Name: Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, domuz çene kemiğinden kemik koşullu ortam hazırlama ve hücre kültürlerinde biyolojik aktiviteyi test etme yöntemini. Bu teknik, kemik biyolojisi ve doku mühendisliği araştırmalarında gen ifadesi değişikliklerini analiz etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, yetenekli yardımı için Catherine Solioz'a teşekkür eder.

1. BCM Hazırlık <ol><li> Mümkün olduğunca taze yerel kasap domuz çene kemiklerini edinin. Sağlam bir yüzeye yerleştirin altçeneleri ve tam kalınlıkta flep herhangi bir yumuşak doku bırakın veya kemiğe bağlı periost değil özel dikkat bırakın. Akış kaputu altında çalışmak gerek kalmadan temiz bir ortamda çalışın. </li><li> Tam kalınlıkta flep yayımlandıktan sonra, bukkal taraftan kemik cips hasat kemik kazıyıcı kullanın. Kemik kazıyıcı keskin olması gerektiğini lütfen unutmayınız. Sıkıca kemik kazıyıcı Kulp ve uzun hareketler kemik toplamak ile. Daha küçük o 1mm kemik cips atın. <ol><li> Doğal kemik parçası muhafaza edilmesi için,% 1 antibiyotik ve bunları kurumasına izin vermeden antimikotik ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle ortamı (DMEM) olan 10 cm çaplı plastik tabaklar doğrudan kemik parçası yerleştirin. </li><li> Isıl işlem etkisini değerlendirmek için, söz konusu kemik cipsi, 80 ° C&#39;de 30 dakika boyunca pastörizasyon ya da121 ° C&#39;de 20 dakika süreyle otoklav. </li><li> , Mineralden arındırma etkisini değerlendirmek, 4 ° C&#39;de 4-6 saat boyunca 1 M HCI kemik yongaları çalkalayın ve pH nötr olana kadar, kültür ortamı ile tekrar tekrar yıkamak için. </li></ol></li><li> Yeni bir plastik çanak içine% 1 antibiyotik ve antimikotik ile desteklenmiş 10 ml taze DMEM başına kemik yongaları 5 g toplam yerleştirin. </li><li> 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir atmosferde plastik tabaklar yerleştirin. Sonra, hasat BCM. Santrifüj, artığın ayrılması steril (0.2 mil) filtre ve -80 ° C&#39;de dondurulur alikotları tutmak için 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de BCM. </li><li> Kullanımdan hemen önce, BCM stok çözülme ve dondurma ve eritme tekrar döngülerinden kaçınmak. </li><li> Belirtilen deneyler için, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile, BCM ya da serum içermeyen ortam ile kolajen zarları ıslatın. PBS ile kuvvetli bir şekilde membranlar yıkayın ve 96 gözlü levhalar içine yerleştirin. Islak membranlar hücreleri ile tohumlanır. </li><li> BCM hazırlık süreci Şekil 1&#39;de özetlenmiştir. </li&gt; </ol> Mezenkimal Hücreler dayanarak 2. biyolojik tayinler <ol><li> / Cm2 30,000 hücrelik bir konsantrasyonda olan bir 12-çukurlu plaka içinde (örneğin, kemik hücreleri, diş eti ve periodontal ligament fibroblastlar için) Tohum insan mezenkimal hücreler. Hücreler DMEM oluşan büyüme ortamı,% 10 fetal buzağı serumu ve antibiyotiklerin kullanımı tohum. Hücreler plaka O / N eklemek edelim. </li><li> Kültür ortamı atılır ve 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış hücrelerin PBS ile yıkayın. Ve% 20 BCM olmayan önceden ısıtılmış serum içermeyen kültür ortamı eklenerek hücrelerini uyarır. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir atmosferde hücreleri yerleştirin. </li><li> , Kültür ortamı atın önceden ısıtılmış PBS ile hücreleri durulayın ve tercih protokole göre RNA ayıklayın. </li><li> Her örnek için RNA ile aynı miktarda olması için RNA konsantrasyonu ayarlayın. CDNA&#39;lar hazırlayın ve Tablo 1 &#39;de gösterilen primerler kullanılarak seçilen genleri analiz etmek için QRT-PCR işlemi gerçekleştirmek. NOT: Bu her bileşenin seyreltmeleri şunlardır: 2x SYBR Green, 20x astar ileri, 20x primer ters, 5x steril DD su, 5x cDNA. QRT-PCR ile 95 ° C 15 saniye 40 döngü, 60 ° C 1 dakika içinde gerçekleştirilir. </li><li> CT GAPDH ve Δ (ACt) ACt uyarılmış olduğunu - - ACt kontrol ACt BT hedef Δ (ACt) yöntemini kullanarak temizlik gen GAPDH&#39;ye normalleştirilmesi ile bağıl ifade seviyelerini hesaplayın. </li><li> Bu kalite kontrolü sonra, mezenkimal hücreler, hematopoietik hücreleri ya da endotel hücreleri dahil olmak üzere bütün hücre tipleri uyarmak için, kültür ortamına BCM ekleyin. </li></ol>

