Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, optik ve elektron mikroskobu yöntemlerinin bir kombinasyonunu gerçekleştirerek kalsifikasyon olayının yerini ve yapısını belirlemektir. Bu, hücre içi pH ve kalsiyum sinyallerine duyarlı floresan göstergeler kullanılarak tespit edilebilen kalsifikasyondan sorumlu yaşam aşaması olan metamorfoz sırasında canlı larva tüp solucanının izlenmesiyle gerçekleştirilir. Hücre içi pH görüntüleme, kalsifikasyon sürecinde sitoplazmanın içine ve dışına proton konsantrasyonunu incelememizi sağlar.

Başlamak için, deniz tüpü solucanı larvalarında hücre içi pH görüntüleme, yetkin yüzme larvaları hücre içi pH indikatör boyası SNARF-1 ile boyanır. Larvalar daha sonra ince bir cam gözlem penceresi ile deniz suyu içeren bir IBMX kabına aktarılır ve bir floresan mikroskoba yerleştirilir, burada boya tarafından emilen dalga boyunda 488 nanometre ışıkla vurulurlar. Boyadan 580 nanometre ve 640 nanometre emisyon toplanır. Hücre içi pH değerleri, bu değerlerin oranlarından hesaplanabilir.

Optik mikroskopi, daha yüksek bir pH seviyesi ile ilişkili zaman ve doku bölgesini tanımlamamızı sağlar. Bu, daha fazla analiz için ilgi çekici zaman noktalarını belirlemenin ilk adımıdır. İkinci adımda, elektron mikroskobu için ilgili zaman noktalarında tüp solucanını fiksatiflerle koruyun.

Kalsiyum sinyali için SEM-EDS haritalaması kullanılarak yeni mineralize edici bir yaşam evresi tanımlanır. Daha sonra yüksek kalsiyum sinyaline sahip bölgeler, kristalin mineralin varlığını belirlemek için SEM / EBSD kullanılarak taranır. Son olarak, odaklanmış bir iyon demeti kullanılarak mineral kesilir, TEM gözlemi için ince bir kesit hazırlanır.

Bu bölüm, seçici bir alan kırınım modeli elde etmek için kullanılır. Bu tekniğin veya toplu X-ışını kırınım spektroskopisi gibi geleneksel bir test yönteminin temel avantajı, optik ve elektron mikroskobu yöntemleriyle gözlemlenen belirli yapıların doğrudan gözlemlenmesini sağlamasıdır, bu nedenle ayrık kalsifikasyon olayları hem zamansal hem de mekansal seviyelerde doğrudan incelenebilir. Kalsifikasyon kalsiyum ve hücre içi pH indikatörleri ile incelendiğinde, bu ilgili fizyolojik olayların zaman ölçeğini belirleyebiliriz.

Numunenin doğru zamanda korunması, verimli bir SEM analizi için kritik öneme sahiptir. Biyolojik kalsifikasyonun ilk olayını ararken, SEM/EDX, kalsiyumun elementel dağılımını taramak için kullanılabilir. Daha fazla kalsiyum içeren bir yer, kalsiyum karbonatın varlığını gösterebilir, ancak yalnızca bir X-ışını kırınım modelinin varlığı, kristal bir yapı olduğunu doğrulayabilir.

Bu tür bilgiler EBSD ve TEM kullanılarak elde edilebilir. Elektron geri saçılma kırınımı, mikro yapı ve elektron REM açısı Bragg kırınım koşulunu karşıladığı sürece, kristal veya polikristal malzemeyi tanımlamak için kristalografik bir karakterizasyon tekniğidir. Tipik olarak, geri saçılan elektronlar, tahıl veya kristal oryantasyon haritaları ile cilalı bir numune üzerinde 70 derecelik bir eğimle toplanır.

