Name: Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin göz tahriş testini RhCE doku modeli kullanarak toksikolojide uygulamayı. Bu yöntem, maddelerin göz tahriş potansiyelini hayvan deneyi olmadan güvenilir şekilde sınıflandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar EIT projeye adanmış yaptığı bilimsel destek ve zaman Dr John Harbell teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, Beiersdorf AG şirketi (Almanya), IIVS (ABD), Mary Kay Inc (ABD), Avon Products Inc (ABD), Procter &amp; Gamble / COSMITAL (İsviçre), Laboratoire Pierre Fabre (Fransa) teşekkür etmek istiyorum Harlan Laboratuvarları (United Kingdom), ve Göz tahrişi Testi 15 Multi-merkezi International Pre-Doğrulama ve doğrulama Çalışmaları katılım için LVMH Parfüm (Fransa).

<ol><li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human%2C+Rabbit%2C+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Federal+Register%22%5BJournal%5D)">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li>
<li>Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labelling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)</a>. , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).</li>
<li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther+November%22%5BJournal%5D)">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li>
<li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage%2Feye+irritation%3A+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS%2FEU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+tox%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li>
<li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EC%2FHO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+safety%3A+a+silent+%28in+vitro%29+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).</li>
<li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Draize+Eye+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li>
<li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243(2002).</li>
<li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249(2007).</li>
<li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378(2009).</li>
<li>Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarbell%2C+J+%22Handbook+of+Toxicology%22">Handbook of Toxicology</a>. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li>
<li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li>
<li>MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiOcular+Eye+Irritation+Test+%28EIT%29+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals%3A+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li>
<li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-house+validation+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li>
<li>Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for the Testing of Chemicals</a>. , (2014).</li>
<li>Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).</li>
<li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+%E2%80%94+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li>
</ol>

Bu yazı için Yayın ücretleri Mattek Corporation tarafından ödendi.

