Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

Göz tahrişi testinin genel amacı, maddeleri ve karışımları göz tahrişi potansiyellerine göre sınıflandırmak ve etiketlemektir. Bu prosedür, üç boyutlu yeniden yapılandırılmış kornea benzeri bir doku modeli kullanır. Varışta, test kiti ertesi gün tahlil ortamında gece boyunca önceden inkübe edilir, dokular hidre edilir, ardından pozitif ve negatif kontrollerin ve ilgilenilen test kimyasallarının dokuların yüzeylerine topikal olarak uygulanması

Belirli bir maruz kalma süresinden sonra, test kimyasalları yıkama ile uzaklaştırılır. Dokular taze tahlil ortamında inkübe edilir ve kimyasalların toksisitesi daha sonra MTT tahlili ile değerlendirilir. Sonuç olarak, test maddelerinin tahriş edici potansiyeli, test makalesi ile tedavi edilen dokuların göreceli canlılığı, negatif kontrol ile tedavi edilen dokularla karşılaştırılarak değerlendirilebilir.

Bu tekniğin, hızlı iz tahriş testleri gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, laboratuvar hayvanlarını içermemesidir. Normal insan hücrelerinden oluşan in vitro dekonstrükstrükte edilmiş kornatal benzeri doku modeli oküler kullanır. Her tür madde ve karışım için geçerlidir ve malzemelerden oküler tahrişe veya ciddi göz hasarına neden olan kimyasallar arasında ayrım yapabilir.

Sınıflandırma ve etiketleme gerektirmeyen tahriş edici olmayanlar. Epitel dokusu veya epi gibi yeniden yapılandırılmış insan korneası. Oküler, besinlerin hücrelere geçtiği gözenekli bir zar ile ekler halinde hazırlanır.

Yeniden yapılandırılmış doku, kornea epitelini aşamalı olarak tabakalaşmış ancak kornifiye edilmemiş hücrelerle modelleyen keratinize olmayan bir epitel oluşturur. İnsan korneası benzeri epitel kiti alındıktan sonra, 24 kuyulu nakliye konteynerindeki dokuları oda sıcaklığına dengeleyin 15 dakika sonra, steril koşullar altında 24 kuyulu doku plakasını içeren torbayı açın ve tüm dokuları agros jeli ve ekler arasındaki hava kabarcıkları açısından inceleyin. Kesmek. Kaseti açın.

Kapağı steril bir gazlı bezle çıkarın ve doku yüzeyini inceleyin. Daha sonra, bir mililitre 37 santigrat derece kit tahlil ortamını önceden etiketlenmiş altı kuyulu plakanın kuyularına alıkoyun. Daha sonra, kalan nakliye aroslarını çıkarmak için steril gazlı bez üzerinde ek içeren dokuyu nazikçe lekelemek için steril forseps kullanın ve bunları altı kuyulu plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin.

Bir saat sonra, ortamı bir mililitre taze 37 santigrat derece tahlil ortamı ile değiştirin ve dokuları gece boyunca standart kültür koşulları altında inkübe edin. Ertesi gün, her dokunun apikal yüzeyine 20 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS enjekte ettim. DPBS dokulara yayılmazsa, salinin tüm doku yüzeyini ıslatmasını sağlamak için eki forseps ile nazikçe tutun ve plakaya hafifçe vurun.

Plakaları 30 dakika inkübe edin. Daha sonra dokuları sıvı test makaleleri ile tedavi etmek için, zaman çizelgesine göre 50 mikrolitre negatif kontrol, pozitif kontrol ve uygun test makalelerini iki kez uygulayın. Tedavilerin tüm doku yüzeylerini kapladığından emin olmaya özen gösterin ve ardından dokuları katı test makaleleriyle tedavi etmek için ekleri 30 dakika inkübe edin.

İlk olarak, ekleri steril bir yüzeye aktarın. Havadaki katı parçacıklarla kirlenmeyi önlemek için plakayı kapalı tutun. Daha sonra, tesviye edilmiş bir kaşık kullanarak, tedavinin tüm doku yüzeyini kaplamasına dikkat ederek, zaman çizelgesine göre 50 miligram test makalesini topikal olarak çift dokulara uygulayın.

Alternatif olarak, kafası kesilmiş olarak önceden doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Tozları doğrudan kültürün üzerine yerleştirmek için. Katı test makalelerini uyguladıktan hemen sonra tozu uygulamak için pistona bastırın, ekleri altı kuyucuklu plakalarına geri koyun ve dokuları durulamak için dokuları altı saat inkübe edin.

İşlemden sonra, maruziyet inkübasyonunun sonunda test makalesi başına 3 150 mililitre beherleri 100 mililitre DPBS ile doldurun. Yuvalardan çıkarmak için eklerin üst kenarını kavisli forseps ile kavrayın. Daha sonra forseps kullanarak, aynı işlemden iki parçayı üst kenarlarından alın ve işlemleri temiz bir emici malzeme üzerine boşaltın.