Cilalanmamış bir numune için bu pürüzlü yüzeylerden böyle bir harita oluşturmak zordur, çünkü tüm servis serileri EBSD açı gereksinimlerini karşılamaz. Bununla birlikte, IG noktası biçiminde, EBSD açısı gereksinimi karşılandığı sürece, bu düz olmayan yüzeylerden bir Cacucci kırınım modeli hala toplanabilir. Cacucci kırınım modeli, kristalin mineralin mevcut olduğuna dair kesin bir onay sağlar.

Yöntemimiz doğrudan ve hızlıdır ve diğer mineralize dokulara da uygulanabilir. Burada, bir mikro numune üretmek için odaklanmış bir iyon ışını kullanılır, bu aynı zamanda bir TEM kesiti hazırlamak için çok doğrudan bir yöntemdir. Metamorfoz sürecini incelemek için, tüp solucanları laboratuvarda yaklaşık beş gün boyunca kültürlendi.

Yetkili larvalar dairesel bir hareket yerine ileri yönde yüzeceklerdir. Bu, metamorfoza hazır oldukları anlamına gelir. Yetkin larvaları deniz suyundaki floresan solüsyonda kuluçkaya yatırın, foto ağartmayı önlemek için kapları folyo ile örtün ve hayvanları gece boyunca kuluçkaya yatırın.

Tüp kurdu larvaları, larvaları tutacak ancak çözeltinin geçmesine izin verecek naylon ağa karşı yıkanır. Fazla boya çözeltisini çıkarmak için larvaları filtrelenmiş deniz suyuyla iki kez yıkayın. Yıkama solüsyonunu atmak için contayı serbest bırakmadan önce sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için süzgeci Petri kabına bastırın.

Larvaları kurutmamaya özen gösterin. Daha sonra 10 ila 20 larvanın her birini IBMX ile ince, cam tabanlı bir tabağa koyun ve görüntülemeye kadar tabağı örtün. Ardından, floresan sinyallerini algılamak için uygun filtre küplerini uygun dikroik aynalarla yerleştirin.

Enstantane süresini, canlı bir organizma için görüntü yakalayacak kadar hızlı olacak şekilde optimize edin. Ardından, Z-Stack seçeneğinde optik kesit parametrelerini seçin, görüntü alımının başlangıç ve bitiş konumunu tanımlamak için mikroskobik aşamayı yukarı ve aşağı hareket ettirin. Katmanlar arasında bir mikrometre mesafe ayarlayın.

Görüntülemeden sonra, tüm verileri gri tonlamalı TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Bu, Dosya, Dışa Aktar seçilerek gerçekleştirilebilir. Dosya türlerinin TIF görüntüleri olarak göründüğünden emin olun ve ardından Başlat'ı tıklayın.

Her kanaldaki, Z-Stack'in her katmanındaki gri tonlamalı görüntü, görüntü analizi için hazır olan aynı görüntü klasöründe olacaktır. Son olarak, ImageJ kullanarak floresan kanalların her biri için bileşik bir görüntü oluşturun. Aşağıdaki JoVE videoları, hücre içi pH için kalibrasyon ve ölçümlerin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Deniz suyunda% 4'lük bir paraformaldehit çözeltisi kullanarak, çapraz bağlama fiksatifi kullanarak metamorfoz geçiren tüp kurtlarını koruyun. %16'lık paraformaldehitin bir kısmını üç kısım deniz suyuna karıştırın ve fiksasyonun gece boyunca gerçekleşmesine izin verin. Birincil fiksatifi atın ve doku yapılarını daha da stabilize etmek için numuneyi 30 dakika boyunca sulu %1 osmiyum tetraoksit çözeltisi içinde yeniden sabitleyin.

Çeker ocakta çalıştığınızdan ve açıkça etiketlenmiş ayrı atık şişelerine sahip olduğunuzdan emin olun, formaldehitler ve osmiyum tetraoksit hazırlayın. Daha sonra, kademeli bir etanol serisi kullanarak numuneleri kurutun ve değişiklikler arasında beş dakika bekleyin. Bir sonraki adım, numuneleri, numuneyi kaplayacak kadar 1:1 etanol ve HMDS çözeltisi ile kurutmaktır.

