Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, antibakteriyel ajanlarla tedaviden sonra üç hücresel ve hücre dışı biyofilm bileşeninin eşzamanlı üç boyutlu dağılımlarını ölçmek ve karşılaştırmaktır. Bu, önce reçine kompozit numunelerin imal edilmesi ve ardından parlatılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, ilgilenilen biyofilmler numuneler üzerinde büyütülür ve daha sonra antibakteriyel maddelerle muamele edilir.

Daha sonra, biyofilmler hücre dışı polimerik maddeler, nükleik asitler ve proteinler için florokromlarla boyanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülenir. Son adımda, biyofilm bileşenlerinin eşzamanlı görselleştirmesini kolaylaştırmak için üst üste binen florokromların üç boyutlu görüntüleri yeniden yapılandırılır ve biyofilm görüntülerinden yapısal parametreler hesaplanır. Sonuç olarak, tedavi ve kontrol grupları arasındaki farkları karşılaştırmak için biyofilm hacmi ve ortalama biyofilm kalınlığı gibi biyofilm yapısal parametrelerinin istatistiksel analizi yapılabilir.

Bu prosedürün mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, belirli koşullar altında büyütülen biyofilmlerin yapısı içindeki birden fazla bileşenin dağılımını karakterize etmek için farklı ancak birbirine bağlı teknikler kullanmasıdır, bu da prosedürün doktora sonrası araştırma görevlisi Dr.Fernando Flores ve laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Bayan Kristen Smart Numuneleri oluşturmak için, özel olarak 0.4 veya TPH üç diş reçinesi kompoziti bir artış yerleştirerek başlayın. paslanmaz çelik kalıplar yaptı. Ardından, ilk artışı 40 saniye boyunca bir LED ışıkla sertleştirme ünitesi ile polimerize edin. İkinci artış için prosedürü tekrarladıktan sonra, kürlenmiş numuneleri kabul edilebilir bir nihai yüzey kalitesi elde etmek için yarı otomatik bir öğütücü parlatıcı kullanın.

Son olarak, biyofilmi büyütmek için örnekleri sterilize edin. İlk olarak, tek bir S mutan kolonisini dört mililitre gece boyunca kültür ortamında aşılayın ve daha sonra en az 0.9'luk bir optik yoğunluk elde etmek için kültürü 37 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin. Daha sonra, kültürü 10 mililitre biyofilm büyümesinde bir ila 100 oranında seyreltin.

Ortam, steril reçine kompozit numunelerini steril 12 oyuklu plakalara aseptik olarak aktarın ve daha sonra oyukların her birine 2,5 mililitre seyreltilmiş kültür ekleyin. Gargara tedavisi ve kontrol grupları için, sterilite kontrol kuyularına 2,5 mililitre steril aşılanmamış biyofilm büyümesi, orta ekleyin ve ardından biyofilmleri 100 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde mikro parafilik koşullar altında 37 santigrat derecede büyütün. 24 saat sonra, ortamı tüm kuyucuklardan aseptik olarak aspire edin ve her bir kuyucuğu 2,5 mililitre steril PBS ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra salini aspire edin, ardından her bir kuyucuğu 2,5 mililitre taze biyofilm büyüme ortamı ile doldurun ve plakayı toplam biyofilm büyümesi için gösterildiği gibi 24 saat daha inkübe edin Biyofilm büyümesi tamamlandıktan sonra 48 saatlik süre, Büyüme ortamını aspire edin ve daha sonra her bir tedavi grubuna 2,5 mililitre gargara ve kontrol grubuna 2,5 mililitre steril ultra saf su dağıtın.

Plakaları 150 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde iyice çalkalayın ve ardından 60 saniye sonra, biyofilmlerin ekzo polisakkarit bileşenini lekelemek için hem gargarayı hem de ultra saf suyu kuyulardan aspire edin. Her bir biyofilmi 50 mikrolitre LOR konjugatı ile ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneleri her yıkamadan sonra 2.5 mililitre TC tamponu ile iki kez yıkayın ve her bir biyofilmdeki nükleik asitleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 mikrolitrelik bir sito dokuz damlası ile boyayın.

