Name: Diş Kompozit Cytocompatibility Değerlendirme Verimli Yöntemi olarak Confocal Time Lapse Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, diş kompozitlerinin sitouyumluluğunu 3D konfokal mikroskopi ile zaman atlamalı görüntüleme yöntemiyle değerlendirin. Canlı hücre davranışlarını gerçek zamanlı izleyerek toksisite analizi yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Saremco Dental Switzerland ve Olympus Microsystems France Şirketleri, finansal destekleri için minnettarlıkla teşekkür ederiz. Saremco Dental, dental kompozitler ELS ekstra düşük büzülme ile ilgili cömert bağışları için de takdir edilmektedir. Yazarlar ayrıca, Kimya Bölümü'nden (University College London) Dr. Simon Banks'e İngilizce revizyon konusundaki yardımları için takdirlerini ifade etmek isterler.

Protokol, üç ana adımdan oluşur: ilk adım kültür ortamı kompozit özü hazırlanmasını içerir; İkincisi ise birincil GF&#39;lerinin (HGF), hücre kültürü, kompozit özleri ve hücre boyama ile hücreler temas; Üçüncü adım konfokal görüntüleme ve flüoresan sinyal analiz oluşur. Dişeti dokuları almak için, protokol Fransız mevzuatında, aydınlatılmış onam ve yerel etik kurul uygun kabul edildi. 1. Kompozit ayıklar Hazırlık Elüsyon maddesi olarak Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) kullanın. Örneklerinin yüzey alanı ve ekstraksiyon ortamının hacmi arasındaki oran, ISO 10993/12 gereksinimleri en düşük seviyede olduğundan emin olun. Prosedür son 11 tarif ve aşağıda kısaca özetlenmiştir: <ol><li> Bir ısmarlama tutun kullanarak sertleşmemiş diş kompozit küresel numunelerini oluşturmaker. Tutucu boyutu oral klinik tedavisinde genel olarak tavsiye sertleştirme derinliğine bağlı olarak bir yarıçapı 2 mm.&#39;dir. </li><li> Plaka kuyuları hazırlayın,% 5 penisilin / streptomisin ve amfoterisin karışımı% 1 ile cenin sığır serumu (FBS) olmayan bir kültür ortamı, her biri 1 mi (DMEM). </li><li> 40 saniye için 1.070 mW cm-2 yoğunluğunun (λ = 465-475 nm), bir LED ışık lambası kullanılarak de ihtiva eden DMEM ortamı içinde tedavi örnekleri. Sertleştirme ucu ve numuneler arasındaki mesafe 0.5 mm aralığı içinde olduğundan emin olun. Diş ve iyileşmemişken diş kompozit arasındaki geçici temas simüle etmek için bu kür modu kullanın. Onar bileşik ve ağız boşluğuna yerleştirildiği zaman, klinik durumda, temas halinde. </li><li> Hava içinde% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında 37 ° C&#39;de örnekleri (DMEM ortamında kompozit numuneler) inkübe edin. Aynı koşullarda kontrol hücreleri için (bileşik örnekleri olmadan) DMEM ortamı inkübe edin. </li></ol> 2. HGF Hücre Kültürü, Kompozit ayıklar Test ve Hücreler Boyama <ol><li> Büyüme ve hücre kültürlerinin bakımı Rutin ortodontik çekimi sırasında çekilen hastaların sağlıklı dişeti doku biyopsileri insan dişeti fibroblastlar izole. <ol><li> % 10 FBS varlığında DMEM GF&#39;lerinin yetiştirmek, 5% I Penisilin / Streptomisin ve% 1 amfoterisin B hava içinde% 5 CO2 gibi nemli bir atmosfer altında bir inkübatörde 37 ° C&#39;de hücreler koruyun. </li><li> Değişen ortam 3 günde, ve geçit hücreleri her 5 gün. Tripsinizasyonla konfluense, hasat hücreleri ulaştıktan sonra. </li><li> 5 dakika boyunca 90 x g&#39;de santrifüjleyin hücreler, kültür ortamı içine yeniden askıya. Bir asa el otomatik hücre sayıcı ile hücre sayın. </li><li> Bir bölme kaydırma sisteminde, 2.5 x 10 4 hücre / ml&#39;lik bir hücre yoğunluğunda, tohum hücre süspansiyonu. % 5 atmosferinde, gece boyunca 37 ° C&#39;de hücre inkübasyon izin verin. </li></ol></li><li> Kültür içindeki hücrelere bileşik ekstrelerinin ilavesi <ol><li> (Kuluçkadan 24 saat sonra), test edilen bileşik özlerinin 1 ml slaytı iki kuyu ortamı değiştirin. </li><li> Aynı koşullar altında kalan iki kuyu (kontrol hücreleri) koruyun. </li><li> Hava içinde% 5 CO2 &#39;nin nemlendirilmiş bir atmosferi altında, bir inkübatörde 37 ° C&#39;de dört kuyu içeren odanın slayt inkübe edin. </li></ol></li><li> Florasanla lekelenmesi Üreticinin talimatlarına uygun olarak ökaryotik hücreler için Canlı / Ölü sitotoksiklik leke kullanın. Not: kitin, plazma zan bütünlüğü ve esteraz etkinliği dayalı bir popülasyonda hücrelerin yaşama kabiliyetinin saptanması için hızlı bir iki-renkli floresan deneyi sağlar. Leke membranın hücre içi