<ol><li>Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Stability+of+Early+Implant+Placement+with+Contour+Augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation.</a> Journal of dental research. , (2013).</li>
<li>Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((augmentation+procedures+in+implant+dentistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+oral+%26+maxillofacial+implants.+24+Suppl%22%5BJournal%5D)">augmentation procedures in implant dentistry.</a> The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((substitutes%3A+an+update.+Injury%5BTitle%5D)+AND+%2236%2C+Suppl+3.+S20-S27%22%5BJournal%5D)">substitutes: an update. Injury.</a> 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).</li>
<li>Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((healing+and+graft+resorption+of+autograft%2C+anorganic+bovine+bone+and+beta-tricalcium+phosphate.+A+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+oral+implants+research%22%5BJournal%5D)">healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).</li>
<li>Jensen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+biphasic+calcium+phosphate+in+standardized+bone+defects%3A+a+histologic+and+histomorphometric+study+in+the+mandibles+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+oral+implants+research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs.</a> Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).</li>
<li>Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((graft+and+bone+graft+substitutes+in+spine+surgery%3A+current+concepts+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Academy+of+Orthopaedic+Surgeons%22%5BJournal%5D)">graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).</li>
<li>Khan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+bone+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Academy+of+Orthopaedic+Surgeons%22%5BJournal%5D)">The biology of bone grafting.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).</li>
<li>Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+effect+of+bone+transplants+in+rabbits.+The+Journal+of+bone+and+joint+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22British%22%5BJournal%5D)">The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery.</a> British. 50, 866-873 (1968).</li>
<li>Bone Urist, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+by+autoinduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">formation by autoinduction.</a> Science. 150, 893-899 (1965).</li>
<li>Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+porcine+bone+conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+oral+%26+maxillofacial+implants%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium.</a> The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).</li>
<li>Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-Conditioned+Medium+Inhibits+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+implant+dentistry+and+related+research%22%5BJournal%5D)">Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro.</a> Clinical implant dentistry and related research. , (2014).</li>
<li>Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+chips+release+of+sclerostin+and+FGF-23+into+the+culture+medium%3A+an+in+vitro+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+oral+implants+research%22%5BJournal%5D)">Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study.</a> Clinical oral implants research. , (2014).</li>
<li>Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((conditioned+medium+enhances+osteoclastogenesis+in+murine+bone+marrow+cultures.+Clin+Oral+Impl+Res%3B+in%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oral+Maxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li>
<li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-conditioned+medium+changes+gene+expression+in+bone-derived+fibroblasts%29%5BTitle%5D)+AND+%22IJOMI+accepted%22%5BJournal%5D)">Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts).</a> IJOMI accepted. , (2014).</li>
<li>Fulzele, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelopoiesis+is+regulated+by+osteocytes+through+Gsalpha-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling.</a> Blood. 121, 930-939 (2013).</li>
<li>Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demineralized+bone+matrix+mediates+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+in+vitro%3A+effect+of+age+of+cell+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor.</a> Journal of. 11, 1703-1714 (1996).</li>
<li>Kupcova Skalnikova,, H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+techniques+for+characterisation+of+mesenchymal+stem+cell+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome.</a> Biochimie. , (2013).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cell+secretome%3A+A+novel+role+for+progranulin+during+risedronate+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment.</a> , Bone. (2013).</li>
<li>Schuldt Filho,, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+of+demineralized+bone+matrix+activates+TGF-%CE%B2+signaling+pathways+in+mesenchymal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cranio+Maxill+Surg%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro.</a> J Cranio Maxill Surg. , (2015).</li>
<li>Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+implant+placement+following+single-tooth+extraction+in+the+esthetic+zone%3A+biologic+rationale+and+surgical+procedures%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+periodontics+%26+restorative+dentistry%22%5BJournal%5D)">Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures).</a> The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).</li>
<li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok. Jordi Caballé-Serrano Diş Araştırma ve Eğitim, Basel, İsviçre Vakfı burs aldı.

