Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Bu prosedürün genel amacı, birkaç farklı DNA kaynağından kısa ve uzun segmentleri birleştiren büyük, karmaşık DNA yapıları oluşturmak için Gibson montaj yaklaşımını kullanmaktır. Önce plazmitlerin tam nükleotid dizisini hesaplamalı olarak tasarlayın ve ardından üst üste binen primer setleri tasarlayın. Daha sonra, montaj reaksiyonu için DNA şablonları PCR ile amplifiye edilir.

Daha sonra, PCR ürünlerinin saflaştırılması gerçekleştirilir. Son adım, elde edilen plazmitlerin montaj reaksiyonu dönüşümü ve plazmit klonunun doğrulanmasıdır. Sonuç olarak, Gibson montaj reaksiyonu, insan uzama faktörü bir alfa promotörünün, transkripsiyonel regülasyonu altında, vahşi tip ve mutant CSTF 64 proteinlerinin bayrak etiketli versiyonlarını içeren paralel plazmitlerde geliştirmek için kullanılır.

Bu tekniğin geleneksel DNA Corning gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, sıralı Corning adımları olmadan paralel olarak, tasarım açısından benzer, vahşi tip ve mutant plazmitler oluşturabilmesidir. Son plazmidi temsil etmek için sürekli bir nükleotid dizisi tasarlayın. Şimdi, tek veya çoklu sentetik çift sarmallı DNA fragmanları olarak farklı etiket ve promotör kombinasyonları gibi, kolayca bulunamayan PCR sırasına göre DNA fragmanlarında şablon olarak kullanılacak gerçek plazmitleri ve DNA fragmanlarını listeleyin.

Daha sonra, son yapının sürekli nükleotid dizisini PCR için uygun DNA parçalarına bölün. Fragmanların mevcut plazmitler ve sentetik DNA fragmanları ile eşleştiğini onaylayın. 200 nükleotidden daha küçük DNA parçalarından kaçının.

Astar oluşturma aracına erişmek için bir sonraki adımda, Gibson montaj ayarlarını değiştir açılır penceresindeki tercihleri ayarla menüsünü seçin. Basın değiştir sekmesini seçin, ardından bölünmüş DNA parçalarını primer oluşturma aracına beş asaldan üç asal uca sırayla eklemek için yapı yapısı menüsünü seçin. Enter vektör veya parça ekle penceresini açın, vektör DNA'sının beş asal ucunu temsil eden ilk DNA parçasını hızlı A formatında yapıştırın ve bu DNA parçasını adlandırın.

DNA parçasını elde etmek için uygun yolu seçin. Ardından devam sekmesine tıklayın. Son yapının birleşim yerinde ekstra nükleotidler veya kısıtlama bölgeleri eklemeye ihtiyaç varsa, ileri veya geri astar ara parçası alanlarındaki montaj penceresine ekle ve ekle parçasını açın.

Ekstra nükleotidleri veya kısıtlama bölgelerini DNA parçalarından sadece birine girin. Ardından bitti sekmesine tıklayın. Yapı tamamlanana kadar tüm parçalar için tekrarlayın.

Astarları görüntüle menüsünü seçin ve astar dizilerini gözden geçirin. Ayrıca tüm yapılar, vektörler, omurgalar ve ekler veya farklı DNA parçaları için tekrarlayın. PCR primerlerini su veya te tamponu içinde 10 mikromolar olacak şekilde seyreltin.

Daha sonra PCR'ler için tüm DNA şablonlarını ve tek sarmallı sentetik DNA'ları suda mikrolitre başına bir nanograma seyreltin. Her bir primerin 2,5 mikrolitresini 10 mikromolar birleştirerek PCR reaksiyonlarını oda sıcaklığında birleştirin. Mikrolitre başına bir nanogram şablon DNA parçası 25 mikrolitre sıcak.

DNA polimeraz ve 19 mikrolitre suyu düzeltmeye başlayın. Tüpü hafifçe vurarak karıştırın ve kısa santrifüjleme ile sıvı damlacıklarını toplayın. Kullanılan DNA polimeraz önerilerine göre benzer büyüklükteki DNA parçalarını ayrı tüplerde aynı anda çoğaltın.