esteraz aktivitesi ve kırmızı-floresan Ethidium homodimeri-1 (EthD-1) belirtmek için kaybını göstermek için aynı anda yeşil floresan Kalsein-AM ile etiketleyerek hasarlı hücrelerin canlı ayırte bütünlüğü. <ol><li> Kalsein AM 2 uM ve 4 uM EthD-1 (fıbroblast boyanması için, uygun olduğu rapor nihai konsantrasyon) içeren iki leke reaktif bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Seçilen bileşik ekstratlarının varlığında ya da yokluğunda kültürlenmiş yapışık hücrelere leke ekleyin. </li><li> Boyandıktan sonra ve zaman atlamalı görüntüleme yoluyla en az 15 dakika sonra, doğrudan ve hızlı bir şekilde boyanan hücre popülasyonları dikkate alınmalıdır. Değil santrifüj yapın ve lekeli hücrelerin fixe yok. </li></ol></li></ol> 3. Konfokal Time Lapse Görüntüleme ve Sinyal Analizi Kullanılan sistem, dört diyot lazer birimleri ve her bir numune için en fazla dört flüoresan boyalar için bir çok-lekeli bir görüntü ile donatılmıştır. Sistem bir faiz (600X büyütme) bir bölge gözlemlemek için taşıyabilirsiniz hangi test örneği bir bakış sağlayan bir haritalama görüntüsü (10X büyütme) gerçekleştirebilirsiniz. <ol><li> Zaman atlamalı görüntüleme <ol><li> S yerleştirinpecimens konfokal entegre kuluçka karanlık oda (bölme slayt lekeli örnekleri içeren) (37 C, CO 2 ve nemli bir atmosfer içinde% 5). </li><li> İlgili lazerler seçin. Kalsein ve EthD-1 heyecanlandırmak için iki lazer kaynaklarla 473 nm (15 mW) ve 559 nm (18 mW) kullanın. </li><li> Iki kullanılan floresan boya ile görüntülemede karışma olmadan hat dizileri yoluyla görüntü elde etmek için bir iki sıralı modunu kullanın. </li><li> Otomatik tarama biriminde floresan boya ile uygun olarak, şartların oluşturulması için yeni geliştirilmiş bir spektruma sahip bir detektör kullanır. </li><li> Maksimum her bir kanal için, tespit edilen floresan bant genişliği optimize. Tutanak tüm satın almalar sıralı potansiyel çapraz konuşmayı önlemek için. </li><li> Tedarik yazılımı kullanılarak floresan boya seçimine dayalı en uygun görüntüleme koşullarını seçin. </li><li> Otomatik olarak spiral bir desen merkezinde oluşturulan bir haritada bir görüntü elde edinilgi alanı ile kolayca yakından incelenmesi için seçilir. </li><li> Seç gözlem modu. Time-lapse, Z-yığını, ve gerektiği gibi çoklu alanı dahil olmak üzere gözlem modları beş türlerine kadar seçin. Bu çalışmada Z-yığını ve time-lapse modları bir arada kullanın ve hızla görüntü yakalama tamamlamak, </li><li> Değiştirin ve floresan boya geçmek. Alternatif olarak, floresan ve birbirleri ile hafif kontrast görüntüleri bindirmek. Sol alt harita ekranında seçilen noktasını kullanarak canlı görüntü gözlemleyebilirsiniz. </li><li> Çerçeveleme kullanan ve fonksiyonlarını yakınlaştırma tarafından görüntüleme alanını belirler. İsteğe bağlı olarak, floresan boya her tür ekranlar arasında geçiş. NOT: Bu protokolde kullanılan mikroskop kompakt bir tasarımda yüksek bir geleneksel confocal aynı işlevselliğe sahiptir. Mikroskop optimal olarak basitleştirilmiş bir dahili inkübatör canlı hücrelerinin kararlı zaman atlamalı görüntüleme için uygun olan ters çevrilmiş su daldırma hedefleri ile donatılmıştır. </li&gt; </ol></li><li> Sinyal analizi ve ölçümü <ol><li> Floresan sinyalini ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanın. Her iki test örneği ve hücre kontrolü için 10X amacı ile beş harita görüntüleri edinin. </li><li> 0.231 mikron × 0,231 mikron piksel boyutu ile, 1024 × 1024 piksel düzenli görüntüleri elde edildi. Sinyal analizi için Olympus Image Format (OIF) olarak mağaza görüntüler. Bu biçim birlikte çeşitli parametre ayarlarını ve görüntüleri depolamak sağlar. Farklı analiz araçları (yoğunluk profilinin ölçümü, iki kullanılan kanallar arasında yoğunluk oranı) kullanın. </li><li> 12 bit / piksel TIFF dosyaları olarak maksimum projeksiyon görüntüleri saklayın. </li><li> R komutanı yazılımını kullanarak istatistiksel analizler preform. Bir tekrar testi yapılan varyans analizi (ANOVA) Tek yönlü analizi kullanılarak farklılıkları analiz edin. Raporu (± SD) olarak ortalama, standart sapma ve p &lt;0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olur. </li></ol></li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını, açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