Biz EpiOcular doku modeli için geliştirilen Göz tahrişi Testi (Şekil 1) sunduk. GHS Kategori ayırt etmez, burada sunulan EIT duyarlılığı ve özgüllüğü 17. EIT yüksek derecesi ile etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ayırmak mümkün 1 Kategori 2 kimyasallar. EIT sınıflandırma ve kozmetik ve farmasötik maddeler dahil olmak üzere kimyasal, geniş bir oküler tahriş potansiyelinin etiketlenmesi için doğrulanmıştır. In vitro testlerde diğer ile birlikte, EIT in vivo tavşan göz tahrişi testi için bir yedek olarak hizmet verecek. EIT maruz kalma ve maruz kalma sonrası kuluçka süresi (Şekil 1) uzunluğu değişir sıvı ve katı maddelerin, iki benzer ama farklı protokoller kullanmaktadır. EIT kullanılan son noktadaha önceden belirlenmiş bir insan epitel doku modellerinde 20,21 kullanılmıştır MTT testi ile tespit doku canlılığı vardır. Bu testte gerçekleştirmek için, standart hücre kültürü ekipmanları dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Nedeniyle yüksek doku-doku tekrarlanabilirliği seviyesinde, n = 2 dokuların yerine, genellikle tavsiye n = 3 kullanılır. Yetenek n kullanmak = nedeniyle bireysel dokuların 14 farklı kullanım için, böylece ortaya çıkabilecek tahlil değişkenliği en aza deneyimli bir operatör aynı anda iki dokuları işlemek için izin verir çünkü 2 dokular, protokolün önemli bir yönüdür. Ayrıca, pozitif ve negatif kontroller ile birlikte, test maddesi başına n = 2 dokuları, aynı fiziksel durumuna (sıvı ya da katı madde), 10 test maddelerinin tahriş kullanarak, bir kit (24 dokular) kullanılarak değerlendirilebilir. Malzemelerin güvenilir sınıflandırılmasını sağlamak Diğer önemli noktalar pozitif kontrol su için özellikleri vardırbstance (doku canlılığı ≤50.0%), yinelenen dokularda (fark &lt;% 20.0) ve negatif kontrol OD okumaları (&gt; 0,8 ile &lt;2,5) arasındaki tekrarlanabilirlik. EIT testi yaparken kuluçka dönemlerinde protokol veya değişikliklerden sapma değişmiş sonuca neden olabilir, çünkü o, valide protokol ve önerilen doz ve durulama programları (Tablo 3 ve 4) kalınması önemlidir. Aynı şekilde, MTT inkübasyon için 3 saat süre sapmalar farklı MTT okumalarına neden olur ve tahlil sonucunu etkileyebilir. Bazen, bir test kimyasal MTT dokusu canlılığı deneyi veya MTT nedeni azaltılmasına engel olabilir, optik veya diğer özelliklere sahip olabilir. Örneğin, bir test bir kimyasal ile doğrudan mavi-mor reaksiyon ürünü olarak MTT azaltabilir veya MTT formazana (~ 570 nm) ile aynı aralıkta ışığı emen renkli bir madde olabilir. Ancak bu test kimyasalları pr olacakMTT tahlili esnasında, malzemenin yeterli miktarda de ince üzerinde mevcut olan (ya da tarafından emilen) ise, sadece bir sorun ESENT. Bu girişimi önlemek için, geniş durulama prosedürleri EIT protokole dahil edilmiştir. TA kaldırmaz durulama ve TA MTT azaltma karışıyorsa, ek kontroller tespit etmek için kullanılan ve bunun için doğru olmalıdır. Test kimyasal doğrudan MTT indirgemesi şüphesi varsa Kısaca, söz konusu kimyasal madde 50 ul (ya da katı maddeler için 50 mg), SCC (NC steril deiyonize su, 50 ul çalışma MTT çözeltisi ile 3 saat süre ile inkübe edilir, olmalıdır ) aynı anda çalışacak. MTT çözeltisi mavi-mor dönerse, test maddesi MTT azalttı tahmin edilmektedir. Bu durumda dondurularak öldürülmüş doku kontrolleri kullanarak işlevsel bir onay test malzemesi dokuya bağlanmasının ve bir sahte MTT indirgemesi bir sinyal verilmesine yol olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirilmelidir. TA-maruz kalan, öldürülen doku kontrolünde kayda değer MTT azalma varsa(Tedavi edilmeyen canlı dokuda miktarına göre), test maddesi ortalama dokusu canlılığı öldürülmüş kontrolün ortalama canlılığını çıkarılarak düzeltilmelidir. Yalancı negatif sınıflandırmalar 14,15,18 azlığı gösterdiği gibi EIT, güvenlik tarafında errs. Önemlisi, göze aşındırıcı ve GHS Kategori 1 kimyasallar, hiçbiri, en ciddi oküler tehlike temsil Bu deneyde 14,15,18,19 olarak tahriş edici olmayan olarak sınıflandırılmıştır. Son olarak, nitro test yönteminde RHCE önemli avantajlarından biri düzgün sıvı ve (iki boyutlu, su altı hücre kültürleri ile mümkün değildir) katı maddeleri test olasılığıdır. EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunacaktır. Hayvanların yerine o belirlenmesiküler toksisite yıllardır toksikolojik araştırma hedefi olmuştur. EIT test yöntemi 2014 yılında EURL ECVAM tarafından desteklenen bir resmi doğrulama çalışması yapmıştır ve EpiOcular EIT 2015 yılında OECD TG 492 olarak OECD test Rehberi içine uygulanmıştır.