Daha sonra, ekleri DPBS'nin ilk kabına batırın, dokuları iki saniye boyunca dairesel bir dönme hareketiyle yıkayın. Ardından, ekleri çoğunlukla DPBS ile doldurulacak şekilde kaldırın ve sıvıyı tekrar behere boşaltın. İlk beherde yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Ardından, son yıkamadan sonra DPB S3'ün ikinci ve üçüncü beherlerindeki ekleri her biri aynı şekilde durulayın. Her bir kesici ucu, açık ucu aşağı bakacak şekilde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla döndürün ve kalan DPBS'yi boşaltmak için üst dudağı emici malzemeye dokundurun. Daha sonra dokuları hemen beş mililitre oda sıcaklığında tahlil ortamına daldırın.

Daldırma sonrası daldırma süresinin sonunda önceden etiketlenmiş 12 oyuklu bir plakada, tahlil ortamını boşaltın ve ekleri emici bir malzeme üzerine kurulayın. Daha sonra ekleri, oyuk başına bir mililitre ılık tahlil ortamı içeren yeni bir altı oyuklu plakaya aktarın ve MTT canlılık testini başlatmak için plakaları inkübatöre yerleştirin. Ekleri, 0.3 mililitre taze hazırlanmış MTT çözeltisi içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın.

Aktarmadan önce ekleri emici malzeme üzerine sürün. Eklerin altında sıkışan hava kabarcıklarını serbest bırakın ve dokuları üç saat sonra inkübatöre geri koyun, eklerin alt kısımlarını emici malzeme üzerine yerleştirin. Daha sonra, renklendirici olmayan sıvı test maddelerinin daldırılmış ekstraksiyonu için, ekleri, katı veya sıvı renklendiricilerin daldırılmamış bir ekstraksiyonu için oyuk başına iki mililitre uygun ekstraksiyon çözeltisi içeren önceden etiketlenmiş 24 oyuklu bir plakaya daldırın.

Ekleri, oyuk başına bir mililitre ekstraksiyon çözeltisi içeren önceden etiketlenmiş altı oyuklu bir plakaya aktarın. Daha sonra, buharlaşmayı önlemek için plakaları bir ısı mühürleyici veya paraform ile kapatın ve daldırılmış ekstraksiyonun sonunda hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında iki ila üç saat boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde ekstrakte edin. Dokuları delin ve ardından her bir ek parçanın içindeki sıvıyı tekrar içine boşaltın, ardından ekleri dokularla birlikte atın.

Ekstrakt çözeltisini her bir oyukta karıştırın ve her numunenin iki adet 200 mikrolitrelik alikotunu, daldırılmış olmayan ekstraksiyonun sonundaki şemada gösterildiği gibi önceden etiketlenmiş 96 Kuyulu plakanın uygun kuyucuklarına aktarın. Ekleri ve dokuları delmeden atın ve her birine bir mililitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Ekstraksiyon çözeltisini kuyucuklarda iyice karıştırın ve her numuneden iki adet 200 mikrolitrelik alikotu, az önce gösterildiği gibi önceden etiketlenmiş 96 oyuklu bir plakanın uygun oyuklarına aktarın.

Son olarak, numunelerin optik yoğunluğunu bir referans filtresi kullanmadan 570 nanometre dalga boyunda 96 kuyulu bir spektrofotometrede okuyun ve ilgili doku yükümlülüklerini hesaplamak için sonuçları bir elektronik tabloya girin. Buradaki metin protokolünde belirtildiği gibi test kimyasal girişiminden kaynaklanan düzeltmeleri hesaba katın, 10 test makalesi ile yürütülen temsili göz tahrişi test sonuçları ve negatif ve pozitif kontroller bu deneyde gösterilmiştir. %100 doku canlılığına karşılık gelen negatif kontrol için ortalama 1.31'lik bir optik yoğunluk gözlendi ve %31.2'lik bir nispi doku canlılığı gözlendiPozitif kontrol test makaleleri için 1, 2, 4, 7 ve sekiz, bu makaleleri tahriş edici olmayan test makaleleri 3, 5, 6, 9 ve 10 olarak sınıflandıran %60'tan daha büyük doku değişkenlikleri sergiledi.

Öte yandan, %60'a eşit veya daha az doku değişkenliği sergiledi ve bu da tahriş edici olarak sınıflandırılmalarına neden oldu. Bu deneyde çift dokular arasındaki doku canlılığındaki fark, ikinci test makalesi hariç test edilen tüm makaleler için %20'den azdı. Bu nedenle, ikinci test makalesi dışındaki tüm test makalelerinin sonuçları, tüm göz tahrişi testi kabul kriterlerini karşıladıkları için nitelikli olarak kabul edildi.

Bu videoyu izledikten sonra, in vitro rekonstrüktif insan korneası benzeri doku modeli dört, kimyasalın tehlike tanımlama etiketlemesini kullanarak DICATION testini nasıl yapması gerektiğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür, kademe test stratejisinin bir parçası olarak EOC D test yönergelerinde uygulanmıştır.