Plazmid kökenli Uygulama Kimyasal Reaksiyon Ağları için DNA Strand Deplasman kapıları

Bu prosedürün genel amacı, bakteri plazmitlerinden DNA ipliği yer değiştirme kapıları türetmektir. Bu tekniğin ana avantajı, sağlam DNA kapıları oluşturmak için oldukça saf bir kaynak olarak bakteri plazmidini kullanmasıdır. Bu prosedürü gösteren meslektaşlarım Sam Dip ve ben olacağız: Toplu üretime başlamak ve daha sonra ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ve üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA izolasyon kitlerini kullanarak içeren DNA kapılarını izole etmek.

Standart teknikler kullanarak plazmit DNA konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, plazmidin her miligramı için dört birim kısıtlama enzimi PV U2 HF ekleyerek DNA'yı sindirin. Ardından, numuneye iki eşdeğer hacimde buz gibi mutlak etanol ekleyin.

DNA'yı çökeltmek için karışımı eksi 80 santigrat derecede en az bir saat inkübe edin. Daha sonra, numuneyi 30 dakika boyunca 10.000 ila 14.000 kez G ve sıfır santigrat derecede santrifüjleyerek çökeltilmiş DNA'yı peletleyin. SNAT'ı çıkarın ve numuneye 1000 mikrolitre oda sıcaklığında% 95 etanol ekleyin.

Daha sonra numuneyi 10 ila 15 kez ters çevirin, numuneyi 10 dakika boyunca 10.000 ila 14.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Bittiğinde, süpernatanı çıkarın ve DNA'yı bir tezgahta 10 ila 20 dakika havayla kurutun. Süpernatanı çökelmiş DNA'dan çıkarırken, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin, aksi takdirde verim önemli ölçüde azalacaktır.

Kuruduktan sonra, DNA peletini 200 mikrolitreye kadar nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın ve karıştırmak için girdap yapın. 200 mikrolitreden fazla su eklemek genellikle numunenin kullanım için seyreltilmesini sağlar. Kinetik deneylerde, üreticinin talimatlarını izleyerek bir spektrofotometre kullanarak yeniden askıya alınan DNA'yı ölçün.

Daha sonra, bir mikrogram plazmid başına bir tane olmak üzere dört birim çentikleme enzimi M-B-B-S-R-D ekleyin ve karşılık gelen enzim tamponunu ekleyin. Eklem kapılarını sindirmek için numuneyi 65 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, bir mikrogram plazmit başına bir tane olmak üzere sekiz birim çentikleme enzimi NT BST mb ve karşılık gelen enzim tamponu ekleyerek çatal kapılarını sindirin.

Numuneyi 55 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Floresan raportörleri hazırlamak için önce Resus, numuneleri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi askıya alın ve nicelleştirin. Daha sonra 10 mikrolitre muhabirin alt ipliği ile 13 mikrolitre üst söndürücü ipliği 12.5 milimolar magnezyum içeren tris asetat EDTA tamponunda karıştırın.

Tüm floranın, etiketli dört ipliğin söndürüldüğünden emin olmak için, söndürücü etiketli ipliğin% 30'undan fazlası eklenmelidir. Ardından, bir termal döngüleyici kullanarak muhabir C kompleksini anil. Numuneyi dakikada bir santigrat derece hızında 95 santigrat dereceden 20 santigrat dereceye kadar soğutun.

Bittiğinde, kalibrasyonu takiben numuneyi dört santigrat derecede saklayın. Sıcaklık stabilize olurken önce sıcaklık kontrol cihazını 25 santigrat dereceye ayarlayarak floresan ölçümlerine başlayın. Veri toplama yazılımında kinetik ölçümler için uygun parametreleri ayarlayın.

Spektral florimetre için yazılımı açtıktan sonra, hem uyarma hem de emisyon monokrom için kayma genişliğini 2,73 nanometre olarak ayarlayın. Ardından entegrasyon süresini her 10. zaman noktası için 62 saniyeye ayarlayın ve toplam ölçüm süresini 24 saate ayarlayın. Son olarak, uyarma ve emisyon dalga boylarını deneyde kullanılan flora ormanına uyacak şekilde ayarlayın.

Daha sonra, sentetik bir kuvars hücreye 410.2 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve 125 milimolar magnezyum içeren 52.8 mikrolitre 10 ekstra asetat EDTA tamponu ekleyin. Ayrıca iki mikrolitre 300 milimolar poli T ipliği ekleyin ve ardından sentetik kuvars hücresini 10 ila 15 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra, 10 mikromolar'da raportör ipliklerinin dokuz mikrolitresinde ve 10 mikromolar'da her yardımcı iplikçikten altı mikrolitre.

Daha sonra hem eklem hem de çatal kapaklarının 45 mikrolitresinde bir mikromolar halinde ve çözeltiyi en az 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Son olarak, dokuz mikrolitrede% 10 sodyum,% 0.15'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için duktal sülfat yapın,% 0.15'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için, en az 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek reaksiyonu nazikçe karıştırın, sentetik litre hücrelerini hemen spektrum oluk odasına yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın. Beş dakikalık ölçümden sonra, giriş tellerinden üç mikrolitre ekleyin.

Sentetik litre hücresine 10 mikromolar ekleyin. Veri toplama programı duraklatıldığında, reaksiyonu en az 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve ardından ışık kapağını kapatın ve sabit olana kadar reaksiyon kinetiğini kaydetmeye devam edin. Plazmadan türetilen kapılar ve sentezlenen kapılar için durum kinetik verileri burada deneylerde gösterilmiştir.

Sinyal dizisi A'nın konsantrasyonu sabittir, katalitik sinyal B'nin miktarı değişirken. C sinyali, reaksiyonun ilerlemesini kesintiye uğratmadan okumak için kullanılır. Katalitik döngü devri, belirli bir zamanda her bir katalizör B için üretilen C sinyalinin miktarı olarak tanımlanır.

İdeal bir katalitik sistem için, bu devir sayısı zamanla doğrusal olarak artmalı ve substrat sınırlayıcı olmadığı sürece katalizör miktarından bağımsız olmalıdır. Burada, sentezlenen sistemin, plazmadan türetilen sistemden çok daha önce ideal doğrusal devir artışından saptığı ve katalizörün istenmeyen bir yan reaksiyon yoluyla sekestrasyonunu gösterdiği gözlenmektedir. Hem plazmadan türetilen hem de sentezlenen kapıların devre sızıntısı burada karşılaştırılır ve plazmadan türetilen kapılar kullanılarak yapılan sızıntı sinyalinin oranının, 10 saatlik reaksiyondan sonra sentezlenen kapılar kullanılandan yaklaşık %8 daha az olduğu gözlemlenir.

Bu videoyu izledikten sonra, bakteri plazmidinden sağlam DNA kapılarının nasıl oluşturulacağını ve kapıları floresan kinetik ölçümlerini kullanarak nasıl test edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.