Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

DNA biyoçipleri, in vitro gen devrelerinin uzun süre ler boyunca çalışmasını sağlayan BASF grubu tarafından geliştirilen, kendi kendini yeniden sentetik biyoloji için cazip bir araştırma platformudur. Bu protokolle, bu teknolojiyi daha geniş bir araştırmacı yelpazesine sunmayı umuyoruz. Befor litografi olarak adlandırdığımız yöntemimiz, DNA iplikçik yer değiştirme reaksiyonuna dayalı DNA'nın immobilizasyonu için bir stratejiyi temsil ediyor.

Bu tekniğin gücü, çok aşamalı litografik yetenekleri, basit tekrarlanabilirliği ve tüm bileşenlerin ticari kullanılabilirliği ile ilgilidir. Diğer biyoçip çözümlerine benzer şekilde, bephore farklı teknolojilerle kombine edilebilir. Örneğin, fonksiyonel gen fırçaları protein ekspresyonu için mikro bölmeler içinde monte edilebilir.

Başlamak için, bir cam kabında% 30 amonya çözeltisi bir parçası ile beş parça su karıştırarak bir RCA karışımı hazırlamak. Karıştırırken karışımı sıcak bir tabakta 70 dereceye ısıtın. Bir kez 70 santigrat derece ulaşır, bir parçası% 30 hidrojen peroksit ekleyin.

Sonra çözelti içine 100 milimetre çapında silikon gofret yerleştirin, ondan organik madde ve parçacıklar kaldırmak için. 30 dakika sonra, substrat çıkarmak, iyice bir yıkama şişesi su ile durulayın ve bir azot tabancası ile kurulayın. Hemen substrat PEGylation ile devam edin.

Bunu başarmak için, ilk seyreltik biotin-PEG-Silane kuru toluen mililitre başına 5 miligram, ve girdap çözeltisi kadar iyice karıştırılır. Bir cam Petri kabına yerleştirilen substrat ile, yavaş yavaş tüm yüzeyi kaplayan, substrat üzerine çözelti pipet, ama çözüm kenarına akmasına izin kaçının. Yüzey kapatıldıktan sonra Petri kabını kapatın ve ek bir kapak ekleyin.

30 dakika sonra kapağı çıkarın ve Petri kabına yaklaşık 40 mililitre isopropil alkol ekleyin. Sonra substrat çıkarmak, tekrar iyice izopropil alkol ile durulayın ve bir azot tabancası ile kurulayın. Kuruduğunda, gerekli olana kadar karanlıkta substrat saklayın.

Bir santimetre parçalar tarafından bir santimetre oluşturmak için bir cam kesici veya neşter kullanarak bir substrat hazırlayın. Daha sonra, merkezden substrat kenarına doğru kısa bir çizik yaparak basit bir hizalama işareti ekleyin. Azot tabancası kullanarak çipteki küçük parçacıkları patlatın.

Daha sonra, iki bileşenli silikon tutkal iki damlacık karıştırın ve çizik ucu etrafında alan boş bırakarak, çip yüzeyine tutkal uygulayın. Orada tutkal bir hidrofobik bariyer sağlar, çip üzerinde sulu çözeltiler tutarak. Bu sonraki yıkama adımlarını kolaylaştırır ve kuluçka için gerekli DNA miktarını azaltır.

Daha sonraki bir adımda, tutkal kolayca soyulmuş olabilir. Aşağıdaki adımlarda, fotocleavable DNA sadece sarı ışık ortamında işlenir. Oda sıcaklığında bir befor karışımı yaklaşık 10 mikrolitre ile çip kapağı ve buharlaşmayı azaltmak için kısmen su ile dolu bir kutu ya da çip yerleştirin.

Bir saat sonra, herhangi bir bağlanmamış befor karışımı kaldırmak için PBS ile çip birkaç kez yıkayın. Sonra, çipe pasifasyon karışımından 10 mikrolitre ekleyin. İki saat sonra, bağlanmamış pasifasyon ajanlarını çıkarmak için çipi PBS ile birkaç kez yıkayın.

Uygun bir maske tutucusu sığdırmak için baskılı bir fotoğraf maskesini uygun boyuta kesin. Alan durağının konumuna takın ve maskeyi tutucuda hizalamak için hizalama işaretlerini kullanın. Mikroskop aşamasına yerleştirilen substrat ile, aydınlatma yoluna kırmızı bir filtre yerleştirin ve substrat yüzeyine odaklanın.

Daha sonra, maruz kalacak substrat bölgeye gidin. Ardından maske tutucuyu takın, aydınlatmayı engelleyin ve UV filtresine değiştirin. Düşük ışık yoğunluğunda deklanşörü açın ve maskeyi substrata hızla odaklamak için kamerayı kullanın.

Alt tabaka şimdi hizalanmış ve maske odakta, kameraya ışık yolunu engelleyin ve istenilen pozlama süresi için yüksek ışık yoğunluğunda substratı aydınlatın. Pozlamadan sonra, numuneyi mikroskoptan çıkarın ve kurutmadan mümkün olduğunca fazla arabelleği substrattan dikkatlice çıkarın. Daha sonra, yüzeye bağlanma sırası ile 10 ila 20 mikrolitre DNA ekleyin.