Kemik klimalı ortam kemik rejenerasyonu erken evrelerinde kemik grefti yayımlanan aktivitesini yansıtır. Burada açıklanan protokol kemik rejenerasyonu dahil çeşitli hücre tipleri tepkisini incelemek için adapte edilebilir. Bundan başka, protokol işleme kemik veya kemik dolgu kıvamlandırılmış ortam hazırlamak için de kullanılabilir. Çeşitli yerli ve işlenmiş kemik salınan faktörler: yöntemler gerçekleştirmek ve basit bir kavram güvenmek kolaydır. Nasıl BCM anlamak mezenkimal hücreler greft konsolidasyon ve kemik otogreft...

Otolog kemik yaygın bir malformasyon sonucu, rezektif cerrahi, rekonstrüktif travma cerrahisi, ve önceki implant yerleştirme 1,2 olarak meydana gelen kusurları köprü için kullanılır. Kemik greftleri greft konsolidasyon sürecini destekleyen nasıl biyolojik prensiplerini anlamak otogreftleri rekonstrüktif cerrahi altın standart olarak kabul edilir anlamak için tek anahtar değil, aynı zamanda kemik yerine kullanılan 3 geliştirilmiş tasarımı Biyonik olduğunu. Yine, greft konsolidasyon hızlı otolog kemik kemik 4,5 &#39;yerine göre olduğunu. Böylece, kemik rejenerasyonu desteklemek için çok etkili otolog kemik yapmak moleküler ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için zorunludur. Konsolidasyon süreci 6,7 desteklemek için kabul edilen otogreftlerde üç ders kitabı özellikleri vardır. İlk olarak, otolog kemik büyümesi yeni oluşan kemik için rehberlik sağlayarak, osteokondüktif olduğunudefekt içine. İkincisi, otolog kemik o osteoblast 8 ayırt edebilirsiniz mezenkimal hücreler içerdiğini, yani osteojenik olduğunu. Matris içinde Gömülmüş kemik morfogenetik proteinleri gibi büyüme faktörleri endochondral hatta intramembranöz kemik oluşumu 9 sürecini başlatabilir gibi Üçüncüsü, otolog kemik osteoindüktif olduğunu. Başka bir yönü var: taze hazırlanmış kemik fiş &quot;kemik klimalı ortamda&quot; 10-15 ile in vitro gözlemlere dayalı bir parakrin fonksiyon tutun. Ayrıca miyelopoezle etkisi 16 söz edilmelidir. &quot;Demineralize kemik matriks klimalı ortam&quot; Benzer bir terim zaten demineralizasyon 17 tarafından işlenen bile, 1996 yılında icat ve kemik parakrin fonksiyon genel konsepti destekliyor edildi. Bizim amaçlarımız için, BCM 10,11 altçeneleri taze domuz hazırlanabilir. BCM proteomik analizler büyüme aslında da dahil olmak üzere, karmaşık kompozisyon ortayaors ve hücre dışı matris 10 bileşenleri, aynı zamanda bütün kemik 18,19 proteazomun üzerinde mevcut bilgi uzanan. Böylece, BCM in vitro kemik grefti çeşitli değişiklikler yayımlanan aktivitesini yansıtmalıdır. Mezenkimal hücreler, örneğin kemik cips veya oral yumuşak dokusundan izole olanlar için, BCM? In vitro maruz kaldığında ne olur, BCM osteojenik ve adipojenik farklılaşma azaltır ve IL11 ifade 11 güçlü bir artış kışkırtır. Genom mikrodizi diferansiyel BCM tepki olarak mezenşimsel hücrelerde ifade edilmesi daha fazla gen ortaya çıkardı. Bu genler arasında adrenomedüllin (ADM) vardır, IL11, IL33, NADPH oksidaz 4 (NOX4), proteoglikan 4 (PRG4 veya lubricin) ve 3 (PTX3) 15 pentraksin. Otoklava