Fenotiplendirme Fare Solunum Fonksiyon İn Vivo Akciğer Yayıcı Kapasite
6 Ocak 2015
Farelerde akciğer yayılma kapasitesini hızlı ve basit bir şekilde ölçmenin bir yolunu tarif ediyoruz ve bunun birden fazla yaygın akciğer patolojisindeki fenotip değişikliklerine yeterince duyarlı olduğunu gösteriyoruz. Bu nedenle bu metrik, fare modellerine doğrudan öteleme ilgisi getirir, çünkü yayılma kapasitesi insanlarda da kolayca ölçülür.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, kalibre edilmiş bir gaz kromatografı kullanarak bir farenin akciğerlerinin yayılma kapasitesinin nasıl ölçüleceğini öğrenmektir. Bu, anestezi uygulanmış bir farenin akciğerlerinin neon ve karbon monoksit içeren gazla şişirilmesi, gazın akciğerlerde dokuz saniye tutulması ve gazın toplanmasıyla gerçekleştirilir. Akciğerlerden çekilen gaz daha sonra iki mililitreye seyreltilir ve gaz kromatografına enjekte edilir.
Akciğerdeki neon ve karbon monoksitin diferansiyel alımı, yayılma kapasitesini hesaplamak için kullanılır. Bu ölçüm, geniş bir akciğer hastalığı modelleri yelpazesinde akciğer fonksiyon kaybını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin, farede solunum fonksiyonunu ölçmek için mevcut diğer tüm yöntemlere göre temel avantajı, bunun insanlarda benzer ölçümlerle doğrudan karşılaştırılabilen çok basit, tekrarlanabilir bir ölçüm olmasıdır.
Bu yöntem, çeşitli akciğer patolojileri ile ortaya çıkan akciğer yapısındaki değişiklikleri takip etmek için kullanılabilir. Bu protokol, nitrojen, oksijen, neon ve karbon monoksit tepe noktalarını ölçmek için makineyle birlikte verilen gaz kromatograf modülünün kurulmasıyla başlar. Bu uygulama için sadece neon ve karbon monoksit verilerine ihtiyaç vardır.
Cihaz, taşıyıcı gaz olarak helyum içeren bir moleküler elek sütunu kullanır. Bu özel gaz kromatografı 0.8 mililitrelik bir kolona sahiptir ve başlamadan önce bu kolonun yeterli şekilde temizlenmesini sağlamak için iki mililitrelik bir numune kullanılır. Bir dizi ölçüm, makineyi her zaman doğrudan gaz numune torbasından iki mililitre gaz kullanarak kalibre eder.
Ortaya çıkan ilk tepe neon, daha sonra bu prosedür için ölçmediğimiz oksijen ve nitrojendir. Son olarak, karbon monoksit zirvesi, gaz kromatografının zamanı olarak görünür. Tüm bu zirveleri ölçmek bir dakikadan biraz daha azdır.
Başlamak için, fareleri ketamin ve ksilazin ile uyuşturun. Bir ayak parmağı tutamına yanıt olarak refleks hareketinin olmaması ile anesteziyi onaylayın. Gözleri korumak için daha sonra veteriner merhemi sürün, ardından fareleri bir studen kanülü ile trakeostomi yapın.
Yetişkinler için 18 gauge kanül veya çok genç fareler için 20 gauge kanül kullanın. Ardından, metronomu her saniye sesli tıklamalarla başlatın. Altı haftadan daha eski fareler için, gaz karışım torbasından 0,8 mililitre gaz çekmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın.
Fare dört haftadan küçükse, 0,4 mililitre gaz kullanın, ardından şırıngayı trakeal kanüle bağlayın ve akciğerleri hızla şişirin. Metronom tıklamalarıyla senkronize olarak zihinsel olarak birden 10'a kadar saymaya başlayın. Sayım 10'a ulaştığında, 0,8 mililitrelik hacmi hızla geri çekin.
Solunan bu gazı en az 15 saniye oda, hava ve ağırlık ekleyerek iki mililitreye seyreltin. Akciğerleri mümkün olduğunca çabuk şişirmek ve söndürmek çok önemlidir. Hızlı bir şişirme çok kolaydır, ancak 0.8 mls'yi hızlı bir şekilde hassas bir şekilde geri çekmek biraz pratik gerektirir, ardından tüm numuneyi gaz kromatografına enjekte edin.
Analiz için, hayvana ve hayvandan gaz kromatografına aktarılırken numunenin kontaminasyonunu önlemek önemlidir. Bu, GC numuneyi ölçerken işareti bir parmakla kapatarak dikkatli bir şekilde yapılabilir. Fare akciğerini torbadan başka bir 0,8 mililitre gaz karışımı ile şişirin ve ardından bu numuneyi ilkiyle aynı şekilde işleyin.