Kurumasını engellemek için substratı ıslak bir kutuya yerleştirin ve DNA'yı oda sıcaklığında iki saat boyunca substrat üzerinde kuluçkaya yatırın. Ters bir mikroskopüzerinde bölümlenmiş gen ekspresyonunu gözlemlemek için, önce numune tutucunun iki parçasını ayrı ayrı hazırlayın. Çift taraflı yapışkan bant kullanarak, hareketsiz gen fırçası ile bir befor çipi talaş ile talaş ile fiş tutucuya yapıştırarak başlayın.

Daha sonra, tutucunun alt kısmının orta deliğine biraz vakum yağı ekleyin ve talaş tutucuyu takın. Şimdi tutucunun üst kısmını birleştirin. Mümkün olduğunca küçük bölmeleri ile ince bir PDMS çip kesin, daha sonra difüzyon Sonraki tarafından atık ve öncümoleküllerin değişimi için izin vermek için bir tarafa açık bir kanal bırakarak, plazma tedavi oksijen plazma ile PDMS çipin arka tarafında bir cam kapak kayma.

Tedaviden hemen sonra, PDMS çipini cam kaydıraktan sonra bölmeleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Sonra, 70 santigrat derece bir saat PDMS ile cam pişirin. Numune tutucunun tamamını montajdan kısa bir süre önce, cam kaydırağı DAHA ÖNCE OLDUĞU GIBI PDMS çiple plazma gibi tedavi edin.

Daha sonra, üst tutucunun büyük deliğinin etrafına biraz vakum yağı ekleyin ve üzerine PDMS içeren cam kaydırağı yerleştirin. Bardağı yavaşça yağın üzerine bastırın. Arabelleği çipten dikkatlice çıkarın ve 10 mikrolitre kendini yeniden ifade sistemiyle bir kez yıkayın.

Daha sonra, çip üzerine 60 mikrolitre kendini yeniden ifade sistemi ekleyin ve kenarlardan iki bileşenli silikon tutkal çıkarın. Şimdi, PDMS üzerine ifade sisteminin 20 mikrolitre ekleyin. Damlacık'ı PDMS'ye yerleştirdikten sonra, bölmelerin ıslak ve hava kabarcıkları olmadan stereoskopik mikroskobu hızlıbir şekilde kontrol edin.

Hava kabarcıkları varsa, onları yıkamaya çalışın. Tutucunun iki parçasını birleştirmek ve odaları ve DNA fırçalarını hizalamak için stereoskopik mikroskop altında çalışır. İki vida ve wingnuts her iki elinizle kolayca erişilebilir böylece bir kavrayedici kol ile alt tutucu immobilize.

Üst tutucuyu alt tutucuya takın ve hücresiz ifade sistemi damlacıkları kaynayana kadar indirin. Ardından, bölmelerin ve hizalama işaretinin XY düzleminde benzer bir bölgede olduğundan emin olun. Alttan, tutucunun alt tarafına dokunana kadar kanat larını vidalayın.

XY düzlemindeki bölmeleri ve çipi hizalarken kanatsoklarını hafifçe sıkın. Bu adım biraz deneyim gerektirir ve numune tutucunun yapısına bağlıdır. PDMS çip üzerine sadece nazik bir kuvvetle bastırılmalıdır.

Daha sonra, su ile anti-buharlaşma muhafaza bir sünger sprey ve kutuya tutucu yerleştirin. Sonra, iki bileşenli silikon tutkal ile beş mililitrelik şırınga doldurun ve kutumühür için kullanabilirsiniz. Son olarak, kutuyu sıcaklık kontrollü bir mikroskoba aktarın ve floresan mikroskop kullanarak DNA fırçasını ve reaksiyonu görüntüleyin.

Burada before cam bir slayt üzerinde gerçekleştirilen iki aşamalı litografik işlem, floresan olarak etiketlenmiş DNA iplikçiklerinin üst üste binme desenlerini verir. Çip teki gen ekspresyonunun bu gösteriminde, DNA soldaki odada hareketsiz hale getirilmiştir. İfade karışımına maruz kaldığında, sarı floresan protein YPet immobilize DNA'dan sentezlenir.

Gen ekspresyonu sisteminin aktivitesini değerlendirmek için, floresan kurtarma bir beyazlatma adımı sonra gözlenir. İki saat sonra floresan şiddeti hızla düzeldi. Ancak, dört ve altı saat sonra, ifade karışımı taze bir kaynağı olmadan, reaksiyon saat dört civarında sona erdiğini belirten, kurtarmak vermedi.

Gen ekspresyonu kapalı bir sistemde sınırlı olmasına rağmen, mikro-akışkanlar aracılığıyla ek öncül moleküller ile ekspresyon bölmeleri temin ederek uzun süreler boyunca sürdürülebilir. Befor yöntemi, kendi kendine yeniden gen ekspresyonu için etkileşimedebilen DNA fırçalarının sistemlerini oluşturmak için uygulanabilen oligonükleotidleri veya gen uzunluğu DNA'sını hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Bu teknik aynı zamanda biyofizikteki tek moleküllü floresan çalışmaları gibi diğer uygulamalar için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, gofret veya cam slaytlar bephore biyoçipler imal etmek ve araştırma projelerinize entegre etmek gerekir.