Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan trigeminal ganglionların ve diş germlerinin nasıl izole edileceğini ve birlikte kültür edileceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle mikroakışkan cihazların sterilize edilmesi, monte edilmesi ve kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, ilgili faredeki belirli bir gelişim evresinden trigeminal ganglionların ve diş germlerinin diseke edilmesidir.

Ardından, trigeminal ganglionlar ve diş germleri mikroakışkan cihazlara yerleştirilir ve birlikte kültüre edilir. Son adım, hücrelerin fikse edilmesi ve immünofloresans kullanılarak boyanmasıdır. Nihayetinde, birlikte kültürün sonucu olan innervasyon paternini göstermek için mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin geleneksel ko-kültürler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, farklı organ ve dokuların her birinin kendi optimal kültür ortamında ko-kültür edilmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, farklı moleküllerin diş inovasyonundaki rolü ve inovasyonun diş gelişimindeki kuralı gibi yapay inovasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir çift mikrodiseksiyon pensi ve bir makas içeren diseksiyon aletlerini otoklavlayarak başlayın.

Ardından, 24 mm x 24 mm boyutundaki bir grup cam lamelleri, 37 °C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 M hidroklorik asit çözeltisi içinde 24 saat bekleterek sterilize edin. Daha sonra lamelleri üç kez steril distile su ile yıkayın, ardından üç kez %99 Ethanol ile durulayın ve steril bir laminar flow kabininde kurutun; kuruduktan sonra kabinin UV ışığını 30 dakika boyunca açık tutun. Son olarak, lamelleri ihtiyaç duyulana kadar %70 ethanol içerisinde saklayın.

Ardından, steril pensler kullanarak akson izolasyon mikroakışkan cihazlarını paketlerinden dikkatlice çıkarın ve steril bir milimetrelik biyopsi punch'ı kullanarak steril bir Petri kabına yerleştirin. Kültür odacıklarına karşılık gelecek şekilde, her örnek için cihazlarda bir delik açın.

Basınç nedeniyle zarar görebilecekleri için mikro oluklara çok yakın noktadan delik açmamaya dikkat edin. Ardından, cihazları %70 ethanol içine daldırarak sterilize edin. Bu sırada hapsolmuş tüm havayı çıkardığınızdan emin olun.

Ardından cihazları etanolden çıkarın ve steril bir akışlı kabinde tamamen kurutun. Ayrıca, lamel camları %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve steril akışlı kabinde kurumaya bırakın. Devam etmeden önce en az üç saat bekleyin.

Her bir lamelliği altı kuyucuklu bir plaka içindeki bir kuyucuğa yerleştirin. Ardından mikroakışkan cihazı lamelliğin üzerine yerleştirin ve izolasyon cihazı ile cam lamellik arasında tam yapışma sağlamak için pensle hafifçe ancak sıkıca bastırın. Sonrasında, her bir kültür odasına 150 µL 0,1 mg/mL poly D lycine pipetleyin.

Ardından, odacıklardaki tüm havayı tahliye etmek için mikroakışkan cihazları beş dakika boyunca vakum altına alın. Odacıkların içinde hala hava görülüyorsa, poli-D-lizin çözeltisini odacıklara ekleme işlemini tekrarlayın.

Cihazları gece boyunca 37 °C'de poly-D-lysine ile inkübe edin ve ertesi gün işlemeye devam edin. Odacıkları üç kez steril distile su ile yıkayın, ardından odacıkları 150 µL 5 µg/mL'lik lamin çalışma çözeltisi ile doldurun ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Daha sonra, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde trigeminal ganglion ve diş germi kültürleri için besiyerlerini hazırlayın.

Diseksiyon alanını ve stereoskopu %70 etanol ile temizleyin ve sakrifikasyon sonrası diseksiyon aletlerini yerleştirin. E 14.5 ile E 17.5 evresi fare embriyolarına sahip gebe bir farenin alt karın bölgesindeki deriyi disseke edin. Ardından, karın bölgesini makas kullanarak dikkatlice açın.