Biyouyumluluk malzeme davranışı tıbbi kullanımdan önce değerlendirilecek en önkoşul parametredir. Uluslararası standartlar tıbbi cihazlar ISO 10993 33 ve özellikle diş malzemeleri ISO 7405 34 kapsayacak. Çevreleyen hücrelere toksik etkilerin olmaması gibi malzemelerin biyouyumluluk değerlendirilmesinde anahtar norm. 37 - sitotoksisite testi diş malzeme biyouyumluluk 35 değerlendirilmesinde böyle bir öneme sahip nedeni budur. ISO test yöntemleri metabolik aktivite veya membran bütünlüğü temelinde olabilir önerdi. Seçilen uç noktalar zaman ve değerlendirme testlerinin maliyetini en aza indirmek için bir test malzeme ile uyarılan olumsuz etkilere sıralaması için belirli koşulları takip edilmelidir. Soruşturmanın akım yöntemi (3D konfokal time lapse görüntüleme) esaslı membran bütünlüğü olduğunu. Bu uç aracılığı ile sitotoksisite değerlendirilmesi hücre, biyolojik uyumluluğu değerli bir belirteç olarak görülmektedirTest edilen malzeme ve bunun ile sürülenlerden aynı zamanda ISO son nokta onaylanmıştır. İn vitro testler, bir malzeme örneği, özel bir hücre tipi nasıl etki ettiğinin saptanması için tasarlanmıştır. Kolorimetrik MTT deneyi ilk olarak in vitro ve hücre proliferasyonunun ölçülmesi için yararlı bir yöntem olarak (1983) Mossman tarafından tarif edilmiştir. MTT testi mitokondriyal aktivite belirlenerek aktif hücrelerin formazan kristalleri içine tetrazolyum tuzunun dönüştürülmesi, dayanmaktadır. Bu canlılığı oranı 38 ile tercüme edilebilir. Gupta ve işbirlikçileri MTT testi kompozit reçine sitotoksikligini ölçmek için en yaygın kullanılan yöntem olduğunu bildirdi. Süksinik dehidrojenaz ve alkalin fosfataz tepkileri ayrıca aynı amaç 39 kullanılmıştır. MTT deneyi her ölçüm zamanında hücreleri öldürerek gerektirmektedir Bununla birlikte, kaderin hücre, takip edilemez. Mevcut çalışmada daha yakından boyanmış hücrelerin davranışını izlemek için, DiCanlı hücrelerin rect gözlem, kısa protokol boyama, otomatik görüntü analizi ve floresan sinyal ölçümü ile kombine time lapse CLSM görüntüleme sayesinde gerçekleştirildi. Diş kompozitler oral dokular, özellikle dişeti ve pulpa hücreleri ile yakın temas. 41 - Fibroblast&#39;lar Bu restoratif kompozit 40 serbest bileşenlerin hedef olacaktır. Ayrıca birkaç çalışma, ölümsüzleştirilmiş hücreler ve birincil hücreler biyomalzeme ile temas içinde değişik hücresel tepkiler sahip olduğu belirtilmektedir. Birincil hücreler biyomaddeleri etkileri 42 değerlendirmek için daha uygun olduğu saptanmıştır. Bu, bu çalışmada test edilen diş kompozitin sitotoksisite değerlendirmesi için hücre modeli olarak primer insan diş eti fibroblast hücrelerinin kullanımını açıklar. 44 - Diş kompozit salınan maddelerin toksisitesi potansiyel geniş 43 incelenmiştir. T değerlendirmek içinUygun malzeme potansiyelini sitotoksik, iki temas modeli hücre gerçekleştirilebilir. Dolaylı temas sistemindeki hücreler, biyolojik ortamda elute olur temas eden hedef ise doğrudan temas modeli sisteminde malzeme doğrudan hedef hücreler ile yerleştirilir. Klinik uygulamada ve restoratif prosedürler için, diş kompozit diş eti dokuları ile dolaylı olarak temas edecek şekilde yerleştirilir. Bu nedenle, mevcut deneysel protokol (test kompozit özleri varlığında hücreler) GF&#39;lerinin ile dolaylı temas sistemi üzerinde duruldu. Daha önce Dahl ve işbirlikçileri tarafından bildirildiği gibi, sitotoksisite yanıtları için faaliyet göreceli dayalı &lt;(% 90), (30% orta (% 30-60), hafif (% 60-90) veya non-sitotoksik)&gt; ciddi olarak sıralanır edildi değerleri kontrol 45 elde edildi. Bu nedenle, elde edilen sonuçların ışığında (Tablo 1) Bu sıralama ve uygun, kompozit ELS ekstra düşük büzülme ver olarak sıralanır olabiliry hafifçe sitotoksik ve tüm zaman atlamalı dönemde hücreleri kontrol karşılaştırılabilir davranış gösterdi. Tam aynı araştırma yöntemi kullanarak, bu çalışmanın sonuçları yakın zamanda yayımlanan bir çalışmada kıyasla olabilir. ELS ekstra düşük büzülme kompozit doğrudan restorasyon 11, aynı klinik uygulama için kullanılan iki önce test kompozitlerle karşılaştırıldığında üstün bir biyouyumluluk göstermiştir. Daha ileri çalışmalar daha da tam bir karşılaştırma oluşturmak için gereklidir. Belirli bir son nokta değerlendirme için onaylamak için hangi sitotoksisite deneyi karar verirken, bu avantaj ve her testin sınırlarını anlamak önemlidir. Konfokal görüntüleme temel amacı, hücre ya da organların bir 3-D Mimari elde etmektir. Teknik Numunenin yüzeyine değil, aynı zamanda onun yeraltını sadece ortaya yapabiliyor. Burada açıklanan protokol, bir sensi olarak, 3D CLSM time lapse konfokal görüntüleme kullanımını altını çizentif yöntem, bir diş bileşik in vitro olarak biyolojik uyum davranışını değerlendirmek. Bununla birlikte, bu çalışmada karşılaşılan sınırlamalar önlemek amacıyla, titreşim önleyici iş istasyonları daha istikrarlı ve daha uzun bir zaman aralığı görüntülenmesine olanak sağlamak için kullanılabilir; masa laboratuvarda titreşimler neden olabilir zararlı etkilerinden kullanılan confocal sistemini izole olabilir. Ayrıca, malzeme ideal olarak diş eti dokulara zararsız olmalıdır, ağız boşluğunda kullanılmak üzere, sistemik toksisiteye neden olabilir hiçbir madde içermelidir. Kullanılan metodolojiye göre ve mevcut çalışmadan elde edilen sonuçlarda bu test kompozit (ELS ekstra düşük büzülme) Bu deneysel koşullarda sitotoksik olmadığı sonucuna varılabilir. CLSM yöntem, hassas bir canlı hücrelerinin ilk oran vermek üzere, diğer olasılıklar daha fazla bitiş noktası değerlendirmek için öngörülebilir. Özellikle, son zamanlarda rapor edilmiştir kompozit monomerleri thr hücrelerini etkileyenough reaktif oksijen türleri (ROS) 46- 48, daha fazla araştırma sitotoksisite arasında herhangi ağları ve ROS üretimini sinyalizasyon eğer ilişkiyi değerlendirmek için gereklidir. Gelecekteki protokolü aynı anda ROS üretimini değerlendirmek için (H 2 O 2 ve / veya O 2 - boyama) dizayn edilebilir ve zaman atlamalı CLSM görüntüleme kullanılarak sitotoksisite oranı (Canlı / ölü boyama).

