Poli (ε-kaprolakton) electrospun İplik İnsan Mezenkimal Kök Hücre Ek Optimize
10 Nisan 2015
Bu makale, insan mezenkimal kök hücrelerinin, bilinen tohumlama yoğunluğuna kıyasla başlangıçta bağlanan hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak ve ölçmek için standart kültür kuyusu plakalarının tabanını kaplamayan malzemelere, bu durumda elektro eğrilmiş ipliklere tohumlanması için bir dizi kurulumu açıklamaktadır.
Bu prosedürde, elektro eğrilmiş PCL iskeleleri, optimal bir hücre tohumlama kurulumunu belirlemek için farklı şekillerde kurulur. İlk olarak, steril iskeleler, hücre kültürü ekleri, oluklar ve biyoreaktör döner kapları dahil olmak üzere araştırılan farklı kurulumlara yerleştirilir. Yerleştirildikten sonra, bilinen sayıda hücre iskeleye ekilir ve daha sonra 20 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakılır.
Daha sonra tüm numuneler dikkatlice bir inkübatöre taşınır,% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derece ayarlanır ve saatler önce statik veya dinamik koşullara tabi tutulur. Bu kültür süresini takiben, iskeleye bağlanan hücre sayısı, iskele ortamındaki hücre miktarını ve kuyu fraksiyonlarını ölçmek için bir DNA tahlili ile belirlenir. Sonuçta bu, hücrelerin iskelelere yapışmasını görmek için iskelede, kuyuda ve çevredeki ortamda bulunan DNA'nın ölçülmesiyle elde edilir, taramalı elektron mikroskobu veya SEM kullanılır.
Bu araştırma fikrine ilk olarak, iskelelerimizin kuyu plakasının tüm tabanını kaplamadığını bildiğimizde aklımıza geldi, bu da tüm hücrelerin iskele ile temas halinde olmaması ve dolayısıyla bağlanabilmesi ihtimali olduğu anlamına geliyordu. Başlamak için, steril altı kuyulu hücre kültürü eklerini açarak ve dişlerle daha kısa halkaları daha geniş halkalı gövdelerden ayırarak hücre kültürü eklerini lamina akışı altında ayarlayın. Ardından yüzüğü dişleri yukarı bakacak şekilde alın ve dört santimetrelik iskelelerden birini yüzüğün ortasına asın, her iki tarafta da üst üste geldiğinden emin olun.
Halkalı gövdeyi alın ve diş halkasının ve iskelenin üzerine yerleştirin. Ardından, iskelenin yerinde kaldığından ve hücre kültürünün merkezinden geçtiğinden emin olarak aşağı doğru itin. Sokmak. İskele ile hücre kültürü ekini altı kuyulu düşük bir bağlama plakasının kuyusuna yerleştirin ve iskeleye 10 mililitre kültür ortamı ekleyin.
Daha sonra politetrafloroetilen oluklarını ayrı Petri kaplarına yerleştirin ve oluğa 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Forseps kullanarak, üç santimetrelik iskelelerden birini oluğun içine sarkıtın ve uzunluğunun oluğun uzun kenarına paralel olduğundan emin olun. Biyoreaktör kabını lamina akışı altında kurmak için, biyoreaktör kabının ana portundan 10 mililitre steril fosfat tamponlu salin veya PBS dağıtın.
10 dakika sonra, PBS'yi çıkarın ve forseps kullanarak sekiz mililitre kültür ortamı ile değiştirin. Üç santimetrelik iskelelerden birini ana liman üzerinden gemiye yerleştirin. Ardından ana bağlantı noktasından poz verin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi insan mezenkimal kök hücre sayımını gerçekleştirdikten sonra, hücre peletini bırakarak ortamı santrifüj tüpünden aspire edin ve hesaplanan ortam hacmi ile değiştirin. Resus, eşit bir karışım için hücreleri ve ortamı askıya alır. Bir P 200 Gilson pipeti kullanarak, pipetin ucunu iskele uzunluğu boyunca ve ortam sıvı yüzeyinin altında gezdirerek her bir iskeleye 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu yavaşça dağıtın.
20 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın, aksi takdirde biyoreaktör kapları ana porttan 200 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtır. Toplam 10 mililitre hacim elde etmek için kalan iki mililitre kültür ortamını şırınga portları ile doldurun. Ardından, biyoreaktör kaplarını döner kap biyoreaktörüne aktarın ve dönmeye ayarlayın.
Dokuz RPM'de, hücre kültürü ekleri ve olukları olan kuyu plakalarını çalkalayıcı plakaya aktarın ve 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatöründe veya statik kültürde 30 RPM'de dönecek şekilde ayarlayın. Hücre kültürü ekleri ve olukları ile kuyu plakalarını bir hücre kültürü inkübatörünün rafına aktarın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak ayarlayın.