kemik cips elde edilen BCM ilgili genlerin 14 ifadesini değiştirmek için başarısız oldu. Pastörizasyon uygulanan ve donma kemik cips BCM başardıGen ekspresyonu 14 değiştirin. Minerali alınmış kemik matrisi (DBM-cm) da koşullandırılmış ortam, TGF-β-ayarlı genlerin 20 ekspresyonunu değiştirir. İlginçtir, çevredeki yumuşak doku 21,22 kemik yongaları korumak için kullanılan kollajen bariyer membranlar, gen ifadesi 23 değişikliklerden sorumlu olan BCM bu parçaların adsorbe. BCM, araştırma birkaç isim, örneğin kemik erimesi ile ilgili osteoklastı ve endotelyal hücreler gibi kemik rejenerasyonu yer alan diğer hücre tipleri için genişletilebilir. Genel olarak, biriken in vitro veriler bir klinik öncesi çalışmanın tasarımı için bilimsel temelini oluşturmaktadır. Mevcut protokol iki yönlüdür: Birincisi, BCM hazırlamak için nasıl gösterir. İkinci olarak, bu in vitro mezenkimal hücreler göre biyolojik etkinliğini test etmek için nasıl kullanılacağını gösterir.

<table><tbody><tr><td>Domuz Mandibulaları</td><td>Yerel bucher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kemik Kazıyıcı</td><td>Hu-Friedy</td><td>PPBUSE2/36</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler & Antimikotikler</td><td>Tüm Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Membranlar (Bio-Gide)</td><td>Geistlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>16030074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td> Yüksek Saf RNA İzolasyon Kiti</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptör Önce Strand cDNA Sentez Kiti</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (Q-RT-PCR için)</td> <td>Roche</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr></tbody></table>

kemik koşullu ortam: hazırlama ve biyo-

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Otolog kemik greftleri yaygın ağız ve çene cerrahisi, ortopedi, travmatoloji ve kullanılmaktadır. Otolog kemik greftleri tek eksik kemik yerini, aynı zamanda kemik rejenerasyonu karmaşık sürecini desteklemek. Otogreftlerde Bu olumlu davranış üç özelliklerine atfedilen: osteoconductivity, osteogenicity ve Osteoindüktivite. Ancak, başka bir yönü vardır: Kemik kemik rejenerasyonu yer mezenkimal hücreler hedefleyebilir büyüme faktörleri de dahil olmak üzere moleküller, sayısız serbest greft. kemik greftleri parakrin özellikleri kemik koşullu ortam (BCM) kullanılması ile in vitro olarak incelenebilir. Burada ısıl işlem veya demineralizasyonuna uygulanan bir yerel domuz kortikal kemikten kemik klimalı ortam hazırlamak için nasıl protokolü ve kemik sunuyoruz. Hücreler doğrudan BCM maruz ya da kolajen membranların, daha önce BCM ile ıslatılmış olarak biyomalzemeler, üzerine numaralı seribaşı olabilir. Biz in vitro bioassa için örnekler verirTGF-β ayarlı genlerin ifadesi üzerindeki mezenkimal hücreler ys. sunulan protokoller ayrıca kemik rejenerasyonu esnasında kemik grefti parakrin etkileri ortaya koymak ve rekonstrüktif cerrahi geniş alanda translasyonel araştırma için bir yol açmak için teşvik etmelidir.