Biyouyumluluk tanımlamak için ISO önerileri kote önemli ölçütlerden biri, hücrelere malzeme toksisite olmaması. Reçine tabanlı diş kompozitler zaman 1-4 üzerinde ve / ya da geç bozunma süreçleri kısmi polimerizasyon başlangıçta nedeniyle olabilir reçineli matrisi bileşenleri, bırakabilir. Bu serbest bileşenler ağız dokuları ile temas ve ürtikeryal ve mukozal reaksiyonlar 5 hastada 6 alerji ve aşırı duyarlılık reaksiyonları geliştirilmesi, mitojene üzerinde tipine dişeti fibroblastlar morfolojisi ve azaltılması modifikasyonları I kollajen protein 7, immünosüpresyonun veya immünostimülasyon gibi çeşitli sakıncaları olabilir genotoksik potansiyel 9 altını saflaştırılmış T-lenfositler ve dalak hücreleri 8 ve primer GF&#39;lerinin DNA hasarı -sürümlü çoğalması. Birçok parametreler gibi c gölge gibi diş kompozit toksisitesini etkileyebiliromposite, ışıkla sertleşen reçine monomer kimyasal bileşim olup, dolgu maddesi ve dönüşüm 10- 13 derecesine bağlıdır. Malzemelerin in vitro toksik potansiyel vivo durumlarda tahmin ve bazı ilgili son noktaların çalışmada klinik durumlara göre olabilir çünkü. Diş bileşikler ve bunların bileşenleri sitotoksisitesi yaygın olarak hücre kültür sistemleri 14- 16 ile değerlendirilmiştir. Bu in vitro sistemler vadede diş kompozit biyolojik uyumu değerlendirmek için geliştirilmiştir: hücre büyümesi ve hücre apoptozu, hücreler 17 gibi, THP-1monocytes kullanılarak GF&#39;lerinin 18 sitotoksisite, HaCaT&#39;ta inflammatuar potensiyelleri hücreler 2, hücre fonksiyonu gibi keratinositler odontoblast- MDPC-23 hücreleri 19 toplam RNA seviyelerinin azaltılması ve insan dişeti apoptoz indüklenmesinde önemli bir artış gibi keratinositler, 20 veDişeti ve posa fibroblast hücreleri 21 DNA hasarı. Farklı yöntemler diş kompozit biyouyumluluk araştırmak için önerilmektedir. Belirli bir renklendirici ve hafif tutma ölçümleri gibi kolorimetrik tahlilleri, nedeniyle göreli olarak basit ve düşük maliyetli 22 ila 26, en yaygın olarak kullanılan kalır. Işık aksine mikroskopisi analizi sık sık daha fazla zaman harcar ve yüksek maliyetler doğurur. Ancak, bu mikroskopi teknikleri bazı önemli avantajları var. Hücre yapısının gözlem, böylece daha ilgili ve hassas veriler sağlayan, deneyimli toksik etkileri hakkında genişletilmiş bilgi verir. Özellikle, konfokal mikroskopi 27 giriş, geleneksel geniş alan görüntüleme floresan mikroskopları ile karşılaştırıldığında eksenel çözünürlüğünü artırılması ile biyolojik yapıların gözlem için izin verdi. Dolayısıyla, konfokal görüntüleme farklı alanlarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştirtıbbi ve bilimsel araştırmalar. Elektronik mikroskopi teknikleri farklı olarak, tarama, konfokal mikroskopi özel flüoresan işaretler dahil edilmesi ile hücrelerin ayrı bileşenleri görselleştirmek için olanağı sunar. Bu özel izleyici çoğu klinik kullanım alanı ve ayrıca laboratuar araştırma çalışmaları sağlayan, bir sulu ortam içinde kararlı makul ölçülebilir, ucuz ve 28 toksik olmayan. Ayrıca, geleneksel bir elektronik mikroskopi analizi için gerekli olan numune kurutma ve fikse zaman atlamalı konfokal görüntüleme için gerekli değildir, ve böylece zaman bağımlı alıcı numuneleri üzerinde de mümkündür. İki-boyutlu görüntü ile karşılaştırıldığında, konfokal görüntüleme maddenin, örnek altı görselleştirme ve farklı edilen derinlik görüntüleri üç-boyutlu yapı, yeniden sağlar; ile sonuçlanan, daha hassas ve daha fazla sayıda yapısal detayları 29, 30. Mevcut Video Çalışma üç boyutlu Hızlandırılmış C kullanımının bir örneğiyenilikçi bir yöntem olarak Dead / Canlı floresan etiketleme ve sinyal ölçümü ile kombine onfocal Lazer Tarama Mikroskobu (3D-CLSM). Bu çalışmada sunulan teknik değerlendirilen hücre yapısını değiştirmeden canlı hücreleri hassas değerlendirilmesi ve time-lapse görüntüleme avantajına sahiptir. Hiçbir hazırlık adımları confocal analizden önce gereklidir. Daha önce, aynı boyama kültürlenmiş süngerimsi kemik çekirdek 31 uygunluğu değerlendirmek için, ancak şu konfokal hızlandırılmış kullanılmıştır. Benzer şekilde, aynı time-lapse konfokal prosedürü / belirli bir bakteri yaşıyor ölü boyama kullanarak kendi Gram türüne 32&#39;ye göre aktif çamur bakterilerde eritromisin zaman öldürmek aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı. Bu yöntemler, son uyarlanmıştır ve metakrilat monomerlere 11 göre diş kompozit toksisitesini karşılaştırmak için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>O2 / CO2 İnkübatör</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Hücre inkübasyonu</td></tr><tr><td>Canlı / Ölü Kit</td><td>Invitrojen ve nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Boya&nbsp;</td></tr><tr><td>ELS ekstra düşük büzülme &nbsp;</td><td>Saremco&nbsp;</td><td></td><td>Dental kompozit</td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Kültür ortamı</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>toplama hücreleri</td></tr><tr><td>odası slayt sistemi ve nbsp; &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Kültür odası</td></tr><tr><td>penisilin / streptomisin ve nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Hücre Sayacı</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Hücre sayımı&nbsp;</td></tr></tbody></table>

