ayarlayın. Hızlı bir huzme taraması (beam raster) kullanarak bir arka plan alın, ardından Aztec'te bir görüntü yakalayın. Spot Analizi aracunu kullanarak numunenin daha yüksek kalsiyum sinyali gösteren konumuna tıklayın. Cacucci desenlerinin tespit edilip edilmediğini görmek için tarama yapın.Eğer desenler mevcutsa ve veritabanındaki seçilen fazlardan herhangi biriyle eşleşirse, otomatik olarak indeksleneceklerdir. Odaklanmış iyon demeti kullanılarak mikro örnek hazırlama aşamasına geçmeden önce, hazırlanan SEM numunesini püskürtmeli kaplama yoluyla bir platin tabakası ile koruyun. Numuneyi FIB SEM haznesine yerleştirin, numuneyi konumlandırın ve canlı, iyon kaynaklı ikincil elektron görüntüsünü elde edin.EBSD'deki EDS haritalaması ile önceden belirlenmiş olan referans görüntülerdeki ilgi alanını bulun. İlgi çeken özelliklerin pencere çerçevesiyle aynı hizaya gelmesi için tabla gerektirdiği şekilde döndürün, ilgi çekici özellikleri kapsayacak şekilde büyütmeyi ayarlayın ve ardından karbon ve tungsten biriktirmek için bir kutu tanımlayın. Bir FIB görüntüsü yakalayın, ardından mikro örnekleme konumunu belirlemek için tungsten başlığının etrafına dört kutudan oluşan bir desen çizin.Ardından sahneyi 58 dereceye eğin ve mikro numunenin alt kısmından kesin. Sahneyi tekrar sıfır dereceye getirin, tungsten mikro numune alma probunu yerleştirin ve numuneyle temas edene kadar indirin. Probun ucu ile tungsten kaplama arasına tungsten biriktirerek tungsten probu ve numuneyi birbirine bağlayın, ardından son kesimi yapın, mikro numuneyi adanın geri kalanından ayırın ve mikro numunenin takılı olduğu probu yukarı kaldırın.Bir TEM bakır yarı ızgarayı yan girişli tutucuya yerleştirin, mikro örnek TEM ızgarasına temas edene kadar tungsten probu indirin. Mikro örnek, elektron şeffaflığı oluşana kadar daha fazla frezelenir. TEM analizinden önce, her iki dewari sıvı azotla doldurun ve hızlandırma voltajını 300 kilovolt olarak ayarlayın.Lamellerin takılı olduğu yarım ızgarayı standart TEM tutucusuna yerleştirin. Demeti fosfor ekran üzerinde merkezleyin; demeti daraltıp genişleterek tüm demet hareketinin eş merkezli olduğundan emin olun. Örnekle hizalanmak ve onu bulmak için sahne hareket düğmelerini kullanın, örnek üzerindeki büyütmeyi artırın ve örnek odaklanana kadar Z-Yüksekliği ayarlayın.Gerektiğinde optik okülerleri kullanın. Kamerayı yerleştirin ve fosfor ekranı çıkarın. Kameranın aşırı doyuma ulaşmasını önlemek için ışını gerektiği şekilde genişletin.Bir görüntü yakalamak için odağı ve kamera parametrelerini ayarlayın. Bir difraksiyon deseni elde etmek için ilgili alanı merkezleyin, objektif diyaframını çıkarın ve difraksiyon diyaframını yerleştirin. Difraksiyon Lens moduna geçin.Kırınım deseninin merkezinin kamerayı veya fosfor ekranı yakmasını önlemek için boşluk doldurucuyu yerleştirin. Kristalografik analiz için desenin bir görüntüsünü yakalayın. Aşağıdakiler, tüp solucanının metamorfozu sırasında gerçekleşen kireçlenme sürecine dair bazı gözlemlerdir.IBMX ile metamorfoz stimülasyonu sonrası tüp solucanlarının pH değerleri artmış ve hücre içi pH, 31. saatte sekizin üzerine çıkmaya başlamıştır. Kalsifikasyonla ilgili doku, kolye bölgesidir. SEM-EDS sinyalleri üzerindeki bir harita, birinci gündeki tüp solucanının homojen bir kalsiyum dağılımına sahip olduğunu ve bunun da kalsifikasyon sürecinin henüz başlamadığını göstermektedir.Metamorfoz stimülasyonundan iki gün sonra, bazı tüp solucanları zaten çok fazla kalsifiye olmuştu ve yeni kalsifiye olan materyallerin gözlemlenmesi için artık uygun değillerdi. Bu örnekte kullanılan örneğe benzer bir tüp solucanı örneğinde kalsifikasyon hala erken aşamadadır, bu nedenle kalsiyum miktar tayini, minerallerin varlığını karakterize etmek için ilgi çekici bölgenin belirlenmesine yardımcı olmuştur. SEM-EBSD kullanılarak incelendiğinde, güçlü kalsiyum sinyaline sahip lokalize bölgenin aynı zamanda aragonitten oluşan kristal bir yapıya sahip olduğu görülmüştür.Odaklanmış iyon demeti kullanılarak numune TEM için hazırlandı ve aragonit mineralinden elde edilen kırınım deseni daha ayrıntılı kristalografik olarak analiz edildi. Bu videoyu izledikten sonra, çok hücreli bir organizmada mineralleşme olayının nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Optik ve elektron mikroskobu birlikte kullanıldığında, kalsifikasyon süreci hakkında yüksek düzeyde fizyolojik ve materyal bilgi edinebiliriz.