Kemik koşullandırılmış ortam, taze domuz kemik parçacıkları hazırlanır. Işlem genel bakış BCM hazırlamak ve BCM ile kombinasyon halinde biyomalzemeleri kullanımı, Şekil 1, sırasıyla, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. BCM hazırlanması sırasında, nihai BCM kalitesini etkileyebilir kısa hareketler ya da çok küçük kemik cips sürece hareketlerle büyük kemik cips elde etmek önemlidir. ADM, PTX3, IL11, IL33, NOX4 ve PRG4 (Şekil 3): BCM Kalitesi BCM, hedef genlerin gen ekspresyonunu analiz etmek ...

Biz kemik klimalı ortam (BCM) hazırlamak ve in vitro faaliyetlerini testi nasıl burada açıklamak.

Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Bu videonun genel amacı, kemik şartlandırılmış ortamın nasıl hazırlanacağını ve aktivitesini in vitro olarak nasıl test edeceğini açıklamaktır. Bu, önce bir kemik kazıyıcı kullanılarak bir domuz mandibulasından kemik parçalarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, 24 saat boyunca kültür ortamında inkübe etmeden önce kemik parçalarını ısıl işleme tabi tutmak, demineralize etmek veya hiçbir şey yapmamaktır.Daha sonra, kemik parçalarından salınan tüm faktörleri içeren kemik şartlandırılmış ortam toplanır. Son adım, hücreleri kemik şartlandırılmış besiyeri ile uyarmak veya inkübasyon periyodunu takiben üzerinde kemik şartlandırılmış besiyeri ve tohum hücreleri bulunan bir biyomateryali ön inkübe etmektir. Sonuç olarak, tedaviyi takiben hücrelerin gen ekspresyonundaki değişiklikleri göstermek için kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılır.Otolog kemik greftlerinin tek başına veya diğer biyomateryallerle kombinasyon halinde kullanılması, implant çevresi kemik defektlerinde kemik rejenerasyonunu uyarır ve böylece uzun vadeli iyi sonuçlar sağlar. Bu video, kemik durumundaki biyomoleküllere kütle hücrelerinin genetik tepkisini belirlemede yararlı olan bir in vitro biyo-tahlil sunmaktadır. Orta Kemik durumu ortamı, otolog kemiğin neden kemik rejenerasyonunda standart greftin hedefi olduğu gibi travma, maksillofasiyal ve dental alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.Isıl işlem görmüş kemik oto grefti veya ize kemik matriksi gibi işlenmiş kemikten kondisyon ortamının hazırlanmasının standardize edilmesi zor olabilir. Bu nedenle, kesin olmak önemlidir. Başlamak için yerel bir kasaptan taze domuz mandibulaları alın ve sağlam bir yüzeye yerleştirin.Daha sonra, kemiğe bağlı yumuşak dokuların hiçbirini bırakmamaya özellikle dikkat ederken, tam kalınlıkta bir periost flebini serbest bırakmak için bir periost kullanın. Periosteum çıkarıldıktan sonra, kemik sıyırıcıyı sıkıca tutun ve mandibulanın bukkal tarafından kemik parçaları toplamak için uzun hareketler kullanın. Uzunluğu bir milimetreden küçük olan kemik parçalarından herhangi birini atın.Kemik parçacıklarını 10 santimetrelik bir Petri kabında hızlı bir şekilde kültür ortamı ile kaplayarak kurumasını önleyin. Yeterli kemik yongası toplandıktan sonra, beş gram kemik yongasını pastörize ederek bir termal kontrol partisi hazırlayın. Cipsleri 80 santigrat derecede 30 dakika ısıtarak pastörize edin veya 121 santigrat derecede 20 dakika otoklavlayın.Daha sonra, bir molar hidroklorik asit çözeltisine beş gram kemik yongası ekleyerek ve bunları dört santigrat derecede dört ila altı saat boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek demineralize bir kontrol hazırlayın. Daha sonra kemik parçalarını nötr bir pH'a ulaşana kadar kültür ortamı ile tekrar tekrar yıkayın. Beş gram taze kemik cipsi ve kontrol preparatlarının her birinden beş gram ayrı tabaklara koyun ve her yemeğe 10 mililitre taze kültür ortamı ekleyin.Daha sonra, ertesi gün şartlandırılmış ortamı