diş kompozit cytocompatibility değerlendirme verimli yöntemi olarak confocal time lapse görüntüleme

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Bu genel olarak in vitro hücre malzemesi etkileşimi diş malzemesi biyouyumluluk değerlendirilmesinde yararlı bir kriter olduğu kabul edilmektedir. Bu çalışmanın amacı, diş kompozitlerin in vitro biyolojik uyumluluğunun değerlendirmek için 3 boyutlu CLSM zaman atlamalı confocal görüntüleme kullanmaktı. Bu yöntem, diş bileşik özleri ile temas içinde canlı hücre oranının doğru ve hassas bir göstergesi sağlar. ELS ekstra düşük büzülme, doğrudan restorasyonu için kullanılan bir diş kompozit, örnek olarak alınmıştır. In vitro değerlendirme Live / Dead boyası kullanılarak kültüre birincil insan dişeti fibroblast hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Görüntüler FV10i confocal biyolojik ters sistemi ile elde ve FV10-ASW 3.1 Yazılımı ile analiz edildi. Görüntü analizi süreye 5 saat sonra, test edilen bileşiğin varlığında, çok hafif bir sitotoksisite göstermiştir. Hücre canlılığı hafif bir azalma, test edilen bileşik özütler karş ile temas halinde gösterilmiştired hücreleri kontrol etmek. Bulgular niteliksel ve niceliksel olarak diş kompozit biyouyumluluk davranışlarını değerlendirmek için hassas bir yöntem olarak 3D CLSM time lapse görüntüleme vurguluyor.