Bu tür kozmetik, deterjan ve ev temizlik gibi tüketici ürünleri onlar gözlerle temas halinde ciddi hasar neden olabilir kimyasalların çeşitli içerir. Bu nedenle, göz tahrişi için bu ajanların test tüketici güvenliğini 1 sağlamak için ABD ve AB düzenleyici kurumlar tarafından talep edilir. Karışımlar ve formülasyonlar göz tahrişi potansiyelinin değerlendirilmesi, aynı zamanda kimyasalların taşınması için AB Kozmetik Direktifi altında kozmetik maddelerin etiketlenmesi için REACH (Kayıt, Değerlendirme, Yetkilendirme ve Kimyasalların Kısıtlanması) ile mevzuat uyum için bir gereklilik olduğunu ve için pestisit ve ev ürünleri 2 etiketlenmesi. Şu anda, düzenleyici kurumlar Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesi (GHS) 3 Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi kullanılarak göz tehlike değerlendirmesini gerektirir. GHS ağırlıklı Draize göz tahrişi testinde dayalı, en yaygın olarak kullanılan göz tahrişi deneyi hangi yabancı maddeler ve mildemirbaşlar Tavşan gözünde 4 katılgan zar kesesi içine, doğrudan eklenir. GHS sınıflamasına göre, GHS Kategori 1 (göz aşındırıcılar) göz dokularında veya maruz kalma 3,5 izleyen 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olmayan göz ve görme ciddi hasar şiddetli başlangıç ​​yaralanmasına neden kimyasallar test eder. GHS Kategori 2 maruziyet 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olan gözün önemli değişiklikler meydana kimyasallar test eder. Koroziflerin veya tahriş edici olmayan test kimyasalları GHS yok Kategori olarak adlandırılır. 40 yılı aşkın için, Draize tavşan gözü testi kendi tekrarlanabilirlik eksikliği, insani tepkilerin abartılması ve canlı hayvanların 5-8 kullanımı için eleştiriliyor. Bu kaygılar arıtma, indirgeme ve in vivo testte 9 değiştirilmesi için birçok önerilerde teşvik etmiştir. Valide hayvansal olmayan alternatifleri ihtiyacı daha da güçlendirildi(2009) Kozmetik (2005) kozmetik ürünlerinin güvenlik değerlendirmesinde hayvanların kullanılmasını yasakladı Direktifi ve malzemeyi Yedinci Değişiklik kabulü 2. 1996 yılından bu yana, yeniden kornea gibi doku modeli yaygın hammadde, yüzey aktif madde bazlı formülasyonların tahrişi potansiyelini değerlendirmek için, kozmetik endüstrisinde kullanılan ve kullanım için tasarlanmış karışımları birleşik veya gözün yakın olan 10-13. RHCE doku modelinin kullanılması doğal, sulandırılmamış formda doku yüzeyine test malzemesinin doğrudan topikal uygulama sağlar. Bu şekilde, suda çözünür olmayan formülasyonlar çözücüler ile inceltilmeden test edilebilir. Yaygın, uygulanabilir basit ve ekonomik yöntem için istek (Alternatif Yöntemler Doğrulama Avrupa Birliği Referans Laboratuarı Avrupa Merkezi) EURL ECVAM en cevaben Göz tahrişi Testi (EIT) bir singl kullanan hangie maruz kalma süresi ve etiketleme gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif ayırmak mümkün (Şekil 1) 14 geliştirilmiştir. 83 kimyasalların (44 sıvılar ve 39 katı) için sonuçlara dayanarak, EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 duyarlılık / özgüllük ve doğruluk (SS &amp; A) sıvılar için, katılar için 100.0 / 68.4 / ve% 84.6 SS &amp; A ve 97,6 / elde 68.3 / ve genel SS &amp; A için% 83.1. 2007 yılında, EURL ECVAM himayesinde Kozmetik Avrupa&#39;da (eski Colipa) tarafından desteklenen bir multi-laboratuar öncesi doğrulama çalışması resmi doğrulama 15 o getirme hedefi ile EIT alaka ve güvenilirliğini değerlendirdi. Bu çalışmada, 298 bağımsız denemeler, yedi bağımsız laboratuvarda yapılmıştır. Çalışma sonuçları katılan tüm laboratuvarlar 15 arasında varyasyon düşük katsayılı tahmininde% 99.7 anlaşmasını gösterdi. Sonuç olarak, 2010 yılında EIT protokol resmi EURL ECVAM girdidoğrulama programı. Doğrulama çalışma, in vivo referans verileri (Draize tahrişi verileri) kullanılabilir hangi bireysel madde ve kimyasal karışımların da dahil olmak üzere 104 kodlu deney kimyasallar, kullandı. Bu çalışmanın başarısına dayanarak, OECD Taslak testi kılavuz It EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin sınıflandırılmasına önemli katkıda olacağı tahmin edilmektedir 2014 yılında sunuldu.

yeniden İnşa İnsan kornea gibi epitelyal (rhce) doku modeli kullanılarak göz tahriş kimyasalların tehlike tanımlaması göz tahrişi testi (eit)

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

AB Kozmetik Direktifi ve AB REACH mevzuatına Yedinci Değişiklik uymak için, insanda göz toksisite güvenilir ve doğru değerlendirilmesi için geçerli olmayan hayvan alternatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz bir göz tahrişi testi normal insan hücrelerine dayanan üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanır (EIT) geliştirdik. EIT göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez o ayrı yapabiliyor. Test, iki ayrı protokolleri, sıvı kimyasal ve katı deney ürünleri için, bir ikinci benzer protokol için tasarlanmış bir kullanır. EIT tahmin modeli, tek bir maruziyet süresi (sıvılar için 30 dakika, katı maddeler için 6 saat) ve tek bir doku canlılığı kesme (MTT testi ile tespit edildiği üzere% 60.0) kullanır. EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 sens elde (44 sıvılar ve 39 katı) 83 kimyasallar için sonuçlara dayanarakiTivity / özgüllük ve doğruluk (SS &amp; A) sıvılar için, katılar için / 68.4 100.0 / ve% 84.6, SS &amp; A, ve 97.6 / 68.3 / ve genel SS &amp; A için% 83.1. EIT düzenleyici test gereksinimlerini karşılamak için hayvanların kullanmadan sıvı ve katı kimyasalların geniş bir yelpazede göz irritasyon potansiyelini sınıflandırmak önemli katkıda bulunacaktır. EpiOcular EIT yöntemi TG 492 olarak OECD Test Rehberi içine 2015 yılında hayata geçirildi.