Dört saat sonra, numuneleri inkübatörden çıkarın ve lamina akışının altına yerleştirin. Ardından, ortam fraksiyonlarını tüm numunelerden çıkarın ve ayrı olarak etiketlenmiş santrifüj tüplerine yerleştirin. 241 kez G'de beş dakika santrifüjlemenin ardından, üç mililitre lizis tampon girdabı eklemeden önce supinatı çıkarın, hücre peletini hücre kültürü ekleri içinde tutulan iskeleleri parçalamak için çözelti İlk olarak, iskeleyi bir iskele kullanarak kesici uç kenarına yakın keserek iskeleyi serbest bırakın.
Daha sonra forseps kullanarak, iskeleleri çıkarın ve üç mililitre lizis tamponu içeren santrifüj tüplerine yerleştirin. Daha sonra her iskele kabına üç mililitre lizis tamponu ekleyin ve yüzeyi kazıyın. Lizis tamponunu çıkarın ve ayrı olarak etiketlenmiş santrifüj tüplerine yerleştirin.
Yeterli ajitasyonu sağlamak ve hücre zarının parçalanmasını teşvik etmek için her bir santrifüj tüpünü yaklaşık bir dakika vorteksleyin. Siyah 96 oyuklu bir plakada, her bir numune fraksiyonu iskele ortamı için 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve daha sonra karanlıkta, lizis tamponu içeren tüm oyuklara 100 mikrolitre hücre DNA çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Kuyucuk plakası için negatif ve pozitif bir kontrol sağlamak için DNA ve hücre DNA çözeltisi içermeyen lizis tamponu olan kuyuları nazikçe dahil edin.
Bir floresan plaka okuyucu kullanarak, 485 nanometre uyarma ve 520 nanometre emisyonda kuyuların emilimini ölçün. SEM fiksasyonunu gerçekleştirmek için verileri, üreticinin talimatlarına göre DNA standartlarından oluşturulan standart eğri ile karşılaştırın. Dört saatlik inkübasyondan sonra, tüm iskeleleri yuvalarından çıkarın ve yeni bir altı kuyulu plakanın ve bir lamina akışının ayrı kuyucuklarına yerleştirin.
Daha sonra iskeleleri her birine PBS ile iki kez yıkayın. İskelede tam kapsama sağlamak için PBS'ye iki mililitre% 1.5 glutaraldehit ekleyin. Hücre fiksasyonu için plakayı dört santigrat derecede en az 30 dakika bırakın.
Fiksatif solüsyonu çıkarın ve iskeleleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra iskeleleri, damıtılmış suda artan etanol konsantrasyonları ile kurutmak için yeni bir kuyu plakasına aktarın,% 50 etanol ile başlayarak,% 70 ve daha sonra her konsantrasyon için% 90. İskeleleri tamamen çözeltiye batırın ve çözeltiyi atmadan ve tekrarlamadan önce üç dakika bekletin.
İskeleleri tamamen çözeltiye batırarak ve beş dakika bekleterek iskeleleri% 100 etanol içinde kurutduktan sonra, çözeltiyi atın ve iskeleleri kimyasal olarak kurutun. HMDS'yi çeker ocak içinde kullanma. İskeleleri HMDS'ye daldırın ve bir kez tekrarladıktan sonra HMDS'yi çıkarmadan önce beş dakika bekletin.
HMDS'yi çıkarın ve iskelelerin kurumasını bekleyin. Ardından, SEM kaplaması içinde görüntülemeyi kolaylaştırmak için iskeleleri ticari olarak mevcut SEM saplamalarına monte edin, numuneler ince ve eşit bir kapsama alanı sağlamak için iki dakika boyunca altın bir gözcü kaplaması ile monte edin. Son olarak, numuneleri SEM'in içine yerleştirin ve beş kiloluk bir elektron kasası elektron ışını kullanarak hücreye oturan iskeleleri görselleştirin.
Sonuçlar, araştırılan her deney düzeneği için tohumlamadan dört saat sonra hücrelerin konumunu vurgulamaktadır. Bu şekil, tüm tohumlama kurulumlarının araştırıldığı bu süre zarfında iskele yüzeyine bağlanan hücrelerin yüzdesini göstermektedir. Hücre bağlanma yüzdesi nispeten düşüktür, ancak hücre kültürü ekleri içinde tutulan ve 30 RPM'de çalkalanan iskeleler için en büyük hücre yapışması.
En düşük aderans, hücre kültürü ekleri içinde tutulan ve statik koşullar altında tutulan iskeleler içindi. Medya fraksiyonu içinde, özellikle hücre kültürü için çok sayıda hücre mevcuttu. %50'de düşük bağlama plakaları ve %51'de döner kaplar içinde tutulan kesici uçlarOluklar içinde tutulan iskeleler, tutucunun kendi içinde bulunan hücre sayısının arttığını gösterdi.
