Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu
17 Mayıs 2020
Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.
Bu protokol, çift floresan transgenik fare modelinde fare oküler yüzeyinin tüm yapısının canlı görüntülenmesi için çok filtreli bir mikroskop kullanır. Özel multifoton mikroskobik platform ve çift floresan transgenik farelerin birleşimi, göz yüzeyinin ve yapısının gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak sağlar. Multifoton mikroskobu kurmak için, su daldırma 20X, 1.00 NA hedefi seçin ve dik bir mikroskop üzerinde uyarma kaynağı olarak Titanyum Safir lazer ayarlayın.
Lazer çıkış dalga boyunu EGFP için 880 nanometreye, tdTomato için 940 nanometreye ayarlayın. SHG EGFP ve EGFP tdTomato ayrımı için iki dikroik ayna ekleyin ve 434-17, 510-84 ve 585-40 nanometre bant geçiş filtreleri kullanmak spectrally SHG EGFP ve tDTomato sinyalleri ayırmak için filtreler. Göz tutucuyu kurmak için, anestezili 8-12 haftalık farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra fareyi ısıtılan mikroskop aşamasına yerleştirin ve bir sıcaklık izleme probu yerleştirin.
Fareyi özel stereotaksik fare tutucuya yerleştirin ve harici işitsel meatus'a kulak çubukları takın. Baş tutucuyu sabitlemek ve göz yüzeyine %0,4 Oxybuprocaine Hidroklorür ve tuzlu çözelti uygulamak için üç nokta lı fiksasyon kullanın. PE tüp döngü ile beş numaralı Dumont forceps bir çift uçlarını kapatın.
Üç dakika sonra göz küresi çıkıntısını doğrulamak için manuel göz kapağı geri çekilmesi gerçekleştirin ve göz kapağı marjı boyunca oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için dikkatlice bir PE tutucu tüp halkayerleştirin. Ve forceps ile göz küresi stabilize etmek için tutucunun topu kullanın. Daha sonra kornea yüzeyini 1.338 kırılma indisi ile bir göz jeli ile kapatın.
Kornea yüzeyinin Z seri görüntülemesi için, hedefleme alanını görüntülemek ve mikroskop yazılımını açmak için cıvalı bir ışık kaynağı kullanın. Oküler yüzeydeki hücresel yapıyı görselleştirmek için uygun fotoğraf çarpanını ve dijital kazanımları seçin ve görüntü yığınının edinimi için ilk ve son slaytı ayarlayın. Görüntü çözünürlüğünü 512'ye 512 piksel, Z adımını ise bir mikrometreye ayarlayın.
Daha sonra, SHG EGFP sinyal koleksiyonu için 880 nanometre uyarma ile bir canlı görüntü elde Z seri görüntüleri toplamak için başlat'ı tıklatın ve her alanda EGFP tdTomato sinyal toplama için 940 nanometre uyarma bir canlı görüntü. Görüntü boyunca, tüm kornea yüzeyinde görüntüleme ye izin vermek için göz küresini döndürmek için step motorlu sahne tutucuyu kullanın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, Z seri görüntülerini Fiji'ye yükleyin ve Ortanca 3D filtre eklentisini seçin.
Arka plan gürültüsünü çıkardıktan sonra, görüntüleri keskinleştirmek için keskinleştirme maskesi filtresi paketi Fiji'yi seçin ve görüntülerin kalitesini otomatik olarak optimize etmek için otomatik parlaklık kontrastını tıklatın. İşlemden sonra, görüntüleri seri görüntü dizisi olarak kaydedin ve görüntü dizisini uygun bir 3D yeniden yapılandırma yazılımı programına aktarın. Tüm multifoton mikroskopi görüntülerinde, 3D yapı görüntülerini anlık görüntüyle yakalamadan önce egfp tdTomato ve SHG sinyallerini sırasıyla sözde yeşil, kırmızı ve zil şeklinde sunar.
