Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu
10 Aralık 2013
Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.
Bu prosedürün genel amacı, antibakteriyel ajanlarla tedaviden sonra üç hücresel ve hücre dışı biyofilm bileşeninin eşzamanlı üç boyutlu dağılımlarını ölçmek ve karşılaştırmaktır. Bu, önce reçine kompozit numunelerin imal edilmesi ve ardından parlatılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, ilgilenilen biyofilmler numuneler üzerinde büyütülür ve daha sonra antibakteriyel maddelerle muamele edilir.
Daha sonra, biyofilmler hücre dışı polimerik maddeler, nükleik asitler ve proteinler için florokromlarla boyanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülenir. Son adımda, biyofilm bileşenlerinin eşzamanlı görselleştirmesini kolaylaştırmak için üst üste binen florokromların üç boyutlu görüntüleri yeniden yapılandırılır ve biyofilm görüntülerinden yapısal parametreler hesaplanır. Sonuç olarak, tedavi ve kontrol grupları arasındaki farkları karşılaştırmak için biyofilm hacmi ve ortalama biyofilm kalınlığı gibi biyofilm yapısal parametrelerinin istatistiksel analizi yapılabilir.
Bu prosedürün mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, belirli koşullar altında büyütülen biyofilmlerin yapısı içindeki birden fazla bileşenin dağılımını karakterize etmek için farklı ancak birbirine bağlı teknikler kullanmasıdır, bu da prosedürün doktora sonrası araştırma görevlisi Dr.Fernando Flores ve laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Bayan Kristen Smart Numuneleri oluşturmak için, özel olarak 0.4 veya TPH üç diş reçinesi kompoziti bir artış yerleştirerek başlayın. paslanmaz çelik kalıplar yaptı. Ardından, ilk artışı 40 saniye boyunca bir LED ışıkla sertleştirme ünitesi ile polimerize edin. İkinci artış için prosedürü tekrarladıktan sonra, kürlenmiş numuneleri kabul edilebilir bir nihai yüzey kalitesi elde etmek için yarı otomatik bir öğütücü parlatıcı kullanın.
Son olarak, biyofilmi büyütmek için örnekleri sterilize edin. İlk olarak, tek bir S mutan kolonisini dört mililitre gece boyunca kültür ortamında aşılayın ve daha sonra en az 0.9'luk bir optik yoğunluk elde etmek için kültürü 37 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin. Daha sonra, kültürü 10 mililitre biyofilm büyümesinde bir ila 100 oranında seyreltin.
Ortam, steril reçine kompozit numunelerini steril 12 oyuklu plakalara aseptik olarak aktarın ve daha sonra oyukların her birine 2,5 mililitre seyreltilmiş kültür ekleyin. Gargara tedavisi ve kontrol grupları için, sterilite kontrol kuyularına 2,5 mililitre steril aşılanmamış biyofilm büyümesi, orta ekleyin ve ardından biyofilmleri 100 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde mikro parafilik koşullar altında 37 santigrat derecede büyütün. 24 saat sonra, ortamı tüm kuyucuklardan aseptik olarak aspire edin ve her bir kuyucuğu 2,5 mililitre steril PBS ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra salini aspire edin, ardından her bir kuyucuğu 2,5 mililitre taze biyofilm büyüme ortamı ile doldurun ve plakayı toplam biyofilm büyümesi için gösterildiği gibi 24 saat daha inkübe edin Biyofilm büyümesi tamamlandıktan sonra 48 saatlik süre, Büyüme ortamını aspire edin ve daha sonra her bir tedavi grubuna 2,5 mililitre gargara ve kontrol grubuna 2,5 mililitre steril ultra saf su dağıtın.
Plakaları 150 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde iyice çalkalayın ve ardından 60 saniye sonra, biyofilmlerin ekzo polisakkarit bileşenini lekelemek için hem gargarayı hem de ultra saf suyu kuyulardan aspire edin. Her bir biyofilmi 50 mikrolitre LOR konjugatı ile ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneleri her yıkamadan sonra 2.5 mililitre TC tamponu ile iki kez yıkayın ve her bir biyofilmdeki nükleik asitleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 mikrolitrelik bir sito dokuz damlası ile boyayın.