Şekil 1 kontrol ve test kompozit ekstrelerin (ELS ekstra düşük büzülme) maruz kalan hücreleri için elde edilen haritalama görüntüleri (10X objektif) olarak Canlı / Ölü lekeli hücrelerin bir bakış gösterdi. Hücrelerin, üç boyutlu yapı, büyütme 600x de gözlemlenebildi. Kontrol odasındaki ve test edilen bileşik ekstrelerinin mevcudiyetinde oda içinde toplanan hücrelerin toplanması hücre Görselleştirme Şekil 2'de sunulmuştur. Maksimum çıkıntı (amacı, 60X) süreye başlangıcında için seçilen hücre popülasyonlarının kaderi göstermektedir (15 dakikada) ve bir zaman aralığı süresinin sonunda (5 saat sonra). Görüntülerin Elli yedi yığınlarının (xyzt mod tarama, yığınlarının başına 39 görüntüler, voxel derinlik 1.00 mikron) bu dönemde elde edilmiştir. Kırmızı floresan bir yeşil flüoresan sinyalinde hafif bir azalma ve çok küçük bir değişime maruz bırakılan hücrelerde elde edilmiştir. Önemli bir varyasyon kontrolü için gözlendihücreler. Kompozit özler maruz hücreler kontrol etmek için benzer mil morfoloji üstlendi; morfolojisi (yeşil sinyal azalması ve test edilen bileşiğin varlığında, kırmızı sinyal artmasına rağmen) bu deney koşullarında değişmemiştir. Görüntü analizi, yeşil ve kırmızı sinyal için negatif kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, test edilen bileşik için elde edilen görüntü ile ilgili farklı hücre birikmeye tekabül eden beş seçilen farklı görüntü yığınlarının üzerinde gerçekleştirildi. Lekeli hücrelerin yoğunluğu profili, Şekil 3'te gösterilmiştir; Test edilen bileşik ile temas halinde olan hücre, yeşil ve kırmızı sinyal gelişimi kontrol hücreleri ile karşılaştırılabilir olmuştur. Kalsein ve EthD-1 floresan emisyon yoğunlukları, kontrol hücreleri ve kompozit maruz kalan hücreler üzerinde ölçülmüştür. Ölçüm en fazla beş saat için, bir saatlik aralıklarla yapıldı. Yeşil 495-515 nm entegre edilmiş yoğunluklarının ve kırmızı 620-650 nm sinyallerine dayanan kırmızı / yeşil flüoresans oranı () Time-lapse dönemde hesaplanmıştır. ELS İlave düşük çekme ekstrelere yaşayabilirliği kontrol oranları ve maruz kalan hücreler, 1 mümkün T de gösterilmiştir. Test edilen bileşiğin varlığında, canlı hücre yüzdesi, 1 saat sonra% 93.9 kadar% 100 biraz azalttığı bulunmuştur iletişim. Önemli fark, belirtilen zaman atlamalı süresinin 5 saat sonra, test bileşimi ve (herhangi bir bileşik ekstreler olmayan hücre), negatif kontrol arasında gözlenmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> Şekil 1: haritalama görüntünün Bakış zaman atlamalı dönemi (t = 15 dk) başında kompozit özleri (ELS ekstra düşük büzülme) varlığında objektif 10X, (A) kontrol hücreleri ve (B) hücreleri hücrelere lekeli gösterdi. Yeşil alanlar, canlı hücreler vardır ve kırmızı alanlar hasarlı hücrelerdir. Bu daDeney koşulları, (yeşil ve kırmızı floresans) hiç değişim, negatif kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında kompozit maruz bırakılan hücrelerde gözlenmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> Şekil 2 (A), kumanda odasının ve başlangıçta (B) birleşik ekstreler bölmesi ve maruz kalma süresi hızlandırılmış döneminin sonunda bir hücre popülasyonunun amacı 60X en CLSM resim (I: 15 dakika ve II, sırasıyla: 5 saat, ). Yeşil alanlar, canlı hücreler vardır ve kırmızı alanlar hasarlı hücrelerdir. Görüntülerin paneli yoğunluğu sinyalde hafif bir değişiklik (yeşil sinyalde hafif bir azalma ve kırmızı birinde çok hafif bir artış) göstermiştir. Hiçbir hücre morfolojisi değişiklikleri kompozit ekstratlarının varlığında gözlendi; kontrol hücreleri olarak mil şekilli ve fibroblastik morfolojisi muhafaza hücreler maruz kalmaktadır. Şekil 3: zaman atlamalı mikroskopi gözlenen hücre hattı profili, 15 dakika ve 5 saat sonra (II), (A) Kontrol hücreleri (B) Bileşik özütler maruz kalan hücreleri (I) '.. Ne olursa olsun test edilen bileşiğin varlığında, yeşil sinyal evriminde Görünür bir değişiklik zamanlı iletişim. Ancak, kırmızı sinyal hafif bir artış temas 5 saat sonra bileşik varlığında gözlenmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> İletişim süresi (saat) </td><td colspan="5"> Hücre canlılığı, (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Kontrol hücreleri </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS ekstra düşük büzülme ® </td><td> 93.9 ± 7 </td><td> 91.3 ± 5 * </td><td> 89.5 ± 3 * </td><td> 87.6 ± 2 * </td><td> 87.7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Kompozit ekstraktlar Hücre canlılığı temas 1, 2, 3, 4 ve 5 saat sonra canlı, HGF hücreler evrim Oranı / Canlı Ölü sitotoksisite kiti kullanılarak lekeleme ile analiz edilmiştir. Beş görüntülerin SD analizini yığınlarının ± Veriler ortalama değerleri göstermektedir. Değerler p &lt;0.05 kontrol hücrelerinden önemli ölçüde farklıdır.

Diş kompozit biyouyumluluk en çok çalışılan yönü floresan sinyal ölçümü ile birlikte kendi sitotoksisite 3D CLSM time lapse görüntüleme zamanla hücre kaderinin duyarlı değerlendirilmesine olanak olduğunu. Bu yöntemi kullanan diş kompozit cytocompatibility değerlendirmek için etkili bir araç olabilir.