Multifoton mikroskopi, çift floresan transgenik farelerin kornea epitelindeki yüzeysel Kanat ve Bazal hücrelerinin görüntülenmesine olanak sağlar. Bazal tabakadan tek hücreler yüzeysel tabaka yanı sıra tek altıgen şekilli yüzeysel hücrelereşlenebilir. TdTomato sinyalinin sitoplazmik ekspresyonu ile ortaya çıktığı gibi, golgi aparatı ve endoplazmik retikulum da dahil olmak üzere membran proteini zengin hücre içi vesiküler sistem kanat hücrelerinin içine dağılmış durumdadır.
Kollajen stroma içinde, stellat şekilli coratesites bu farelerde EGFP floresan hedefleyen membran tarafından özetlenmiştir. Kolej stroma gömülü coratesites daha gevşek endotel hücrelerinin içinde daha aralıklı. Buna ek olarak, kornea stroma içinde ince dallanma sinirler de membran tdTomato sinyalleri ve korneal endotel hücre monolayers hedefleyen tarafından görselleştirilmiş olabilir nispeten homojen altıgen şekil petekli desen bağlı göstermektedir.
Limbal epitel epitel epitel hücrelerinin bir ila iki tabakaoluşur. Çift floresan muhabir transgenik suşu da konjonktiva içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar, vasküler endotel özetleyen kılcal damarların 3D mimarisinin rekonstrüksiyonu kolaylaştıran. Yetersiz veya aşırı basınç görüntü kalitesini bozabilir gibi yaralanma olmadan orta basınç ile göz küresi stabilize etmek kaliteli görüntüler elde etmek için önemlidir.
Bu NVivo görüntü görüntüleme platformu oküler yüzey altında yapıların görselleştirilmesi için değiştirilebilir ve çeşitli oftalmik hastalıkların yerinde çalışmalara uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, çift floresan transgenik fare modeli kullanılarak fare oküler yüzeyinin canlı görüntülemesi için çok fotonlu bir mikroskobik platform sunmaktadır. Sistem, oküler yüzeydeki çeşitli hücresel yapıların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Oftalmoloji
- Mikroskopi
Arka Plan
- Çok fotonlu mikroskopi güçlü bir görüntüleme tekniğidir.
- Floresan transgenik fareler, hücresel bileşenlerin geliştirilmiş görselleştirilmesini sağlar.
- Oküler yüzey yapısının anlaşılması, çeşitli araştırma uygulamaları için kritik öneme sahiptir.
- Etiketsiz görüntüleme teknikleri, floresan yöntemleri tamamlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare oküler yüzeyinin canlı görüntülemesi için bir yöntem geliştirmek.
- Geliştirilmiş görselleştirme için özel bir çok fotonlu mikroskop kullanmak.
- Görüntülemede çift floresan transgenik farelerin yeteneklerini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Özel objektifler ve lazer ayarlarıyla bir çok fotonlu mikroskobun kurulumu.
- Sinyal ayrımı için dikroik aynaların ve bant geçiren filtrelerin kullanımı.
- Isıtmalı bir mikroskop tablası üzerinde anestezi uygulanmış farelerin canlı görüntülenmesi.
- Oküler yüzey yapılarının gerçek zamanlı görselleştirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Hücre çekirdeklerinin, membranların ve sinir liflerinin başarılı bir şekilde görüntülenmesi.
- İkinci harmonik üretimi kullanılarak stromal arkitektürlerin etiketsiz görüntülenmesi.
- Çok fotonlu platformun etkinliğinin gösterilmesi.
- Gerçek zamanlı görselleştirme yeteneklerinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Çok fotonlu mikroskobik platform, oküler görüntüleme için etkilidir.
- Çift floresan transgenik fareler, oküler yapıların görselleştirilmesini geliştirir.