oluşturmak için numuneleri 37 santigrat derecede 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ortamı her tabaktan çıkarın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için kemikle şartlandırılmış ortamı 200 kez yerçekiminde 10 dakika santrifüjleyin.Daha sonra süpernatanı çıkarın ve 0.2 mikron steril bir filtreden geçirin, Ali dörtlülerini ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede donmuş olarak saklayın. Kemik hücreleri veya diş eti ve periodontal ligament fibroblastları gibi insan mezenkimal hücrelerini, santimetre kare başına 30.000 hücre konsantrasyonunda 12 balina plakasına ekerek başlayın. Hücreleri büyüme ortamı ile örtün ve hücrelerin ertesi sabah gece boyunca plakaya yapışmasına izin verin.Kültür ortamını atın ve hücreleri 37 santigrat derecede ön ısıtma PBS ile yıkayın. Daha sonra,% 20 kemik şartlandırılmış ortam olan ve olmayan ön ısıtma serum içermeyen kültür ortamı ekleyerek hücreleri uyarın. Bir biyomateryalin emilim kabiliyeti de test ediliyorsa, ilgilenilen biyomateryali içeren tüplere herhangi bir kontrol de dahil olmak üzere kemik şartlandırılmış ortamı ekleyin ve tüpleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra biyomateryali önceden ısıtılmış PBS ile kuvvetlice durulayın ve insan mezenkimal hücrelerini malzeme üzerine santimetre kare başına 30.000 hücre konsantrasyonunda tohumlayın. Hücreleri tek başına veya biyomalzemeler üzerine ekilen hücreleri, 24 saat boyunca 37 derece hücre CS'de nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ardından kültür ortamını atın.Hücreleri ön ısıtma PBS ile durulayın ve standart bir RNA izolasyon protokolü kullanarak hücre RNA'sını çıkarın. RNA izole edildikten sonra, ekstrakte edilen RNA'nın eşit konsantrasyonları ile başlayarak ve her numune üzerinde bir ters transkriptaz reaksiyonu çalıştırarak her tedavi grubunun CD NA numunelerini hazırlayın. Ardından, ekteki metin protokolünde listelenen primerleri ve koşulları kullanarak seçilen genlerin seviyelerini aramak için numuneler üzerinde kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.Son olarak, delta delta CT yöntemini kullanarak genlerin temizlik geni Gabb dh'ye döngü eşik seviyelerine normalize ederek nispi gen ekspresyon seviyelerine dayalı olarak kemik şartlandırılmış ortamın kalitesini hesaplayın. İşte 24 saat boyunca kemik şartlandırılmış ortama maruz kalan oral fibroblastların gen ekspresyonundaki değişiklikleri gösteren bazı tipik sonuçlar. İki gen adrenalin ve pent trax ve üçünün her ikisi de orijinal seviyelerin %40'ına önemli ölçüde düşürülürken, interlökinler 11 ve 33, N-A-D-P-H oksidaz dört ve prote glikan dört ile birlikte 200 kata kadar yukarı regüle edildi.İlginç bir şekilde, kemik yongalarını çevredeki yumuşak dokudan korumak için kullanılan kollajen bariyer membranları, gen ekspresyonundaki değişikliklerden sorumlu olan kemik şartlandırılmış ortamın çoğunu emer. Bununla birlikte, kollajen zarları, interlökin 33 ekspresyonunu kontrol eden faktörleri absorbe edemedi. Bu nedenle, interlökin 33 ekspresyonu bu ayarda düzenlenmemiştir.Burada açıklanan protokol, kemik rejenerasyonunu içeren farklı hücre tiplerinin tepkisini incelemek için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol işlem kemikten ve diğer kemik dolgu maddelerinden kondisyon ortamı hazırlamak için kullanılabilir. Bu biyo-tahlilin klinik önemi belirsizliğini korumaktadır.BCM'ye in vivo hücresel yanıt muhtemelen daha karmaşıktır ve burada sunulanları genişleten geniş bir gen spektrumu ve farklı hedef hücreler içerir. Bununla birlikte, biyo-tahlilimiz, kemik RAF moleküllerinin muhtemelen karmaşık bileşimi ve in vitro hücresel yanıt hakkında ilk bilgileri sağlar.