Diş Kompozit Cytocompatibility Değerlendirme Verimli Yöntemi olarak Confocal Time Lapse Görüntüleme

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

Bu prosedürün genel amacı, dental kompozitlerin in vitro biyouyumluluğunu kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirmek için hızlandırılmış görüntüleme için 3D konfokal lazer tarama mikroskobu kullanmaktır. Bu, ikinci adımda önce kürlenmemiş dental kompozitin küresel örneklerinin alınmasıyla gerçekleştirilir. İnsan dişeti fibroblastları, bu kompozit ekstraktların varlığında veya yokluğunda kültürlenir ve daha sonra hücreler canlı ölü boyama ile etiketlenir.Daha sonra hücre kültürlerinden harita görüntüleri oluşturulur ve ilgi alanları için bindirme görüntüleri oluşturulur. Sonuç olarak, test edilen kompozitlerin varlığında veya yokluğunda meydana gelen hücre davranışındaki gerçek zamanlı farklılıklar, görüntülerde gözlemlenen yeşil veya kırmızı floresan sinyallerindeki değişikliklere göre izlenebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları, hücre yapısında değişikliklere neden olmadan canlı hücrelerin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin vermesidir.Hücre boyamadan sonra veya zaman atlamalı gözlemden önce herhangi bir fiksasyon veya kurutma adımı gerekmez. Kompozit ekstraktı hazırlamak için, kürlenmemiş dental kompozitin küresel örneklerini oluşturmak için iki milimetre yarıçaplı ısmarlama bir tutucu kullanarak başlayın. Numuneleri, bir mililitre kültür ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın, bazı oyukları kontrol hücresi kültürleri için tek başına ortamla bırakmaya dikkat edin ve ardından numunelerin 0,5 milimetre içinde 1070 miliwatt santimetre kare yoğunluğa sahip bir LED lamba düzenleyin.Dişler ve bakımsız dental kompozit arasındaki geçici teması simüle etmek için numuneleri 40 saniye kürledi ve ardından kompozit numuneleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat inkübe etti. Ortamı her üç günde bir değiştirin ve hücreleri her beş günde bir geçirin. Daha sonra kültür ortak akıcılığa ulaştıktan sonra, hücreleri hasat edin ve 90 kez G ve 37 santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün.Peleti kültür ortamında yeniden süspanse edin ve daha sonra hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde gece boyunca 37 santigrat derecede bir oda kaydırma sisteminde mililitre başına 2,5 kat 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda tohumlayın. Ertesi sabah, odacık slaytının iki kuyusundaki ortamı, test edilen kompozit ekstraktların bir mililitresi ile değiştirin ve hücreleri konfokal olarak görüntülemek için slaytı tekrar inkübatöre yerleştirin. Hızlandırılmış görüntüleme.İlk olarak, kompozit kokültürlenmiş ve kontrol hücrelerini, üreticinin talimatlarına göre ökaryotik hücreler için canlı ölü sitotoksisite boyası ile etiketleyin. Boyamadan 15 dakika sonra, hücre kültürü koşulları altında oda sürgüsünü karanlıkta konfokal entegre odaya yerleştirin ve 473 nanometre ve 559 nanometre lazerleri ısıtın. Ardından, 473 nanometre lazerin görüntüleme koşullarını otomatik olarak ayarlamak için yeni geliştirilmiş bir spektruma sahip bir dedektör kullanın.İlgilendiğiniz alanı seçmek için çerçeveleme ve yakınlaştırma işlevlerini kullanın ve ardından gözlem modunu seçin. Gerektiğinde hızlandırılmış Zack ve çoklu alan dahil olmak üzere beş adede kadar gözlem modu türü seçin ve ardından istenen görüntüler elde edildiğinde hem test numunesi hem de kontrol hücreleri için 10 x objektif altında 473 nanometre lazerle beş harita görüntüsünü hızla yakalayın. 559 nanometre lazere geçin ve az önce gösterildiği gibi ikinci floresanda hücrenin görüntülerini yakalayın.Alternatif olarak, canlı görüntü deposunu gözlemlemek için X 60 canlı ekranda seçilen noktayı kullanarak floresan ve ışık kontrastlı görüntülerin üzerini örtün. Sinyal analizi için Olympus görüntü formatındaki harita görüntüleri ve maksimum projeksiyon görüntüleri piksel başına 24 bittir. TIFF dosyaları daha sonra sinyalin yoğunluk profilini ve iki floresan kanal arasındaki yoğunluk oranını ölçmek için farklı analiz araçlarını kullanır.Son olarak, uygun yazılımla iki grup arasındaki floresan hücre sinyalizasyonundaki farklılıkları analiz edin. Canlı TED boyama hücrelerinin tek başına ortamdaki veya kompozit ekstraktlamaya maruz kalan bu harita görüntülerinde, zaman atlamalı periyoda 15 dakika kala hücrelerin canlılığında herhangi bir fark gözlenmedi. Burada, kontrol hücrelerinin maksimal projeksiyon görüntüleri, hücrelerin ilk 15 dakika içinde büyütülmüş kaderini gösterir ve gözlemlendiği gibi zaman atlama süresinin sonunda beş saat sonra, inkübasyon süresi boyunca kontrol hücreleri içindeki floresansta önemli bir değişiklik olmamıştır.ELS ekstra düşük büzülmeye maruz kalan hücreler, kontrol hücrelerine benzer bir iğ morfolojisi üstlendi, ancak hızlandırılmış sürenin sonunda yeşil floresan sinyalinde hafif bir azalma ve kırmızı floresanda çok hafif bir artış sergiledi. Boyanmış hücrelerin yoğunluk profili, kalsiyum endotel homodimer bir floresan emisyon yoğunluklarının kontrol ve kompozit maruz kalan hücreler üzerinde bir saatlik aralıklarla beş saate kadar ölçüldüğü bu grafiklerde gösterilmektedir. İki kültür arasında sinyalizasyonda önemli bir fark gözlenmedi.Kontrol ve açıkta kalan kompozit hücreler için canlılık oranları tabloda gösterilmiştir. Test edilen kompozitin varlığında, canlı hücrelerin yüzdesinin, beş saat sonra bir saatlik temastan sonra %100'den %93.9'a hafifçe düştüğü bulundu. Kompozitin sitotoksisitesi olmamasına rağmen, test edilen kompozit ELS, ekstra düşük büzülme ve negatif kontrol hücre kültürleri arasında hücre canlılığında önemli farklılıklar gözlenmiştir.Mevcut veriler, konfokal hızlandırılmış görüntülemenin, geliştirilmesinden sonra dental kompozitlerin temas halindeki gen fibroblast davranışını değerlendirmek için doğru ve hassas bir yöntem olarak kullanımını vurgulamaktadır. Bu yöntem, toksikoloji alanındaki araştırmacıların dental materyallerin, ilaçların, kimyasal maddelerin ve diğer tıbbi cihazların sitotoksisitesini ve risk değerlendirmesini keşfetmeleri için özel bir yoldur.