Örnekleri iki kez yıkadıktan sonra, her bir biyofilmdeki protein bileşenlerini 50 mikrolitre Cipro kırmızısı ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan koruyarak boyayın. Numuneleri üç kez yıkadıktan sonra, tedavi ve kontrol gruplarının biyofilmleri içindeki bileşen lekelerinin her birinin görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi ile görselleştirmelerini kolaylaştırmak için kuyu başına altı mililitre steril ultra saf su içeren altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir konfokal lazer tarama mikroskobunun lazerlerini, Eksor eşlenik boyama ile ekzo polisakkaritlerin tespiti için aşağıdaki ayarlara ayarlayın, sito dokuz boyama ile nükleik asitlerin tespiti için 633 nanometre lazer ve 659 ila 749 nanometre emisyon bandı kullanın.

488 nanometre lazer ve 495 ila 500 nanometre emisyon bandı kullanın ve proteinlerin Cipro kırmızı leke ile tespiti için 543 nanometre lazer ve 615 ila 651 nanometre emisyon bandı kullanın. Ardından, 0,9 sayısal diyafram açıklığına ve 2,2 milimetre çalışma mesafesine sahip 63 x daldırma lensi kullanarak. Aynı biyofilm içinde birden fazla lekenin görüntülerinin yakalanmasını optimize etmek için yığınlar arası modda sıralı tarama kullanarak 400 hertz'de konfokal lazer tarama mikroskobu görüntülerini toplayın.

Konfokal lazer tarama mikroskobu görüntülerini analiz ettikten sonra, her bir biyofilm içindeki üst üste binen bileşen lekelerinin yeniden yapılandırılmış bir 3B görüntüsünü oluşturmak için hız görüntü analiz yazılımındaki 3B oluşturucu menü seçeneğini kullanın. Ardından, biyofilmin en iyi görünümünü elde etmek için 3D görüntüyü döndürün. Ardından biyofilm rekonstrüksiyonunun bir anlık görüntüsünü yakalayın ve anlık görüntüyü uygun bir görüntü dosyası formatında dışa aktarın.

Son olarak, biyofilmler içindeki ekzo polisakkarit nükleik asit ve protein bileşenlerinin eşzamanlı dağılımının görsel bir analizini yapın. Yeniden yapılandırılmış görüntülerde, ISA 3D yazılımı kullanılarak biyo hacim ve ortalama biyofilm kalınlığı gibi biyofilm yapısal parametrelerinin hesaplanması, bu tabloda istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak hesaplanan biyofilm yapısal parametrelerinin ortalama ve standart sapma değerleri gösterilmektedir. Ağız gargarası ile muamele edilen biyofilmlerin yapısal parametreleri için kontrol grubundaki biyofilmlerden önemli ölçüde farklı olan ortalama ve standart sapma değerleri kırmızı karışık modellerde vurgulanmıştır.

İstatistiksel analizler, Biotene PBF gargarasının her iki reçine kompozitinde kontrol grubundan önemli ölçüde farklı biyofilm yapıları ürettiğini, Listerine total care gargarasının ise her iki reçine kompozitinde de önemli farklılıklar üretmediğini gösterdi, bu da iki gargara işleminden sonra kalan hücresel ve hücre dışı biyofilm bileşenlerindeki farklılıkları açıkça gösteriyor. Ekzo polisakkaritlerin, nükleik asitlerin ve proteinlerin biyofilmler içindeki eşzamanlı dağılımı, hız yazılımı kullanılarak oluşturulan 3D rekonstrüksiyonlar aracılığıyla görselleştirilebilir. Bu şekilde, 0.4'te büyütülen kontrol grubu biyofilmlerinin temsili bir rekonstrüksiyonu, mavi rengin ekzo polisakkarite atandığı gösterilmiştir.

S mutans biyofilmleri içinde, yeşil renk nükleik asitlere ve kırmızı renk proteinlere atanmıştır. Araya giren boşluk, floresan olarak etiketlenmemiş su veya diğer biyofilm bileşenleri tarafından işgal edilebilir. Bu şekilde, önceki şekille aynı bileşenleri temsil eden renklerle TPH üç reçine kompoziti üzerinde büyütülen kontrol grubu biyofilmlerinin temsili bir rekonstrüksiyonu gösterilmektedir.

Bu prosedür tıp, dişçilik, jeoloji ve deniz bilimleri gibi çeşitli disiplinlerde uygulama getirmiştir. Çünkü burada kullanılanların yerine birçok substrat ve biyofilm ikame edilebilir.