Uterusu bulun, yerinden çıkarın ve buzla doldurulmuş bir tüpe yerleştirin. Embriyoları soğuk PBS kullanarak diseke edin ve her birini buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına tek tek yerleştirin. Tüm embriyolar ekstra embriyonik dokulardan ayrıldıktan sonra, makas kullanarak onları dekapite edin.

Mikro diseksiyon makası kullanarak, trigeminal ganglionlara zarar vermemeye dikkat ederek alt çeneyi başın geri kalanından ayırın. Ardından, başı alıp soğutulmuş bir diseksiyon cam Petri kabına yerleştirin. Deriyi ve kafatasını çıkarmak için pens kullanın.

Ardından penseti sefalonun altına yerleştirin ve yukarı kaldırın. Sefalonu ve serebellumu çıkarmak için trigeminal ganglionları belirleyin; trigeminal ganglionları trigeminal sinirlerden ayırmak ve ganglionları temizlemek için penset ve diseksiyon iğnelerini kullanın. Diseksiyon iğnelerini bıçak gibi kullanarak bunları soğuk PBS içerisinde muhafaza edin.

Dili ve çene çevresindeki deriyi çıkarın. Çenenin orta hattı boyunca keserek sol ve sağ hemi çeneleri birbirinden ayırın. Ardından diş germlerini bulun ve trigeminal ganglionlar ile diş germlerinin diseksiyonundan sonra diseksiyon iğneleri kullanarak bunları izole edin; mikroakışkan cihazlardaki laminini temizleyin ve odacıkları 200 microliters ilgili besiyeri ile doldurun.

Diseke edilmiş trigeminal ganglionları ve diş germlerini, biyopsi punchı ile açılan deliklere pens yardımıyla nazikçe aktarın. Diş germlerinin yüzeyde kalmadığından ve lamellerle temas edene kadar dibe çöktüğünden emin olun. Örnekleri 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde kültüre edin.

Besiyerini değiştirmek için 10 gün boyunca her 48 saatte bir kültür ortamını yenileyin. Öncelikle, pipeti kuyucukların dış kısmına doğru yönlendirerek besiyerini uzaklaştırın. Ardından, kültür süresi boyunca taze ön ısıtmalı besiyerini, kuyucukların odacıkların karşısında yer alan tarafına ekleyin.

Işık mikroskobunu kullanarak ko-kültürlerin herhangi bir zamanda görüntüsünü alın. Kültür süresinin ardından, her bir bölme başına bir kuyucuğa 150 µL PBS pipetleyerek ve PBS'nin bölmeler boyunca akmasını sağlayarak bölmeleri yıkayın. Son yıkılamayı takiben yıkama işlemini toplamda üç kez tekrarlayın.

PBS'yi uzaklaştırın ve her bölmedeki bir kuyucuğa 150 µL %4 paraformaldehit (PBS içinde) ekleyip diğer bölmeye akmasını sağlayarak örnekleri fikse edin. Cihazı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından bölmeleri iki kez PBS ile yıkayın ve immünofloresan boyama ile büyümenin görüntülenmesi gibi ileri analizlerle devam edin.

Ko-kültür sırasında, trigeminal ganglionlardan gelen nöritler kültür bölmesinden dışarı doğru dallanır ve gelişmekte olan diş germine doğru uzanır. Daha yüksek bir büyütmede, nöritlerin mikroakışkan cihazdaki aksonal odacıklar ve mikro oluklar boyunca uzandığı görülebilir. Sinir büyümesinin ilerleyişi, inovasyon gelişimini tanımlamak için zaman içinde takip edilebilir.

Bu prosedürün ardından, örneğin inovasyon sonrası hedef dokulardaki gen ekspresyonu veya protein sekresyonundaki değişiklikleri incelemek amacıyla RNA analizi veya PROTEINIZATION gibi diğer yöntemler uygulanabilir.