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Parker, J. J., et al. Tümör Hücre Göçü ve Anti-İnvaziv İlaçların Hastaya Özgü Etkilerinin İncelenmesi için Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültür Modeli. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, konfokal mikroskopi ile yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden glioblastoma doku dilimlerinin görüntülenmesini göstermektedir. Tümör hücresi hareketini ve yönünü izlemek için tutarlı aralıklarla yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalanır.

Glioblastoma Dokusunda Tümör Hücresi Migrasyonunun Hızlandırılmış Taramalı Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu çalışmada, lifli ortak biyomekanik için mikro-X-ışını bilgisayarlı tomografi ile birlikte yerinde yükleme cihazının bir kullanımının tartışılacaktır. Ortak biyomekanik bir genel değişim ile tanımlanabilir deneysel okumalar içerecektir: 1) gerici deplasman vs kuvvet, alveol soket içinde yani diş deplasman ve yükleme onun gerici tepki, 2) üç boyutlu (3D) mekansal yapılandırma ve morfometrik, yani geometrik nedeniyle yükleme ekseni örneğin, konsentrik ya da eksantrik yükler bir değişiklik için...

Yerinde Basınç Yükleme ve Kemik-periodontal ligament-diş Lifli Joint Korelatif noninvaziv Görüntüleme

Dental reçine kompozit restorasyonlarda polimerizasyon büzülmesi stres mekansal gelişimini anlamak için, Dijital Görüntü Korelasyon polimerizasyon öncesinde ve sonrasında alınan restorasyon görüntüleri ilişkilendirerek tarafından restore modeli cam boşlukları tam saha deplasman / gerilme ölçümü sağlamak için kullanılmıştır.

Simüle Kâzım Diş Kompozit büzülme Dijital Görüntü Korelasyon ile Ölçülen

Burada, sözlü biyofilm oluşumu için diş protez ayakları bakteri hücreleri canlılığı ve morfolojik özellikleri analizi de dahil olmak üzere, titanyum ve zirkon malzemeler üzerinde değerlendirmek için bir protokol mevcut. Güçlü mikroskobu teknikleri ile ilişkili bir in situ modeli sözlü biyofilm analizi için kullanılır.

Diş implantları için farklı malzemeler üzerinde sözlü biyofilm oluşumu

Subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki lipozomların mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde incelemek için fiberoptik konfokal lazer miksanoskopi (CLM) kullanımı için bir protokol sunuyoruz.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Floresan Destekli Tanımlama Tekniği, kompozit reçine restorasyonlarının diş maddesinden ayırt edilmesi için uygulanabilir, hızlı ve güvenilir bir yaklaşımdır ve kompozit reçine restorasyonlarının ve kompozit bağlı travma atellerinin minimal invaziv ve tamamen çıkarılmasını kolaylaştırır.

Floresan Destekli Tanımlama Tekniği Kullanılarak Diş Rengindeki Kompozit Reçinenin Tespiti ve Uzaklaştırılması

Bu metodoloji, bir diş cihazının herhangi bir numuneye herhangi bir açıda standartlaştırılmış kuvvet ve stabilite ile uygulanmasına izin verir. Bu yaklaşım, sağlık bilimlerinde, mikromotorlar, türbinler ve ultrasonik ölçekleyiciler gibi el tutma elemanları ile dental ekipmanın çeşitli yüzeylerdeki etkilerini standartlaştırmak için yaygın olarak kullanılabilir.

Piezoelektrik Dental Ölçekleyicinin İki Farklı Akışkan Kompozit Dolgu Malzemesi Üzerindeki Pürüzlülük Etkisi

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Öğrenin, diş kompozitlerinin sitouyumluluğunu 3D konfokal mikroskopi ile zaman atlamalı görüntüleme yöntemiyle değerlendirin. Canlı hücre davranışlarını gerçek zamanlı izleyerek toksisite analizi yapın.

Diş Kompozit Cytocompatibility Değerlendirme Verimli Yöntemi olarak Confocal Time Lapse Görüntüleme

Daha fazla video keşfet