Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Bu videonun genel amacı, kemik şartlandırılmış ortamın nasıl hazırlanacağını ve aktivitesini in vitro olarak nasıl test edeceğini açıklamaktır. Bu, önce bir kemik kazıyıcı kullanılarak bir domuz mandibulasından kemik parçalarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, 24 saat boyunca kültür ortamında inkübe etmeden önce kemik parçalarını ısıl işleme tabi tutmak, demineralize etmek veya hiçbir şey yapmamaktır.

Daha sonra, kemik parçalarından salınan tüm faktörleri içeren kemik şartlandırılmış ortam toplanır. Son adım, hücreleri kemik şartlandırılmış besiyeri ile uyarmak veya inkübasyon periyodunu takiben üzerinde kemik şartlandırılmış besiyeri ve tohum hücreleri bulunan bir biyomateryali ön inkübe etmektir. Sonuç olarak, tedaviyi takiben hücrelerin gen ekspresyonundaki değişiklikleri göstermek için kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılır.

Otolog kemik greftlerinin tek başına veya diğer biyomateryallerle kombinasyon halinde kullanılması, implant çevresi kemik defektlerinde kemik rejenerasyonunu uyarır ve böylece uzun vadeli iyi sonuçlar sağlar. Bu video, kemik durumundaki biyomoleküllere kütle hücrelerinin genetik tepkisini belirlemede yararlı olan bir in vitro biyo-tahlil sunmaktadır. Orta Kemik durumu ortamı, otolog kemiğin neden kemik rejenerasyonunda standart greftin hedefi olduğu gibi travma, maksillofasiyal ve dental alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Isıl işlem görmüş kemik oto grefti veya ize kemik matriksi gibi işlenmiş kemikten kondisyon ortamının hazırlanmasının standardize edilmesi zor olabilir. Bu nedenle, kesin olmak önemlidir. Başlamak için yerel bir kasaptan taze domuz mandibulaları alın ve sağlam bir yüzeye yerleştirin.

Daha sonra, kemiğe bağlı yumuşak dokuların hiçbirini bırakmamaya özellikle dikkat ederken, tam kalınlıkta bir periost flebini serbest bırakmak için bir periost kullanın. Periosteum çıkarıldıktan sonra, kemik sıyırıcıyı sıkıca tutun ve mandibulanın bukkal tarafından kemik parçaları toplamak için uzun hareketler kullanın. Uzunluğu bir milimetreden küçük olan kemik parçalarından herhangi birini atın.

Kemik parçacıklarını 10 santimetrelik bir Petri kabında hızlı bir şekilde kültür ortamı ile kaplayarak kurumasını önleyin. Yeterli kemik yongası toplandıktan sonra, beş gram kemik yongasını pastörize ederek bir termal kontrol partisi hazırlayın. Cipsleri 80 santigrat derecede 30 dakika ısıtarak pastörize edin veya 121 santigrat derecede 20 dakika otoklavlayın.

Daha sonra, bir molar hidroklorik asit çözeltisine beş gram kemik yongası ekleyerek ve bunları dört santigrat derecede dört ila altı saat boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek demineralize bir kontrol hazırlayın. Daha sonra kemik parçalarını nötr bir pH'a ulaşana kadar kültür ortamı ile tekrar tekrar yıkayın. Beş gram taze kemik cipsi ve kontrol preparatlarının her birinden beş gram ayrı tabaklara koyun ve her yemeğe 10 mililitre taze kültür ortamı ekleyin.

Daha sonra, ertesi gün şartlandırılmış ortamı oluşturmak için numuneleri 37 santigrat derecede 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ortamı her tabaktan çıkarın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için kemikle şartlandırılmış ortamı 200 kez yerçekiminde 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı çıkarın ve 0.2 mikron steril bir filtreden geçirin, Ali dörtlülerini ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede donmuş olarak saklayın. Kemik hücreleri veya diş eti ve periodontal ligament fibroblastları gibi insan mezenkimal hücrelerini, santimetre kare başına 30.000 hücre konsantrasyonunda 12 balina plakasına ekerek başlayın. Hücreleri büyüme ortamı ile örtün ve hücrelerin ertesi sabah gece boyunca plakaya yapışmasına izin verin.

Kültür ortamını atın ve hücreleri 37 santigrat derecede ön ısıtma PBS ile yıkayın. Daha sonra,% 20 kemik şartlandırılmış ortam olan ve olmayan ön ısıtma serum içermeyen kültür ortamı ekleyerek hücreleri uyarın. Bir biyomateryalin emilim kabiliyeti de test ediliyorsa, ilgilenilen biyomateryali içeren tüplere herhangi bir kontrol de dahil olmak üzere kemik şartlandırılmış ortamı ekleyin ve tüpleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra biyomateryali önceden ısıtılmış PBS ile kuvvetlice durulayın ve insan mezenkimal hücrelerini malzeme üzerine santimetre kare başına 30.000 hücre konsantrasyonunda tohumlayın. Hücreleri tek başına veya biyomalzemeler üzerine ekilen hücreleri, 24 saat boyunca 37 derece hücre CS'de nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ardından kültür ortamını atın.

Hücreleri ön ısıtma PBS ile durulayın ve standart bir RNA izolasyon protokolü kullanarak hücre RNA'sını çıkarın. RNA izole edildikten sonra, ekstrakte edilen RNA'nın eşit konsantrasyonları ile başlayarak ve her numune üzerinde bir ters transkriptaz reaksiyonu çalıştırarak her tedavi grubunun CD NA numunelerini hazırlayın. Ardından, ekteki metin protokolünde listelenen primerleri ve koşulları kullanarak seçilen genlerin seviyelerini aramak için numuneler üzerinde kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.

Son olarak, delta delta CT yöntemini kullanarak genlerin temizlik geni Gabb dh'ye döngü eşik seviyelerine normalize ederek nispi gen ekspresyon seviyelerine dayalı olarak kemik şartlandırılmış ortamın kalitesini hesaplayın. İşte 24 saat boyunca kemik şartlandırılmış ortama maruz kalan oral fibroblastların gen ekspresyonundaki değişiklikleri gösteren bazı tipik sonuçlar. İki gen adrenalin ve pent trax ve üçünün her ikisi de orijinal seviyelerin %40'ına önemli ölçüde düşürülürken, interlökinler 11 ve 33, N-A-D-P-H oksidaz dört ve prote glikan dört ile birlikte 200 kata kadar yukarı regüle edildi.

İlginç bir şekilde, kemik yongalarını çevredeki yumuşak dokudan korumak için kullanılan kollajen bariyer membranları, gen ekspresyonundaki değişikliklerden sorumlu olan kemik şartlandırılmış ortamın çoğunu emer. Bununla birlikte, kollajen zarları, interlökin 33 ekspresyonunu kontrol eden faktörleri absorbe edemedi. Bu nedenle, interlökin 33 ekspresyonu bu ayarda düzenlenmemiştir.

Burada açıklanan protokol, kemik rejenerasyonunu içeren farklı hücre tiplerinin tepkisini incelemek için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol işlem kemikten ve diğer kemik dolgu maddelerinden kondisyon ortamı hazırlamak için kullanılabilir. Bu biyo-tahlilin klinik önemi belirsizliğini korumaktadır.

BCM'ye in vivo hücresel yanıt muhtemelen daha karmaşıktır ve burada sunulanları genişleten geniş bir gen spektrumu ve farklı hedef hücreler içerir. Bununla birlikte, biyo-tahlilimiz, kemik RAF moleküllerinin muhtemelen karmaşık bileşimi ve in vitro hücresel yanıt hakkında ilk bilgileri sağlar.