10 Test makaleleri (TA) ve negatif ve pozitif kontroller ile yapılan Temsilcisi EIT sonuçları Tablo 6 ve Şekil 3&#39;te sunulmuştur. NC% 100 doku canlılığı karşılık OD = 1.31 için, bu nedenle bilgisayar (OD ortalama = 0.41) ortalama vardı % 31,2 göreli doku canlılığı. EIT protokol katı pozlama protokolünü kullanarak, 4 laboratuvarda sıvı poz protokolü ve 8 bağımsız geçerli deneylerde kullanılarak 7 laboratuvarda 15 geçerli bağımsız deneylerde yapıldığında, sıvı protokolünü kullanarak PC için ortalama doku canlılığı 36.4 ± 4.0 idi ve% katı protokol için 32.3 ± 6.4%. Her durumda, pozitif kontrol sonuçları 60,0% 15 arasında kesme değerinin altında idi. Şekil 3&#39;te, TA1, TA2, TA4, TA7 gösterilen ve TA8 doku canlılıkları&gt; 60.0% vardı ve bu nedenle &quot;NI&quot; olarak sınıflandırıldı kadar. TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10 dokusu Yaşama kabiliyetleri X vardı04;% 60.0 ve bu nedenle &quot;ben&quot; olarak sınıflandırıldı. Yinelenen dokular arasındaki doku canlılığının fark TA2 bir istisna ile tüm TA için &lt;% 20.0 idi. Hepsi EIT kabul kriterlerini (Bölüm 10.2) tanıştığımızdan beri nedenle, TA2 bir istisna ile tüm test makaleleri, sonuçları, &quot;nitelikli&quot; olarak kabul edildi. Çünkü İlk deneyde, TA2 yinelenen dokular arasındaki yüksek değişkenlikten dolayı, ikinci bir deney kalifiye EIT sonuçları elde etmek için gerekli idi. Burada RHCE doku modeli kullanılarak açıklandığı gibi EIT test yöntemi EURL ECVAM / Kozmetik Europe 15,17-19 tarafından resmi doğrulama dahil olmak üzere birçok Multilaboratory geçerlilik çalışmalarında, oküler irritasyon değerlendirilmesi için kullanıldı. Çalışmaların tümünde, EIT tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir ve doğru kimyasallar (madde ve karışımlar her ikisi) göz tahrişi veya ciddi göz hasarı ac ​​için sınıflandırma ve etiketleme gerektirmeyen tespit başardıBM GHS 15,17-19 kadar Cording. EIT test yöntemi duyarlılık, özgüllük ve genel doğruluk için göz tahrişi için Doğrulama Yönetim Grubu (VMG) kabul kriterlerini yerine getirmiş ve şu anda in vivo tavşan Draize testi 19 için kısmi yerine resmi uygulanmasını bekliyor. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Şekil 1: Sıvı ve katı deney ürünler için EIT protokol Anahat Kullanılan kısaltmalar: AM, tahlil ortamı;. SCC, standart kültür koşulları; PBS, Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, RT, oda sıcaklığı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Şekil 2:. MTT dokusu canlılık testinde, standart 96 oyuklu plaka konfigürasyonu iki 200 ul tam bölünen miktarları, trabir ön-etiketli 96-kuyucuklu bir plakanın uygun oyuklarına nsferred. Kullanılan kısaltmalar: NC, negatif kontrol; PC, pozitif kontrol; TA1-TA20 test makaleleri 1-20; Blank, ekstraksiyon maddesi. 96- MTT plaka konfigürasyonu RHCE doku canlılığını ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış Excel ile kullanılır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Şekil 3: EIT sonuçlar 10 deney makale, NC ve RHCE doku modeli kullanılarak PC kontrolleri için elde edilen grafik EIT sonuçlarını sunmak için tasarlanmış bir Excel elektronik oluşturulur.. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları &quot;tahriş edici (&quot; I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı&gt; 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> EIT protokol iş adımları için zaman (bir operatör için bir günlük iş) başlatın </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Her bir satır dokuların bir çift tekabül </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adımların sırası: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Sıvılar: </td><td> PBS </td><td> TA Pozlama </td><td> Sonrası Islatmak </td><td> Sonrası <td> MTT Reaksiyon </td><td> MTT Ekstraksiyon </td><td> Tedbir </td></tr><tr><td></td><td> 30 dakika </td><td> 30 dakika </td><td> 12 dk </td><td> 120 dakika </td><td> 180 dakika </td><td> 120 dakika </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 00:12 </td><td> 15:12 </td><td> sonra </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:01 </td><td> 09:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 00:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 00:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 00:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 00:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 00:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 00:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 00:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 00:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> 10:21 </td><td> 00:21 </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 00:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 00:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3:. Sıvı test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi de dahil olmak üzere Protokol adımları ön ıslatma DPBS Test Makaleler Uygulama (TA), durulama ve dokuları ile Post-ıslatın, Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT çıkarması, ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. Tüm tahlil test 10 TA ve kontroller bir günde bitmiş olabilir. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> (2 gün, bir operatör için çalışmak) EIT protokol adımlar için başlangıç ​​zamanı </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Her bir satır dokuların bir çift tekabül </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.gün </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 2. Gün (ertesi gün) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adımların sırası: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Katılar: </td><td> PBS </td><td> TA Pozlama </td><td> Sonrası Islatmak </td><td> Sonrası Incubaction </td><td> MTT Reaksiyon </td><td> MTT Ekstraksiyon </td><td> Tedbir </td></tr><tr><td></td><td> 30 dakika </td><td> 6 saat </td><td> 26 dk </td><td> 18 saat </td><td> 180 dakika </td><td> 120 dakika </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 00:56 </td&gt; <td> sonra </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 00:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 4: Katı Test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi. Dahil Protokol adımlar ön ıslatma Durulama ve Post-ıslatın Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT Ekstraksiyon ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur DPBS&#39;de Test Makaleler Uygulaması ile dokuları. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. 10 TA ve kumanda elemanlarının kontrol edilmesi Bütün tahlil, bir, iki günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Miktar </td><td> Ayıraç </td><td> Saklama Koşulları </td><td> Kaynak </td><td> Tanım </td><td> Son kullanma tarihi </td></tr><tr><td> 1 flakon, 2 mi </td><td> MTT Konsantre (MTT-100-CON) </td><td> Işıktan koruyarak (-20ºC) </td><td> Mattek </td><td> Dondurulmuş MTT konsantre </td><td> 2 ay </td></tr><tr><td> 1 flakon, 8 mi </td><td> MTT seyreltici </td><td> 2-8-# 186; C </td><td> Mattek </td><td> MTT konsantrasyonuna seyreltilmesi için, önceden MTT tahlilinde kullanma </td><td> 2 ay </td></tr><tr><td> 1 şişe, 60 mi </td><td> İsopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Ekstraksiyon maddesi </td><td> NA </td></tr></tbody></table> Tablo 5: MTT-100 Assay Kit Bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Kod N ° </td><td> Doku </td><td colspan="2"> İşlenmemiş veri </td><td colspan="2"> Boş düzeltilmiş veri </td><td rowspan="2"> OD demek </td><td rowspan="2"> Canlılığının% </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0.397 </td><td> 0,379 </td><td> 0.397 </td><td> 0.388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.419 </td><td> 0,442 </td><td> 0.419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0.168 </td><td> 0,167 </td><td> 0.168 </td><td> 0,167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.616 </td><td> 46.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0.508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0.935 </td><td> 0,941 </td><td> 0.935 </td><td> 0,938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ortalama </td><td> Dif. </td><td> ortalama </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Sınıflama </td></tr><tr><td></td><td> OD </td><td> OD </td><td> Yaşama kabiliyetleri [%] </td><td> canlılığında bir </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1,314 </td><td> 0.041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0.043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1,292 </td><td> 0.127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0.999 </td><td> 0.333 </td><td> 76.1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0.152 </td><td> 0.030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1,188 </td><td> 0.078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0.134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0.106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0.101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0.095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0.085 </td><td> 0.125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0.203 </td><td> 0.105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr></tbody></table> Tablo 6:. 10 deneme makale için elde edilen sonuçlar EIT, NC ve PC kontrolleri tabloları eşya vardırDoku canlılığı ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış bir Excel elektronik tarafından uced. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları &quot;tahriş edici (&quot; I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı&gt; 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8).

Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor.

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Göz iritasyon testinin genel amacı, maddeleri ve karışımları göz iritasyon potansiyellerine göre sınıflandırmak ve etiketlemektir. Bu prosedürde, üç boyutlu yeniden yapılandırılmış kornea benzeri bir doku modeli kullanılır. Test kiti ulaştığında, gece boyunca analiz ortamında ön inkübasyona tabi tutulur; ertesi gün dokular hidrate edilir ve ardından pozitif ve negatif kontroller ile ilgili test kimyasalları, dokuların yüzeylerine çift örnek (düplike) olarak topikal olarak uygulanır.Belirli bir maruziyet süresinin ardından, test kimyasalları yıkama yoluyla uzaklaştırılır. Dokular taze analiz ortamında post-inkübe edilir ve ardından kimyasalların toksisitesi MTT analizi ile değerlendirilir. Son olarak, test maddelerinin tahriş potansiyeli, test maddesiyle işlem görmüş dokuların göreceli canlılığının negatif kontrolle işlem görmüş dokularlarla karşılaştırılmasıyla değerlendirilebilir.Bu tekniğin hızlı iz irritasyon testleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, laboratuvar hayvanlarını içermemesidir. Normal insan hücrelerinden oluşan, in vitro yapılandırılmış kornea benzeri oküler doku modelini kullanır. Tüm madde ve karışım türleri için uygulanabilir olup, oküler irritasyon veya ciddi göz hasarı indükleyen kimyasalları diğer materyallerden ayırt edebilir.Sınıflandırma ve etiketleme gerektirmeyen tahriş etmeyen maddeler. Rekonstrüktif insan kornea benzeri epitel dokusu veya epi. Ocular, besin maddelerinin hücrelere geçtiği gözenekli bir membrana sahip insertler içinde hazırlanır.Yeniden yapılandırılan doku, progresif olarak tabakalaşmış ancak boynuzlaşmamış hücrelerle kornea epitelyumunu modelleyen keratinize olmamış bir epitel oluşturur. İnsan kornea benzeri epitel kiti alındığında, 24 kuyucuklu nakliye kabındaki dokuları oda sıcaklığına kadar dengeleyin. 15 dakika sonra, 24 kuyucuklu doku plakası içeren torbayı steril koşullar altında açın ve tüm dokuları agros jel ile insertler arasında hava kabarcığı olup olmadığı yönünden inceleyin. Kesin. Bandı açın.Steril bir gazlı bezle örtüyü kaldırın ve doku yüzeyini inceleyin. Ardından, önceden etiketlenmiş altı kuyucuklu plakaların kuyucuklarına 37 °C'ye ısıtılmış kit analiz ortamından birer mililitre paylaştırın. Daha sonra, kalan nakliye kalıntılarını temizlemek için steril pensle doku içeren insertleri steril gazlı bez üzerinde nazikçe kurulayın ve bunları altı kuyucuklu plakaların ayrı kuyucuklarına yerleştirin.Bir saat sonra, ortamı bir mililitre taze 37 °C analiz ortamı ile değiştirin ve dokuları standart kültür koşullarında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her dokunun apikal yüzeyine 20 µL kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ekleyin. Eğer DPBS dokulara yayılmazsa, inserti bir pensle nazikçe tutun ve salinin tüm doku yüzeyini ıslattığından emin olmak için plak üzerine hafifçe vurun.Plakaları 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, dokuları sıvı test maddeleriyle işlemek için zaman çizelgesine uygun olarak negatif kontrolü, pozitif kontrolü ve uygun test maddelerini her birinden 50 µL olacak şekilde çift örnekli olarak uygulayın. Uygulamaların doku yüzeylerinin tamamını kapladığından emin olun ve ardından dokuları katı test maddeleriyle işlemek için insertleri 30 dakika boyunca inkübe edin.Öncelikle, insertleri steril bir yüzeye aktarın. Havada asılı katı partiküllerle kontaminasyonu önlemek için plağı kapalı tutun. Ardından, düzleştirilmiş bir kaşık kullanarak, zaman çizelgesine uygun olarak test maddesinin 50 miligramını, tedavinin tüm doku yüzeyini kapladığından emin olarak kopya dokulara topikal olarak uygulayın.Alternatif olarak, ucu kesilmiş, önceden doldurulmuş bir mililitrelik şırınga kullanın. Tozları doğrudan kültüre yerleştirmek için pistonu bastırarak tozu uygulayın; katı test maddelerini uyguladıktan hemen sonra insertleri altı kuyucuklu plakalarına geri yerleştirin ve dokuları durulamak için altı saat boyunca inkübe edin.