- Bu yöntem, oküler biyoloji ve ilgili alanlardaki araştırmaları ileriye taşıyabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu çok fotonlu mikroskopi platformu, fare oküler yüzey yapılarının canlı ve etiketsiz görüntülenmesine olanak tanıyarak oftalmik ilaç keşfi için kornea ve konjonktival biyoloji hakkında kritik bilgiler sağlar. Hücresel dinamikleri, stromal mimariyi ve vasküler ağları in vivo olarak görselleştiren bu yöntem, oküler hastalıkların preklinik modellerinde terapötik hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Platformun tüm oküler yüzey boyunca hassas konumlandırma ile görüntüleme yapabilme yeteneği, hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerindeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı oküler dokudaki hücre çekirdeklerini, membranları, sinir liflerini ve kapillerleri görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: İkinci harmonik üretimi aracılığıyla stromal mimarinin ve çift floresan raporlayıcılar vasıtasıyla hücresel dinamiklerin gerçek zamanlı gözlemi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilişkili oküler modellerdeki yapısal ve hücresel değişikliklerin kantitatif ve tekrarlanabilir çıktılarını sağlayarak portföy önceliklendirmesini iyileştirir.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Epitelyal, stromal, endotelyal ve vasküler bölmelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Hassas Z-stack kazanımı, SHG ve floresan sinyallerinin spektral ayrımı ve stabilize edilmiş göz küresi konumlandırması aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Minimum fototoksisite ile tüm kornea ve konjonktiva yüzeyinde görüntülemeye olanak tanıyarak, tarama hazırlığını ve platformun yeniden kullanımını vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Konjonktivadaki 3B kapiller mimarinin yeniden yapılandırılmasını ve limbal epitel tabakalarının görüntülenmesini sağlayarak hastalıkla olan ilişkisini tartışır.
- Operasyonel Değer: Oküler yüzey bölgeleri genelinde doğru konumlandırma ile intravital görüntülemeyi destekleyerek, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Öngörücü Değer: Oküler patolojinin mekanistik anlayışını bilgilendiren etiketsiz stromal görüntüleme ve hücresel haritalama sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını ele alır.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, erken hedef doğrulamadan preklinik görüntülemeye kadar keşif sürekliliğine entegre edilerek, oftalmik araştırmalarda hipotez testlerini ve mekanistik risk azaltma çalışmalarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin, oküler yüzeydeki hücresel ve yapısal dinamiklerin canlı görüntülemesini sağlayarak hipotez test etmeyi, yolakların netleştirilmesini ve biyolojik risklerin azaltılmasını nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Z-serisi görüntüleme, spektral sinyal ayırımı ve stabilize edilmiş görüntüleme koşulları aracılığıyla assay hazırlığını, tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıları tanımlar.
- Analitikler: Kolajen mimarisi için SHG ve membran ile nükleer lokalizasyon için tdTomato/EGFP dahil olmak üzere, ekiplerin koşulları karşılaştırmasına yardımcı olan ölçümleri, okumaları veya istatistiksel çıktıları vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili modellerde kapillerlerin 3D rekonstrüksiyonunu ve epitelyal tabaka haritalamasını mümkün kılarak, yöntemi preklinik sürekliliğe veya biyobelirteç uyumuna bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi tek kullanımlık bir teknikten ziyade, çeşitli oftalmik hastalık modellerine ve görüntüleme son noktalarına uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güvenilirliği, hedef doğrulama, oküler yüzey biyolojisindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Özelleştirilmiş göz tutucu, stereotaksik konumlandırma ve kontrollü görüntüleme parametreleri aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Hedef etkileşiminin ve doku yanıtının erken görselleştirilmesine olanak tanıyarak daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Kornea ve konjonktival kompartmanlar genelinde kantitatif, etiketsiz ve floresan okumalar yoluyla risk ayarlı önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Çok fotonlu mikroskopi, oküler anatomi ve transgenik model kullanımı konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Titanyum safir lazer, dikroik aynalar, bant geçiren filtreler, motorlu tabla ve 3D rekonstrüksiyon yazılımı dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları.
- Görüntüleme protokolleri, sinyal algılama ayarları ve görüntü işleme süreçleri (örneğin, gürültü azaltma ve kontrast artırımı için Fiji eklentileri) için ekipler arası standartlaştırma gereksinimleri.
- Göz kapağı stabilizasyonunun ayarlanması, oküler yüzey kuplaj jeli ve farklı floresan raporlayıcılar için eksitasyon dalga boyları dahil olmak üzere model sistemler arası adaptasyon hususları.
- Kaynak materyal tarafından desteklenen pratik sınırlamalar: Yetersiz veya aşırı basınç görüntü kalitesini bozduğundan, göz küresinin yaralanmaya yol açmadan orta düzeyde basınçla stabilize edilmesi kritiktir.
