Multimodal Görüntüleme ve Non-invaziv için Spektroskopisi Fiber paket Mikroendoskopi Platformu,

Bu prosedürün genel amacı, yüksek çözünürlüklü yapısal bilgileri kantitatif spektral verilerle birleştirerek in vivo dokunun fonksiyonel karakterizasyonunu gerçekleştirmektir. Bu yöntem, terapinin doku mikro yapısı ve perfüzyon üzerindeki etkilerinin nicelleştirilmesi gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı konumdan hem görüntüleme hem de spektroskopi verilerini toplamak için tek bir probun kullanılabilmesidir.

Probun geleneksel endoskopi teknikleriyle uyumlu olması nedeniyle, bu tekniğin etkileri gastrointestinal kanser tedavisine kadar uzanmaktadır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü prob yerleşimindeki küçük düzensizlikler veri doğruluğunu önemli ölçüde etkileyebilir. Bu yöntem için ilk fikri, yüksek çözünürlüklü bir görüntüleme tekniği ile kantitatif bir spektroskopi yöntemini birleştirmenin önemini fark ettiğimizde edindik.

Hem kurulumun hem de kalibrasyonun karmaşıklığı nedeniyle hazırlık adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görselle gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Multimodal mikro endoskobun yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi modülünü monte etmeye başlamak için, 30 mm'lik bir kafes küpün içine 470 nanometrelik bir dikroik ayna yerleştirin. Kafes kübün ön, sağ ve sol kenarlarına kafes montaj çubuklarını takın.

Gerilmesiz bir sabitleme halkasını dişli bir kafes plakasına takın ve bir lens tüpünü sabitleme halkasına vidalayın. Birinci kafes plakasıyla hizalı olacak şekilde başka bir kafes plakasını lens tüpüne takın. Ardından, UV etkili bir alüminyum aynayı dik açılı bir ayna tutucuya sabitleyin.

Dört adet çubuğu ayna tutucusunun önüne ve iki adet çubuğu tutucunun sağ tarafına çapraz olarak takın. Lens tüpü düzeneğini kafes küpün sol tarafına kaydırarak yerleştirin. Ayna tutucu düzeneğinin sağ tarafını lens tüpü düzeneğine bağlayın.

Z-ekseni taşıma düzeneğini düzeneğin sağ tarafına kaydırın. Taşıma düzeneğine 10x akromatik objektif lensini takın. Ardından, bir fiber adaptör plakasını XY-ekseni taşıma lens düzeneğine sabitleyin.

Bağlantı aparatını objektif lensinin önündeki düzeneğe kaydırın. Sabitleme halkalarını kullanarak, uygun bir uyarım filtresini ve emisyon filtresini lens tüplerine yerleştirip sabitleyin. Uyarım filtresi lens tüpünü kafes küpün önüne vidalayın.

Emisyon filtresi lens tüpünü, dik açılı ayna yuvasının önüne yerleştirin. Epoksi kullanarak, uyarım filtresinin önündeki kafes plakasına 455 nanometre LED'i sabitleyin. Her bir filtre lens tüpünün önüne bir kafes plakası kaydırın.

Bir sabitleme halkası kullanarak, lensin dış kısmındaki okun lens tüpünün dıştan dişli tarafına bakacak şekilde bir akromatik dublet tüp lensini başka bir lens tüpüne sabitleyin. Tüp lensini sol kafes plakasına takın ve tüp lensinin önüne başka bir kafes plakası yerleştirin. Gerilimsiz bir sabitleme halkası kullanarak, bir USB monokrom kamerayı kafes plakasına takın.

Alt-difüz yansıma spektroskopisi modalitesini monte etmeye başlamak için, dişli bir kafes plakayı epoksi ile bir tungsten halojen ışık kaynağının önüne sabitleyin. Kafes plakasına dört adet kafes montaj çubuğu yerleştirin ve bir Z-ekseni translasyon düzeneğini çubuklar üzerine kaydırarak takın. Z-ekseni translasyon düzeneğine 20x akromatik bir objektif lens vidalayın.

Bir fiber adaptör plakasını XY eksenli bir translasyon tutucuya bağlayın ve tutucuyu objektif lensinin önündeki düzeneğin üzerine kaydırın. Son olarak, her iki düzeneği uygun sabitleme cihazlarını kullanarak bir optik tabla üzerine birbirine yakın şekilde sabitleyin. Kaynak dedektör ayrım anahtarlama cihazını oluşturmaya başlamak için, dıştan dişli bir SMA fiber adaptör plakasını alüminyum bir motor koluna vidalayın.

Motor kolu adaptörünü motor kolunun arkasına takın. Ardından, bir step motoru alüminyum motor yuvasına vidalayın. Motor kolu düzeneğini motor miline vidalayın ve kilitleme vidasını sıkın.

Ardından, üç fiber adaptör plakasını bir optik anahtara vidalayın ve ardından ön paneli optik anahtara vidalayın. Step motor milini optik anahtarın merkez deliğinden geçirin. Lehim gerektirmeyen kırmızı bir devre kartının merkez hattı boyunca bir step motor sürücüsü yerleştirin.