İşlem sonrası, maruziyet inkübasyonunun sonunda her test maddesi için 3 adet 150 mililitrelik beheri 100 mililitre DPBS ile doldurun. İnsetleri kuyucuklardan çıkarmak için üst kenarlarını kavisli penslerle kavrayın. Ardından, aynı işlemden iki inseti üst kenarlarından pensle tutarak alın ve işlemleri temiz, emici bir materyalin üzerine boşaltın.Ardından, ekleri (insert) ilk DPBS beherine daldırın ve dokuları iki saniye boyunca dairesel bir sallama hareketiyle yıkayın. Daha sonra, eklerin büyük oranda DPBS ile dolmasını sağlayacak şekilde yukarı kaldırın ve sıvıyı tekrar behere boşaltın. İlk beherdeki yıkama işlemini iki kez tekrarlayın.Ardından ekleri, son yıkamada olduğu gibi ikinci ve üçüncü DPB beherlerinde üçer kez durulayın. Her bir eki, açık ucu aşağı bakacak şekilde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla döndürün ve kalan DPBS'yi boşaltmak için üst kenarı emici malzemeye değdirin. Daha sonra dokuları derhal oda sıcaklığındaki beş mililitre analiz ortamına daldırın.Suda bekletmele sonrası daldırma süresi sona erdiğinde, önceden etiketlenmiş 12 kuyucuklu plakadaki analiz ortamını dökün ve insertleri emici bir malzeme üzerinde kurulayın. Ardından insertleri, her kuyucuğunda 1 mL ılık analiz ortamı bulunan yeni bir altı kuyucuklu plağa aktarın ve MTT canlılık analizini başlatmak için plakaları inkübatöre yerleştirin. Insertleri, 0,3 mL taze hazırlanmış MTT çözeltisi içeren 24 kuyucuklu bir plağa aktarın.Transferden önce ekleri emici materyal üzerine hafifçe bastırarak kurulayın. Eklerin altında hapsolmuş hava kabarcıklarını boşaltın ve üç saat sonra dokuları inkübatöre geri yerleştirin, eklerin tabanlarını emici materyal üzerine koyun. Ardından, renklendirici olmayan sıvı test maddelerinin daldırmalı ekstraksiyonu için ekleri, her kuyucukta 2 ml uygun ekstraksiyon çözeltisi içeren önceden etiketlenmiş bir 24 kuyucuklu plakaya daldırın; katı veya sıvı renklendiricilerin daldırmasız ekstraksiyonu için ise işlemi buna göre gerçekleştirin.Insertleri, her kuyucukta bir mililitre ekstraksiyon solüsyonu içeren, önceden etiketlenmiş altı kuyucuklu bir plakaya aktarın. Ardından, buharlaşmayı önlemek için plakaları bir ısı mühürleyici veya parafilm ile kapatın ve daldırma ekstraksiyonu sonunda hafif çalkalamayla oda sıcaklığında, orbital sarsıcıda iki ila üç saat boyunca ekstraksiyon yapın. Dokuları delin ve ardından her insert içindeki sıvıyı kuyucuğa geri boşaltın, ardından dokuların bulunduğu insertleri atın.Her kuyucuktaki ekstrakt çözeltisini karıştırın ve her örnekten iki adet 200 microliter aliquotu, daldırmasız ekstraksiyonun sonundaki şemada gösterildiği gibi önceden etiketlenmiş bir 96 kuyucuklu plakanın uygun kuyucuklarına aktarın. İnsetleri ve dokuları delmeden atın ve her birine bir milliliter ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Kuyucuklardaki ekstraksiyon çözeltisini iyice karıştırın ve az önce gösterildiği gibi her örnekten iki adet 200 microliter aliquotu önceden etiketlenmiş bir 96 kuyucuklu plakanın uygun kuyucuklarına aktarın.Son olarak, örneklerin optik yoğunluğunu 96 kuyucuklu bir spektrofotometrede, referans filtre kullanmadan 570 nanometre dalga boyunda okuyun ve ilgili doku canlılıklarını hesaplamak için sonuçları bir hesap tablosuna girin. Buradaki metin protokolünde belirtildiği üzere, test kimyasalı girişiminden kaynaklanan düzeltmeleri dikkate alın; 10 test maddesi ile negatif ve pozitif kontroller kullanılarak gerçekleştirilen temsili göz iritasyon testi sonuçları bu deneyde gösterilmiştir. %100 doku canlılığına karşılık gelen negatif kontrol için 1.31'lik bir ortalama optik yoğunluk gözlemlenmiştir. Pozitif kontrol için göreceli doku canlılığı %31.2 olarak belirlenmiştir; 1, 2, 4, 7 ve 8 numaralı test maddeleri %60'tan fazla doku canlılığı sergileyerek bu maddelerin iritan olmayanlar olarak sınıflandırılmasını sağlamıştır; 3, 5, 6, 9 ve 10 numaralı test maddeleri ise iritan olarak değerlendirilmiştir.Öte yandan, %60 veya daha düşük doku canlılığı sergilemişler ve bu nedenle irritan olarak sınıflandırılmışlardır. Bu deneydeki mükerrer dokular arasındaki doku canlılığı farkı, iki numaralı test maddesi hariç, test edilen tüm maddeler için %20'den azdı. Bu nedenle, iki numaralı test maddesi dışındaki tüm test maddelerinin sonuçları, göz irritasyon testi kabul kriterlerinin tamamını karşıladıkları için uygun kabul edildi.Bu videoyu izledikten sonra, kimyasalların tehlike tanımlama etiketlemesi kapsamında, in vitro yeniden yapılandırılmış insan kornea benzeri doku model dört kullanılarak DICATION testinin nasıl gerçekleştirilmesi gerektiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedür, kademeli test stratejisinin bir parçası olarak EOC D test kılavuzlarında uygulanmıştır.