Oluk çalkalayıcı için %48 ve oluk statik tarama için %50. Elektro mikroskopi, hücre tohumlu iskelelerin görsel olarak değerlendirilmesine izin verdi. Temsili görüntüler, tohumlama kurulumundan bağımsız olarak lifli yüzeyde sınırlı bir hücre varlığını vurguladı.
Bununla birlikte, hücre kültürü ekleri içinde tutulan ve 30 RP M'de çalkalanan iskelelerde daha fazla sayıda hücre ve hücre aglomerası mevcuttu.Bu videoyu izledikten sonra, bilinen sayıda hücrenin tohumlanmasının, özellikle vahşi plakaların tüm tabanını kaplamayan iskeleler için, iskeleye gerçekten bağlanan çok sayıda hücreye eşit olması gerekmediğini iyi anlamalısınız. Bu gibi iskeleler için, iskeleye ilk hücre bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için önce farklı hücre tohumlama kurulumlarının optimize edilmesi önerilir.
Genel Bakış
Bu makale, standart kültür kuyu plakalarına kıyasla hücre yapışmasını artırmayı amaçlayarak, insan mezenkimal kök hücrelerini elektrospun iplikler üzerine yerleştirmek için çeşitli kurulumları açıklamaktadır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Malzeme Bilimi
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler) rejeneratif tıpta potansiyel taşır.
- Köprü yapılarına hücre yapışması, doku mühendisliği uygulamaları için kritiktir.
- Standart kültür plakaları, köprü tasarımı nedeniyle hücre yapışmasını optimize etmeyebilir.
- Elektrospun malzemeler hücre büyümesi için uygun bir ortam sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Elektrospun köprüler üzerine hMSC'lerin yerleştirilmesi için optimal kurulumları araştırmak.
- Farklı kültür koşulları altında hücre yapışma verimliliğini kantitatif olarak belirlemek.
- Hücre kültüründe köprü tasarımı hakkındaki anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çeşitli yapılandırmalarda elektrospun PCL köprülerinin kurulumu.
- Hücrelerin statik veya dinamik koşullar altında köprülere yerleştirilmesi ve inkübasyonu.
- DNA analizleri ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hücre yapışmasının kantitatif analizi.
- Deneyler için hücre kültürü insertleri, olukları ve biyoreaktör kaplarının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Farklı köprü kurulumları, yapışan hücrelerin sayısını etkilemiştir.
- Kantitatif analiz, hücre yapışmasının değişken verimliliğini ortaya koymuştur.
- SEM, köprüler üzerinde hücre yapışmasının görsel doğrulamasını sağlamıştır.
- Deneylerle hücre yerleştirme için en uygun koşullar belirlenmiştir.
Sonuçlar
- Köprü tasarımı, hMSC yapışmasını ve büyümesini önemli ölçüde etkiler.
- Dinamik kültür koşulları, statik kurulumlara kıyasla hücre yapışmasını artırabilir.
- Köprü yapılandırmalarının daha fazla optimizasyonu, doku mühendisliği sonuçlarını iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of cell attachment to biomaterial scaffolds is critical for early-stage tissue engineering and regenerative medicine R&D. This study demonstrates that seeding density does not reliably predict actual cell adherence, especially when scaffold geometry limits cell-scaffold contact. Optimizing attachment protocols enhances predictive confidence in downstream assay development and supports robust portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of cell-material interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by quantifying true cell attachment versus nominal seeding.
- Supports predictive confidence in scaffold-based model systems for early discovery.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, reproducible biological scaffolds for compound screening.
- Improves assay standardization by quantifying actual cell input on test materials.
- Enables reliable evaluation of cell-material compatibility for platform scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro scaffold models with translational biomarker strategies by ensuring consistent cell attachment.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by reducing variability in cell-based assays.
- Provides mechanistic de-risking for scaffold-based therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
This method is positioned at the interface of early discovery and assay development, informing both target validation and screening readiness for scaffold-based systems.
- Discovery Biology: Quantitative DNA assays clarify cell-scaffold interaction hypotheses and support biological de-risking.
- Screening: Standardized attachment protocols enable reproducible, quantitative assay outputs for compound evaluation.
- Analytics: DNA-based measurements provide objective readouts for comparing seeding setups and optimizing workflows.
- Translational Research: Consistent cell attachment underpins reliable preclinical model development when supported by scaffold-based systems.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable across scaffold types and cell sources, supporting broad R&D reuse.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in scaffold-based discovery.
- Operational Value: Drives standardization and reproducibility in cell seeding and attachment quantification.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of tissue engineering assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying true cell-material engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, scaffold handling, and quantitative DNA assays.
- Needs access to fluorescence plate readers and SEM for analytical validation.
- Demands cross-team standardization of seeding and attachment protocols.
- Adaptable to various scaffold geometries and cell types with protocol optimization.
- Attachment efficiency may be limited by scaffold coverage and dynamic culture conditions.