Sürücüyü uygun bir güç kaynağına ve step motoruna bağlayın. Optik anahtarı optik masaya sabitleyin. Motor koluna 550 mikrometre 0,22 na'lik bir patch kablo takın.

Diğer ucu bir USB spektrometresine bağlayın. Fiber optik probu bağlamak için, merkezi 1 millimeter görüntüleme fiber kablosunu yüksek çözünürlüklü floresans mikroskopi modalite düzeneğine takın. Sol taraftaki 200 micrometer çok modlu kabloyu alt-difüz yansıma spektroskopisi modalite düzeneğine takın.

Soldan devam ederek, kalan çok modlu kabloları sırasıyla optik anahtarlama cihazının sol, orta ve sağ adaptörlerine bağlayın. Deney için kalibrasyona başlamak için tüm USB çevre birimlerini bilgisayara bağlayın. Tüm enstrümantasyonu açın ve tungsten halojen lamba kepenkinin açık olduğundan emin olun.

Ardından, oda ışıklarını kapatın ve diğer ortam ışığı kaynaklarını engelleyin. Veri toplama yazılımını açın. Kalibrasyona geçmeden önce ekipmanın 30 dakika boyunca çalışmasına izin verin.

%20 difüz yansıma standardını kalibrasyon cihazının alt bölümüne yerleştirin. Fiber optik probu cihazın sol yuvasına takın ve DS ayarı olarak 374 mikrometreyi seçmek için motorlu optik anahtarı sola getirin. Yazılımda, entegrasyon süresini 500 milisaniye olarak ayarlayın.

Ardından, bu SDS için RMAX kazanımını başlatmak üzere spektrumu al (acquire spectrum) düğmesine tıklayın. RMAX kazanımı tamamlandığında, spektrumu belirlenmiş bir klasöre kaydedin. Tungsten halojen lamba şalterini kapatın ve bu SDS için R karanlık spektrumunu alın.

Deklanşörü açın, probu kalibrasyon cihazındaki sağ yuvaya taşıyın ve motorlu optik anahtarı 730 mikrometre SDS ayarı için orta konuma getirin. Kalibrasyonu tamamlamak için bu SDS için RMAX ve RDARK değerlerini elde edin. İlk olarak, veri toplama için uygun cilt bölgesini belirleyin.

Pyranine kaynağı olarak sarı bir fosforlu kalem kullanarak, seçilen bölgeyi hafifçe boyayın. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobisine başlamak için 455 nanometrelik LED'i açın ve tungsten halojen lambanın panjurunu kapatın. Fiber optik probu cilde hafifçe temas edecek şekilde yerleştirin.

Apikal akım içgörü mimarisini görüntülemek için probu Pyranine ile boyanmış doku boyunca hareket ettirin. Yazılımda, görüntü doygunluğunu önlemek için uygun bir pozlama süresi ve kazanç (gain) ayarlayın. Ardından, statik bir görüntü elde etmek için görüntü yakala (acquire image) butonuna tıklayın.

Alt-difüzyon yansıma spektroskopisi için probu yerinde tutun. 455 nanometrelik LED'i kapatın ve tungsten halojen lamba panjurunu açın. Ardından, soldaki 374 mikrometre SDS ayarına geçiş yapın.

Bu SDS için R-doku spektrumunu elde etmek için spektrumları al'a tıklayın. Ardından, orta konuma geçin ve 730 mikrometrelik SDS R-doku spektrumunu elde edin. Art-işleme yazılımını açın ve çalıştır'a tıklayın.

İstendiğinde, doku görüntüsünü elde etmek için kalibrasyon spektrumlarını, in vivo spektrumları ve yüksek çözünürlüklü floresan görüntüyü seçin. Yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi modalitesi, doku bölgesinin odaklanmış ve yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü sağlar. Pyranine boyaması, tekil Keratinosit dış hatlarını gösterir.

Ardışık işlem yazılımı, hemoglobin konsantrasyonunu, melanin konsantrasyonunu ve doku oksijen satürasyonunu hesaplamak için alt-diffüz yansıma spektroskopisi verilerini kullanır. Bu multimodal mikro endoskop kullanılarak, iyi huylu bir melanositik nevüs komşu normal cilt dokusu ile karşılaştırılmıştır. Melanositik nevüs, normal dokuya kıyasla biraz daha düşük bir hemoglobin konsantrasyonu ve biraz daha yüksek bir melanin konsantrasyonu sergilemiştir.

Bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tungsten halojen lambanın 15 dakika boyunca ısınmasına izin verilmesi ve veri toplama öncesinde cihazın bir yansıma standardı ile kalibre edilmesi önemlidir. Bu prosedürün ardından, protein yapısındaki veya metabolizmadaki hücresel altı değişiklikleri incelemek için konfokal mikroskopi veya çok fotonlu mikroskopi gibi diğer teknikler kullanılabilir.

Bu teknik geliştirildikten sonra, araştırmacıların kemoterapiye yanıt olarak doku perfüzyonu ile mikroyapı arasındaki ilişkiyi keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hibrit bir mikro endoskopik görüntüleme ve spektroskopi cihazının nasıl kurulacağı ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.