Diş Kompozit Cytocompatibility Değerlendirme Verimli Yöntemi olarak Confocal Time Lapse Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, dental kompozitlerin in vitro biyouyumluluğunu kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirmek için hızlandırılmış görüntüleme için 3D konfokal lazer tarama mikroskobu kullanmaktır. Bu, ikinci adımda önce kürlenmemiş dental kompozitin küresel örneklerinin alınmasıyla gerçekleştirilir. İnsan dişeti fibroblastları, bu kompozit ekstraktların varlığında veya yokluğunda kültürlenir ve daha sonra hücreler canlı ölü boyama ile etiketlenir.

Daha sonra hücre kültürlerinden harita görüntüleri oluşturulur ve ilgi alanları için bindirme görüntüleri oluşturulur. Sonuç olarak, test edilen kompozitlerin varlığında veya yokluğunda meydana gelen hücre davranışındaki gerçek zamanlı farklılıklar, görüntülerde gözlemlenen yeşil veya kırmızı floresan sinyallerindeki değişikliklere göre izlenebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları, hücre yapısında değişikliklere neden olmadan canlı hücrelerin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin vermesidir.

Hücre boyamadan sonra veya zaman atlamalı gözlemden önce herhangi bir fiksasyon veya kurutma adımı gerekmez. Kompozit ekstraktı hazırlamak için, kürlenmemiş dental kompozitin küresel örneklerini oluşturmak için iki milimetre yarıçaplı ısmarlama bir tutucu kullanarak başlayın. Numuneleri, bir mililitre kültür ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın, bazı oyukları kontrol hücresi kültürleri için tek başına ortamla bırakmaya dikkat edin ve ardından numunelerin 0,5 milimetre içinde 1070 miliwatt santimetre kare yoğunluğa sahip bir LED lamba düzenleyin.

Dişler ve bakımsız dental kompozit arasındaki geçici teması simüle etmek için numuneleri 40 saniye kürledi ve ardından kompozit numuneleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat inkübe etti. Ortamı her üç günde bir değiştirin ve hücreleri her beş günde bir geçirin. Daha sonra kültür ortak akıcılığa ulaştıktan sonra, hücreleri hasat edin ve 90 kez G ve 37 santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün.

Peleti kültür ortamında yeniden süspanse edin ve daha sonra hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde gece boyunca 37 santigrat derecede bir oda kaydırma sisteminde mililitre başına 2,5 kat 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda tohumlayın. Ertesi sabah, odacık slaytının iki kuyusundaki ortamı, test edilen kompozit ekstraktların bir mililitresi ile değiştirin ve hücreleri konfokal olarak görüntülemek için slaytı tekrar inkübatöre yerleştirin. Hızlandırılmış görüntüleme.

İlk olarak, kompozit kokültürlenmiş ve kontrol hücrelerini, üreticinin talimatlarına göre ökaryotik hücreler için canlı ölü sitotoksisite boyası ile etiketleyin. Boyamadan 15 dakika sonra, hücre kültürü koşulları altında oda sürgüsünü karanlıkta konfokal entegre odaya yerleştirin ve 473 nanometre ve 559 nanometre lazerleri ısıtın. Ardından, 473 nanometre lazerin görüntüleme koşullarını otomatik olarak ayarlamak için yeni geliştirilmiş bir spektruma sahip bir dedektör kullanın.

İlgilendiğiniz alanı seçmek için çerçeveleme ve yakınlaştırma işlevlerini kullanın ve ardından gözlem modunu seçin. Gerektiğinde hızlandırılmış Zack ve çoklu alan dahil olmak üzere beş adede kadar gözlem modu türü seçin ve ardından istenen görüntüler elde edildiğinde hem test numunesi hem de kontrol hücreleri için 10 x objektif altında 473 nanometre lazerle beş harita görüntüsünü hızla yakalayın. 559 nanometre lazere geçin ve az önce gösterildiği gibi ikinci floresanda hücrenin görüntülerini yakalayın.

Alternatif olarak, canlı görüntü deposunu gözlemlemek için X 60 canlı ekranda seçilen noktayı kullanarak floresan ve ışık kontrastlı görüntülerin üzerini örtün. Sinyal analizi için Olympus görüntü formatındaki harita görüntüleri ve maksimum projeksiyon görüntüleri piksel başına 24 bittir. TIFF dosyaları daha sonra sinyalin yoğunluk profilini ve iki floresan kanal arasındaki yoğunluk oranını ölçmek için farklı analiz araçlarını kullanır.

Son olarak, uygun yazılımla iki grup arasındaki floresan hücre sinyalizasyonundaki farklılıkları analiz edin. Canlı TED boyama hücrelerinin tek başına ortamdaki veya kompozit ekstraktlamaya maruz kalan bu harita görüntülerinde, zaman atlamalı periyoda 15 dakika kala hücrelerin canlılığında herhangi bir fark gözlenmedi. Burada, kontrol hücrelerinin maksimal projeksiyon görüntüleri, hücrelerin ilk 15 dakika içinde büyütülmüş kaderini gösterir ve gözlemlendiği gibi zaman atlama süresinin sonunda beş saat sonra, inkübasyon süresi boyunca kontrol hücreleri içindeki floresansta önemli bir değişiklik olmamıştır.

ELS ekstra düşük büzülmeye maruz kalan hücreler, kontrol hücrelerine benzer bir iğ morfolojisi üstlendi, ancak hızlandırılmış sürenin sonunda yeşil floresan sinyalinde hafif bir azalma ve kırmızı floresanda çok hafif bir artış sergiledi. Boyanmış hücrelerin yoğunluk profili, kalsiyum endotel homodimer bir floresan emisyon yoğunluklarının kontrol ve kompozit maruz kalan hücreler üzerinde bir saatlik aralıklarla beş saate kadar ölçüldüğü bu grafiklerde gösterilmektedir. İki kültür arasında sinyalizasyonda önemli bir fark gözlenmedi.

Kontrol ve açıkta kalan kompozit hücreler için canlılık oranları tabloda gösterilmiştir. Test edilen kompozitin varlığında, canlı hücrelerin yüzdesinin, beş saat sonra bir saatlik temastan sonra %100'den %93.9'a hafifçe düştüğü bulundu. Kompozitin sitotoksisitesi olmamasına rağmen, test edilen kompozit ELS, ekstra düşük büzülme ve negatif kontrol hücre kültürleri arasında hücre canlılığında önemli farklılıklar gözlenmiştir.

Mevcut veriler, konfokal hızlandırılmış görüntülemenin, geliştirilmesinden sonra dental kompozitlerin temas halindeki gen fibroblast davranışını değerlendirmek için doğru ve hassas bir yöntem olarak kullanımını vurgulamaktadır. Bu yöntem, toksikoloji alanındaki araştırmacıların dental materyallerin, ilaçların, kimyasal maddelerin ve diğer tıbbi cihazların sitotoksisitesini ve risk değerlendirmesini keşfetmeleri için özel bir yoldur.