Numunenin çeker ocakta kurumasını bekleyin, ardından prosedürü saf HMDS ile tekrarlayın. Numunenin kontrollü bir şekilde kırılmasını sağlamak için, elmas bıçağı tabağa doğru çalıştırın ve üçgen bir kesim yapmak için birkaç kişiyi çevreleyin. Petri kabı kapalıyken, kültür kabını bir alüminyum saplamaya yerleştirin, kontrollü bir kırık yapmak için hafifçe bastırın.

Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak gözlemleyin, birkaç sağlam tüp solucanı içeren bir kırık parçasını dikkatlice alın. Gümüş boya ile numuneyi SEM numune tutucusuna yapıştırın, şarjı azaltmak için kenarları gümüş boya ile boyayın. Numune artık SEM-EDS analizi için görüntülenmeye hazırdır.

Numuneyi tutucuya mikroskobun içine yerleştirin. Numuneyi yönlendirin ve numuneyi elektron sütununun altına yerleştirin. Örneği VP SEM modunda analiz edin.

Odaklanmayı ve astigmatizmayı gerektiği gibi optimize edin. Büyütmeyi, tek bir organizma tüm görüş alanını dolduracak şekilde seçin. Tüm görüş alanının bir haritasını elde ederek numune üzerindeki kalsiyumun elementel dağılımını analiz edin, haritayı 15 dakika veya daha uzun süre veya veriler organizma içinde kalsiyumun belirgin lokalizasyonunu gösterene kadar çalıştırın.

İlgilenilen bir bölge için nokta ölçümü elde etmek için, Tek Nokta aracını kullanarak Nokta Kimliği seçeneğini belirleyin. Tarama yapmak için ilgili alana tıklayın. Azalan büyütme oranlarına sahip bir dizi görüntü yakalayarak konumu dikkatli bir şekilde kaydedin.

Numuneleri EBSD'ye hazırlamak için, numuneyi düz SEM tutucusundan çıkarın ve gümüş boya kullanarak 45 derece önceden eğilmiş bir saplamaya yapıştırın. Referans SEM görüntülerini kullanarak, ilgilenilen hayvanı ve incelenecek hayvanın tam bölgesini bulun. Numune yüzeyi şimdi elektron ışınına yaklaşık 70 derece olacak şekilde sahneyi 25 derece eğin.

Sahneyi yükseltin. AZtec yazılımında EBSD modunu seçin. İlgilenilen aşamalar olarak aragoniti seçin.

EBSD kamerayı takın, kamera koşullarını yaklaşık %90'lık bir sinyal elde edecek şekilde ayarlayın Hızlı ışınlı bir raster kullanarak, bir arka plan elde edin, ardından Aztek'te bir görüntü yakalayın. Nokta Analizi aracını kullanarak, daha yüksek bir kalsiyum sinyali gösteren numunenin konumuna tıklayın. Cacucci desenlerinin algılanıp algılanmadığını görmek için tarayın.

Desenler varsa ve veritabanında seçilen aşamalardan herhangi biriyle eşleşirse, bunlar otomatik olarak dizine eklenir. Odaklanmış iyon ışını kullanarak mikro numune hazırlamaya geçmeden önce hazırlanan SEM numunesini püskürtme kaplaması ile platin tabakası ile koruyun. Numuneyi FIB SEM odasına yerleştirin, numuneyi konumlandırın ve canlı, iyon kaynaklı bir ikincil elektron görüntüsü elde edin.

EBSD'de EDS eşlemesi ile daha önce belirlenen referans verilen görüntülerden ilgi alanını bulun. İlgilenilen özellikleri pencerenin çerçevesiyle aynı hizada elde etmek için sahneyi gerektiği gibi döndürün, ilgilenilen özellikleri barındıracak alanı göstermek için büyütmeyi ayarlayın, ardından karbon ve tungsten biriktirmek için bir kutu tanımlayın. Bir FIB anlık görüntüsü yakalayın, ardından mikro örneklemenin konumunu tanımlamak için tungsten kapağının etrafına dört kutudan oluşan bir desen çizin.