25 ila 28 PCR döngüsü gerçekleştirin veya yeterli DNA verimi sağlayan döngü sayısını belirleyin. Standart AROS jel elektroforezi kullanarak PCR'nin beş mikrolitresini çözün. PCR ürününü temsil eden tek bir DNA bandının görünür olduğunu doğrulayın.

Gerekirse DNA moleküler ağırlık standartlarını kullanarak DNA parçalarının boyutunu ve nispi miktarını belirleyin, yeterli miktarda DNA parçası elde etmek için PCR'yi tekrarlayın. DPN ile önceden sindirilmiş PCR'leri bir ila 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve her tüpe 81 mikrolitre DNA saflaştırma manyetik boncukları ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Tüpleri iki dakika boyunca manyetik kollektörün üzerine yerleştirin. Şimdi berrak sıvıyı atın. 30 saniye boyunca 200 mikrolitre% 80 etanol ile iki kez yıkayın.

Daha sonra kurutulmuş boncukları 10 mikrolitre 10 milimolar tris hidroklorür pH 8.0 içinde yeniden süspanse edin İki dakika sonra kısa bir süre döndürün ve ardından tüpleri iki dakika boyunca manyetik kollektör üzerine yerleştirin. Berrak çözeltinin 8,5 ila 10 mikrolitresini çıkarın ve önceden etiketlenmiş yeni bir tüpe yerleştirin. UV spektroskopisi ile DNA fragmanlarının konsantrasyonunu belirleyin.

Vektör omurgasını temsil eden en az 100 nanogram DNA parçası veya seçici işaretleyiciyi taşıyan DNA parçası kullanın. Ek olarak kullanılacak DNA parçaları için üç katlı molar fazlalığı hesaplayın. Hesaplanan DNA parçaları miktarlarını bir PCR tüpünde karıştırın.

Ardından sesi 10 mikrolitreye ayarlayın. 10 mikrolitre Gibson montaj ana karışımını ekleyin. Reaksiyonu bir PCR termal döngüleyicide 50 santigrat derecede inkübe edin.

Montaj ürününün yetersiz e coli'nin dönüşümüne devam edin veya ürünleri ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede dondurun. Kimyasal veya elektro yetkin hücrelere eşlik eden dönüşüm prosedürünü takip edin. Genellikle dönüşüm reaksiyonu başına iki mikrolitre montaj reaksiyonu kullanın.

Son olarak, spesifik veya standart primerler kullanarak DNA dizilimi ile DNA klonlama başarısını onaylayın. Sıralama verilerini doğruluk açısından analiz edin. Bu deney, bölünme stimülasyon faktörü proteini 64'ü ve ayrıca mutant CSTF 64'ü klonlamak için tasarlanmıştır.

Proteinler, HE F1 alfa promotörünün, ifade düzenlemesi altında üç x bayrak etiketine kaynaştı. HE F1 alfa ve ardından üç x bayrak etiketi içeren bir plazmit bizim için mevcut değildi. Bununla birlikte, aşağıdaki plazmitler mevcuttu.

PC DNA'sı 3.1 M hiss HF, plazmit ve fare CSTF 64 plazmidleri içeren bir alfa. Yapı için tüm dizi, nükleotid ve metin düzenleme uygulamaları kullanılarak bir araya getirildi. Daha sonra, dizi, mevcut plazmit DNA'larına karşılık gelen dört uygun parçaya bölündü.

Montaj reaksiyonları için dört DNA fragmanı PCR ile amplifiye edildi. Bireysel klonlardan elde edilen plazmitler, pc DNA vektörüne uygun montaj için kısıtlama enzim sindirimi ile amplifiye edildi ve analiz edildi, Seçilen klonlar daha sonra dizileme ile doğrulandı. Plazmid ve birincil tasarım dahil olmak üzere montaj tekniğine hakim olduktan sonra, birincil ve sentetik DNA sentezi ve iletimi için gereken süre hariç olmak üzere beş gün içinde sonraki PCR ve iletişim doğrulaması gerçekleştirilebilir.