Örnekleri iki kez yıkadıktan sonra, her bir biyofilmdeki protein bileşenlerini 50 mikrolitre Cipro kırmızısı ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan koruyarak boyayın. Numuneleri üç kez yıkadıktan sonra, tedavi ve kontrol gruplarının biyofilmleri içindeki bileşen lekelerinin her birinin görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi ile görselleştirmelerini kolaylaştırmak için kuyu başına altı mililitre steril ultra saf su içeren altı kuyulu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir konfokal lazer tarama mikroskobunun lazerlerini, Eksor eşlenik boyama ile ekzo polisakkaritlerin tespiti için aşağıdaki ayarlara ayarlayın, sito dokuz boyama ile nükleik asitlerin tespiti için 633 nanometre lazer ve 659 ila 749 nanometre emisyon bandı kullanın.
488 nanometre lazer ve 495 ila 500 nanometre emisyon bandı kullanın ve proteinlerin Cipro kırmızı leke ile tespiti için 543 nanometre lazer ve 615 ila 651 nanometre emisyon bandı kullanın. Ardından, 0,9 sayısal diyafram açıklığına ve 2,2 milimetre çalışma mesafesine sahip 63 x daldırma lensi kullanarak. Aynı biyofilm içinde birden fazla lekenin görüntülerinin yakalanmasını optimize etmek için yığınlar arası modda sıralı tarama kullanarak 400 hertz'de konfokal lazer tarama mikroskobu görüntülerini toplayın.
Konfokal lazer tarama mikroskobu görüntülerini analiz ettikten sonra, her bir biyofilm içindeki üst üste binen bileşen lekelerinin yeniden yapılandırılmış bir 3B görüntüsünü oluşturmak için hız görüntü analiz yazılımındaki 3B oluşturucu menü seçeneğini kullanın. Ardından, biyofilmin en iyi görünümünü elde etmek için 3D görüntüyü döndürün. Ardından biyofilm rekonstrüksiyonunun bir anlık görüntüsünü yakalayın ve anlık görüntüyü uygun bir görüntü dosyası formatında dışa aktarın.
Son olarak, biyofilmler içindeki ekzo polisakkarit nükleik asit ve protein bileşenlerinin eşzamanlı dağılımının görsel bir analizini yapın. Yeniden yapılandırılmış görüntülerde, ISA 3D yazılımı kullanılarak biyo hacim ve ortalama biyofilm kalınlığı gibi biyofilm yapısal parametrelerinin hesaplanması, bu tabloda istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak hesaplanan biyofilm yapısal parametrelerinin ortalama ve standart sapma değerleri gösterilmektedir. Ağız gargarası ile muamele edilen biyofilmlerin yapısal parametreleri için kontrol grubundaki biyofilmlerden önemli ölçüde farklı olan ortalama ve standart sapma değerleri kırmızı karışık modellerde vurgulanmıştır.
İstatistiksel analizler, Biotene PBF gargarasının her iki reçine kompozitinde kontrol grubundan önemli ölçüde farklı biyofilm yapıları ürettiğini, Listerine total care gargarasının ise her iki reçine kompozitinde de önemli farklılıklar üretmediğini gösterdi, bu da iki gargara işleminden sonra kalan hücresel ve hücre dışı biyofilm bileşenlerindeki farklılıkları açıkça gösteriyor. Ekzo polisakkaritlerin, nükleik asitlerin ve proteinlerin biyofilmler içindeki eşzamanlı dağılımı, hız yazılımı kullanılarak oluşturulan 3D rekonstrüksiyonlar aracılığıyla görselleştirilebilir. Bu şekilde, 0.4'te büyütülen kontrol grubu biyofilmlerinin temsili bir rekonstrüksiyonu, mavi rengin ekzo polisakkarite atandığı gösterilmiştir.
S mutans biyofilmleri içinde, yeşil renk nükleik asitlere ve kırmızı renk proteinlere atanmıştır. Araya giren boşluk, floresan olarak etiketlenmemiş su veya diğer biyofilm bileşenleri tarafından işgal edilebilir. Bu şekilde, önceki şekille aynı bileşenleri temsil eden renklerle TPH üç reçine kompoziti üzerinde büyütülen kontrol grubu biyofilmlerinin temsili bir rekonstrüksiyonu gösterilmektedir.
Bu prosedür tıp, dişçilik, jeoloji ve deniz bilimleri gibi çeşitli disiplinlerde uygulama getirmiştir. Çünkü burada kullanılanların yerine birçok substrat ve biyofilm ikame edilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, biyofilmler içindeki hücresel ve hücre dışı bileşenlerin üç boyutlu dağılımlarını nicellendirmek ve karşılaştırmak için bir protokol sunar. Metodoloji, antibakteriyel ajanların biyofilm yapısı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu ve istatistiksel analiz kullanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Biyofilm Araştırması
- Antibakteriyel Tedaviler
Arka Plan
- Biyofilmler, mikrobiyal toplulukların oluşturduğu karmaşık yapılardır.