Ardından sahneyi 58 derece eğin ve mikro numunenin altını kesin. Sahneyi tekrar sıfıra eğin, tungsten mikro örnekleme probunu yerleştirin, ardından numuneye temas edene kadar indirin. Probun ucu ile tungsten kaplama arasına tungsten bırakarak tungsten probunu ve numuneyi bağlayın, ardından son kesimi yapın, mikro numuneyi adanın geri kalanından ayırın ve probu ekli mikronumune ile kaldırın.

Bir yan giriş tutucusuna bir TEM bakır yarım ızgara yerleştirin, mikro numune TEM ızgarasına temas edene kadar tungsten probunu indirin. Mikronumune, elektron şeffaf hale gelene kadar daha fazla öğütülür. TEM analizinden önce, her iki dewarı da sıvı nitrojen ile doldurun ve hızlanma voltajını 300 kilovolta ayarlayın.

Takılı lamelli yarım ızgarayı standart TEM tutucusuna yerleştirin. Işını fosfor ekran üzerinde ortalayın, ışını daraltın ve genişletin ve tüm ışın hareketinin eş merkezli olduğundan emin olun. S'yi kullanıntage hareket düğmeleri Numunede gezinmek ve yerini bulmak, numune üzerindeki büyütmeyi artırın ve numune odakta olana kadar Z-Yüksekliğini ayarlayın.

Optik göz merceklerini gerektiği gibi kullanın. Kamerayı takın ve fosfor ekranı çıkarın. Kameranın aşırı doygunluğunu önlemek için ışını gerektiği gibi genişletin.

Bir görüntü yakalamak için odağı ve kamera parametrelerini ayarlayın. Bir kırınım deseni elde etmek için, ilgilenilen özelliği ortalayın, objektif açıklığı çıkarın ve kırınım açıklığını yerleştirin. Kırınım Lensi moduna geçin.

Kırınım deseninin merkezinin kamerayı veya fosfor ekranını yakmasını önlemek için körelticiyi yerleştirin. Kristalografik analiz için desenin bir görüntüsünü yakalayın. Aşağıdakiler, tüp solucanının metamorfozu sırasında kalsifikasyon sürecinin bazı gözlemleridir.

Tüp kurtlarının pH değerleri, metamorfozun IBMX stimülasyonundan sonra artmış ve hücre içi pH 31 saatte sekizin üzerine çıkmaya başlamıştır. Kireçlenme ile ilgili doku yaka bölgesidir. SEM-EDS sinyalleri üzerindeki bir harita, bir gün tüp solucanının homojen bir kalsiyum dağılımına sahip olduğunu ve kalsifikasyon sürecinin henüz başlamadığını göstermektedir.

Metamorfoz stimülasyonundan iki gün sonra, bazı tüp solucanları zaten çok fazla kalsifiye olmuştu ve artık yeni kalsifiye olmuş materyalleri gözlemlemek için uygun değillerdi. Bu örnekte kullanılana benzer bir tüp kurdu örneğinde, kalsifikasyon hala erken aşamasındadır, bu nedenle kalsiyum miktarı, minerallerin varlığını karakterize etmek için ilgilenilen yerin belirlenmesine yardımcı olmuştur. SEM-EBSD kullanılarak incelendiğinde, güçlü kalsiyum sinyaline sahip lokalize alan da kristalin bir aragonit yapısına sahipti.

Odaklanmış iyon demeti kullanılarak, numune TEM için hazırlandı ve aragonit mineralinden gelen kırınım modeli daha büyük kristalografik ayrıntılarla analiz edildi. Bu videoyu izledikten sonra, çok hücreli bir organizmada bir mineralizasyon olayının nasıl bulunacağını iyi anlamış olmalısınız. Optik ve elektron mikroskobu birlikte kullanıldığında, kalsifikasyon süreci hakkında büyük düzeyde fizyolojik ve maddi bir anlayış elde edebiliriz.