bone-conditioned-medium-preparation-and-bioassay

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, influenza virüsü ile stimülasyon yoluyla kemik iliği kaynaklı makrofajlarda çoklu kaspaz aktivasyonlarının değerlendirmesini göstermektedir. Makrofaj lizizi, lizatın ısıyla inaktivasyonu ve santrifüjlemeyi takiben, sonraki immünolojik analizler için hücre içi kaspazlar toplanır.

Makrofajlarda Multipl Kaspazların Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Bu video, oligodendrosit soy hücrelerinden oligodendrosit koşullu ortamın (OCM) üretimini, ortama moleküler salınımlarını artırmak için onları vurgulayarak gösterir. Büyüme faktörleri, sitokinler ve diğer biyoaktif moleküller açısından zengin olan bu besiyeri, oligodendrositlerin salgıladığı faktörlerin nöronal fizyoloji ve bağlantı üzerindeki etkisi hakkında fikir edinmek için nöron kültürlerine eklenebilir.

Oligodendrosit Şartlandırılmış Ortam Üretmek İçin Bir Yöntem

Zemin plakası, omurilik gelişmekte atalarıdır yayılabilir sinyalleri veren ve ayırt nöronların önemli bir yapıdır. Biz, zemin plakası klimalı ortam üretmek için taze omurilik dokusu uygulamak için, ve biyokimya ile ilgi proteinler üzerinde sonuçlarını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zemin Plaka yayımlanan Sinyalleri fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için klimalı ortamda İzole Zemin Plaka Doku ve Üretim Kültürü

Bu el yazması, farelerin lenf nodu, kemik, akciğer ve beyninden türetilen organ koşullu ortamlardan oluşan bir ex vivo model sistemi tanımlar. Bu model sistem, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların organ tropizmi ve kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek ve incelemek için kullanılabilir.

Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Roman Biyomalzeme büyük kemik lezyonlar onarmak için tasarlanmış sayısı sürekli olarak kemik iyileşmesi geliştirmek ve kemik nakli ile ilgili komplikasyonlar aşmak amacı ile genişletiyor. Burada, önceden klinik biyouyumluluk Biyomalzeme kemik onarımı için test edilmesi için çok disiplinli bir strateji mevcut.

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Bu video hücre orta endosymbiont Anofel gambiae hücre hattı Wolbachia pipientis arındırıcı ve sonra kültür için bir yöntem açıklanır. Bakterinin canlılığı için bir test olduğunu göstermiştir.

Hücre Orta Wolbachia bakımı

Öğrenin, domuz çene kemiğinden kemik koşullu ortam hazırlama ve hücre kültürlerinde biyolojik aktiviteyi test etme yöntemini. Bu teknik, kemik biyolojisi ve doku mühendisliği araştırmalarında gen ifadesi değişikliklerini analiz etmek için kullanılır.

Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Daha fazla video keşfet