- Kompozisyonlarını anlamak, etkili antibakteriyel stratejiler geliştirmek için çok önemlidir.
- Mevcut yöntemler genellikle birden fazla bileşeni eş zamanlı olarak analiz etme yeteneğinden yoksundur.
- Bu çalışma, bu boşluğu yeni bir protokol ile doldurmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Antibakteriyel tedavi sonrası biyofilm bileşenlerinin dağılımlarını nicellendirmek ve karşılaştırmak.
- Detaylı analiz için ileri görüntüleme tekniklerini kullanmak.
- Biyofilmlerin antibakteriyel ajanlara tepkilerini daha iyi anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Rezin kompozit numunelerin hazırlanması ve parlatılması.
- Numuneler üzerinde biyofilmlerin büyütülmesi ve ardından antibakteriyel tedavi.
- Görüntüleme için biyofilmlerin florokromlarla boyanması.
- Biyofilm yapısal parametrelerinin istatistiksel analizi.
Ana Sonuçlar
- Konfokal mikroskopi kullanarak birden fazla biyofilm bileşeninin başarılı görüntülemesinin gerçekleştirilmesi.
- Nicel analiz, tedavi ve kontrol grupları arasında önemli farklılıklar ortaya koymuştur.
- 3D rekonstrüksiyon yoluyla biyofilm yapılarının daha iyi görselleştirilmesi sağlanmıştır.
- İstatistiksel analiz, tedavi koşullarında biyofilm davranışları hakkında içgörüler sağlamıştır.
Sonuçlar
- Protokol, biyofilm bileşenlerini ve dağılımlarını etkili bir şekilde karakterize eder.
- Tedavilere yönelik biyofilm tepkilerini incelemek için kapsamlı bir yaklaşım sunar.
- Bu metodoloji, çeşitli biyofilmle ilgili araştırma alanlarına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This methodology addresses a critical gap in biofilm research by enabling concurrent quantification of three key components—extracellular polymeric substances, nucleic acids, and proteins—within 3D biofilm architecture. For biopharma R&D, this supports mechanistic de-risking of antimicrobial candidates by providing multi-parametric structural readouts that reflect functional biofilm integrity. The approach enhances predictive confidence in lead identification by linking compound treatment to concurrent changes in biofilm composition and thickness, informing go/no-go decisions earlier in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of antimicrobial effects on multiple biofilm constituents simultaneously, clarifying mechanism of action beyond single-component assays.
- Operational Value: Provides quantitative structural parameters (biovolume, mean thickness) that support hypothesis testing and target validation in antimicrobial screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible 3D imaging and quantification workflows for evaluating compound efficacy against complex biofilm structures.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through distinct but interconnected staining, imaging, and analysis steps compatible with high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by allowing comparison of biofilm architecture across substrates and treatment conditions, relevant to oral and mucosal infection models.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying structural changes in biofilm components that correlate with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization, providing structural phenotyping data that informs mechanistic understanding and preclinical translation of antimicrobial agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing how treatments differentially affect biofilm matrix, nucleic acid, and protein distribution.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs (biovolume, thickness) that enable reliable comparison of compound effects across biofilm components.
- Analytics: Provides structural parameter measurements and statistical analysis capabilities (mixed models) that help teams compare conditions and assess significance.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling structural comparison of biofilms grown on clinically relevant substrates like dental resins.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform applicable across antimicrobial, antifouling, and biofilm-disrupting compound programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through concurrent, multi-component structural analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized staining, imaging, and statistical analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by delivering multi-parametric data that better reflect biofilm complexity than single-readout assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that significantly alter biofilm architecture across multiple components.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal laser scanning microscopy, fluorescence staining, and 3D image analysis software (e.g., ISA3D, Velocity).
- Dependent on access to CLSM with specific laser and emission band settings for multiplex fluorophore detection.
- Necessitates cross-team standardization of biofilm growth, staining, and imaging protocols to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different microbial strains, biofilm models, or substrate types beyond S. mutans on dental resins.
- Practical limitations include spectral overlap challenges in dye selection and computational complexity in quantifying multiple fluorochromes, as noted in the source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:45
Specimen Fabrication
2:23
Biofilm Growth
4:00
Antibacterial/Mouthwash Treatments
4:33
Staining
5:36
Imaging Using Confocal Laser Scanning Microscopy
6:55
Biofilm Visualization and Structural Analysis
7:56
Results: Representative Biofilm Component Staining for Mouthwash Treatment and Control Groups
9:52
Conclusion