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) için geçerli...

Bir In Vitro</emEpiderm> Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Bu rapor, sıçan lakrimal bez özütü, ovalbümin ve komple Freund adjuvantının bir emülsiyonu ile bağışıklaştırma yoluyla Lewis sıçanlarında kronik deneysel otoimmün göz kurumasına neden olan bir yöntem ve bunu takiben göz kapağı yumrusu ekstraktı ve ovalbümin forniceal subkonjonktiva ve lakrimal bezlere enjekte edilir. Altı hafta sonra.

Eyeball Dokusunda Efektif Hafıza T Hücrelerini Artıran Kronik Otoimmün Kuru Göz Fare Modeli

Yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilecek önemli bir araçtır. Burada, biz geliştirme ve pozlama modelleri ve kornea epitel yaralanma hidrojen florür ve polis indüklenen yüksek aktarım tarama yöntemlerini doğrulama mevcut.

Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

Bu makalede, orbital gözyaşı bezi sisteminin tüm bölümlerine konkain A enjekte ederek tavşanakut veya kronik kuru göz hastalığı neden bir yöntemin geliştirilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha önce bildirilenlerden daha üstün, farmakolojik ajanların çalışması için uygun kuru göz tekrarlanabilir, istikrarlı bir model oluşturur.

Kıprimal Bezlere Concanavalin A Enjeksiyonu ile Indüklenen Sulu-Eksik Kuru Göz Hastalığının Tavşan Modeli: İlaç Etkinliği Çalışmalarına Uygulama

Bu protokolün amacı, farklı yapay gözyaşı formülasyonlarının bir in vitro model kullanarak insan kornea epitel hücrelerinin desiccation'dan korunup korunamayacağı değerlendirmedir. Yapay gözyaşı formülasyonlarına ve desiccation maruz kaldıktan sonra, insan kornea epitel hücreleri metabolik aktivite için değerlendirilir.

Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

Bu protokol, üç boyutlu yeniden oluşturulmuş insan epidermisini tekrarlanabilir ve sağlam bir şekilde yetiştirmek için basit bir yöntemi açıklar. Ek olarak, epidermal bariyer modelinin yapı-işlev ilişkisini karakterize eder. Yeniden inşa edilen insan epidermisinin proinflamatuar uyaranlar üzerine biyolojik tepkileri de sunulmaktadır.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

Bu makalede, birincil ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattında UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.

Organ Kültürü Domuz Korneaları Kullanılarak Terapötik ve Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi ve Epitel Yara İyileşmesi

Tavşanlarda kornea stromal yara onarımı için yerinde mavi ışık-çapraz bağlanabilir jelatin–riboflavin hidrojelinin hazırlanması, zenginleştirilmesi ve uygulanması için tekrarlanabilir bir protokol sunulur; bu süreç cerrahi müdahale, kısmi tarsorrafi ve ameliyat sonrası bakım için prosedürel adımlar içerir.

Tavşanlarda Korneal yara onarımı için zenginleştirilmiş foto-çapraz bağlı jelatin–riboflavin hidrojellerin üretimi ve cerrahi uygulaması

Öğrenin göz tahriş testini RhCE doku modeli kullanarak toksikolojide uygulamayı. Bu yöntem, maddelerin göz tahriş potansiyelini hayvan deneyi olmadan güvenilir şekilde sınıflandırır.

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT) (Video) | JoVE Journal

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

Daha fazla video keşfet