İki ölçümden elde edilen ortalama değerleri kullanarak DFCO'yu hesaplayın. C alt simgesi, kalibrasyon gazlarını ifade eder ve dokuz alt simge, hayvandan toplanan numuneleri ifade eder. Dokuz saniyelik nefesten sonra tutun.
C 57 siyah altı fareden alınan nominal kontrol DFCO değeri yaklaşık 0.77'dir. PR sekiz influenza modeli kullanılarak yapılan bir çalışmada, elastaz kurulumundan 21 gün sonra amfizem modelinde altıncı ve sekizinci günlerde ilerleyici bir fonksiyon kaybı görülmüştür. DFCO orta derecede azaldı, ancak Blio Mycin kurulumunun neden olduğu fibroz modelinde çok daha büyük değişiklikler oldu.
Bleomisinin neden olduğu fibrotik yol, patolojik modellerin herhangi birinde gözlenen DFCO'daki en büyük değişikliğe neden oldu. Bu önemlidir, çünkü yayılma kapasitesi aynı zamanda insanlarda fibrozun güvenilir bir belirtecidir. CFTR geni, kistik fibrozda çok önemli bir rol oynar ve bu genin eksik olduğu fareler üzerinde yapılan bir çalışmada, DFCO'da önemli bir azalma olmuştur.
DFCO, bu nakavt farelerde mantar enfeksiyonu ile daha da azaldı. Akciğer hasarı için yaygın olarak kullanılan bir model LPS'den kaynaklanır. LPS'ye maruz kalan farelerde, DFCO ölçümleri ile değerlendirildiği gibi bir günden dördüncü güne kadar ilerleyen zamana bağlı akciğer fonksiyon kaybı olmuştur, DFCO ölçümü iki haftalık kadar genç farelerde başarılı bir şekilde yapılabilir.
Akciğerin daha küçük boyutu, 0,4 mililitrelik daha küçük bir şişirme hacmi gerektirir. Bu daha küçük hacimle ölçülen DFCO, bir kez ustalaştıktan sonra akciğer olgunlaştıkça beklenen artışı gösterebilir. Bu teknik, diğer herhangi bir solunum fonksiyon ölçümü veya değerlendirmesi yapmadan önce fare başına sadece birkaç dakika içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, şişirme ve indirme adımının hızlı bir şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak ve kontaminasyonun önlenmesi için numuneyi aktarırken dikkatli olmak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kalifiye edilmiş bir gaz kromatografı kullanarak farelerde akciğer difüzyon kapasitesini ölçmek için bir yöntemi açıklar. Teknik, çeşitli akciğer patolojilerinde fenotipik değişikliklere duyarlıdır ve bu da onu çeviri araştırması için uygun kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Solunum Fizyolojisi
- Çeviri Araştırması
Arka Plan
- Akciğer difüzyon kapasitesi, pulmoner fonksiyonun kritik bir ölçüsüdür.
- Fare akciğer fonksiyonunu ölçmek için mevcut yöntemler karmaşık olabilir.
- Fare ve insanlar arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar, çeviri açısından önemlidir.
- Etkili araştırmalar için basit ve tekrarlanabilir tekniklere ihtiyaç vardır.
Çalışmanın Amacı
- Fare akciğer difüzyon kapasitesini ölçmek için basit bir yöntem geliştirmek.
- Çeşitli akciğer hastalığı modelleri boyunca akciğer fonksiyon kaybını değerlendirmek.
- Fare ve insanlar arasındaki pulmoner fonksiyon ölçümlerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Anestezi altındaki fare akciğerlerine neon ve karbon monoksit içeren bir gaz karışımı enflasyonu.
- Toplamadan önce gazı dokuz saniye boyunca akciğerlerde tutmak.
- Toplanacak gazın analiz için iki mililitreye seyreltilmesi.
- Gazların diferansiyel alımını ölçmek için gaz kromatografının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, akciğer difüzyon kapasitesinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar.
- Çeşitli patolojilerle ilişkili akciğer fonksiyonundaki değişikliklere duyarlıdır.
- Teknik basit ve tekrarlanabilir olup, araştırmada uygulanabilirliğini artırır.
- Sonuçlar, insanlarda yapılan benzer ölçümlerle doğrudan karşılaştırılabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, fare modellerinde akciğer fonksiyonunu değerlendirmek için değerli bir araç sunar.
- Bu, fareler ve insanlar arasındaki ölçümleri birleştirerek çeviri araştırmasını destekler.
- Gelecekteki çalışmalar, bu tekniği kullanarak akciğer patolojilerini daha etkili bir şekilde araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