characterization-calcification-events-using-live-optical-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Görüntüleme tekniklerinin entegre bir takımdır Karayip mercan Montastraea annularis ve M. polip morfolojisi ve doku yapısını belirlemek için uygulanan olmuştur faveolata. Floresan, seri blok yüz ve iki foton odaklı lazer tarama mikroskopisi lobate yapısı, polip duvarlar ve tahmini chromatophore ve zooxanthellae yoğunluklarını ve dağılımlarını belirledik.

Modlu Optik Mikroskopi Yöntemleri Caribbean Reef Yapı Mercanlar içinde Polip Doku Morfoloji ve Yapı Göstermektedir

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu makalede, biz bireysel Worms özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

Burada, üç deniz omurgasız hayvanın microfocus X-ışını bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntülenmesi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu çalışmada örnek fiktasyon, boyama, montaj, tarama, görüntü yeniden yapılanma ve veri analizleri gibi adımlar açıklanmaktadır. Protokolün farklı örnekler için nasıl ayarlanacağı konusunda öneriler de sağlanmıştır.

Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Burada iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşime sahip serbestçe davranan Caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme için bir sistem bildirilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların nano ölçekli yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarını ve C. elegans'ın titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımlarını ölçmelerini sağlar.

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf), fotosistem II fotofizyolojisini ve birincil üretkenliği ölçmek için faydalı bir yöntemdir. Burada, küvet tipi FRRf kullanarak substrat zooplankton üzerindeki epizoik alglerin, Colacium sp.'nin PSII fotofizyolojisini ölçmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Kardiyovasküler hastalık dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler morbidite ve mortalite yüküne önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, floresan görüntüleme ile vasküler düz kas hücresi aracılı kalsiyum çökelmesini in vitro olarak ölçmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır.

In Vitro Kalsiyum Birikimini Ölçmek için Yarı Otomatik ve Tekrarlanabilir Biyolojik Tabanlı Bir Yöntem

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Keşfedin canlı ve elektron mikroskobu teknikleriyle Hydroides elegans deniz tüsolucanlarında kalsifikasyon olaylarının konum ve yapısını belirleme yöntemini. Bu teknik biyomineralizasyon süreçlerini anlamaya yardımcı olur.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet