Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan trigeminal gangliyonların ve diş mikroplarının nasıl izole edileceğini ve birlikte kültürleneceğini göstermektir. Bu, önce mikroakışkan cihazların sterilize edilmesi, monte edilmesi ve kaplanması ile gerçekleştirilir. İkinci adım, trigeminal gangliyonları ve diş mikroplarını ilgilenilen farede belirli bir gelişim aşamasından diseksiyon etmektir.

Daha sonra, trigeminal gangliyonlar ve diş mikropları mikroakışkan cihazlara yerleştirilir ve birlikte kültürlenir. Son adım, hücreleri sabitlemek ve immünofloresan kullanarak lekelemektir. Sonuç olarak, ko-kültürün sonucu olan innervasyon paternini göstermek için mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin, konvansiyonel kokültürler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu yöntemin her biri kendi optimal kültüründe farklı organ ve dokuların kokültürüne izin vermesidir. Orta. Bu yöntem, farklı moleküllerin diş inovasyonu üzerindeki rolü ve diş gelişiminde inovasyon kuralı gibi yapay inovasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir çift mikrodiseksiyon forseps ve bir çift makas içeren diseksiyon aletlerini otoklavlayarak başlayın.

Daha sonra, 24 milimetre x 24 milimetrelik bir cam kapak fişi partisini, 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir molar hidroklorik asit çözeltisine yerleştirerek sterilize edin. Daha sonra kapak fişlerini steril damıtılmış su ile üç kez yıkayın, ardından %99 Etanol ile üç kez durulayın, kuruduktan sonra steril bir akış başlığı altında kurutun, davlumbaz UV ışığını 30 dakika boyunca açın. Daha sonra kapak fişlerini ihtiyaç duyulana kadar% 70 etanol içinde saklayın.

Daha sonra, akson izolasyon mikroakışkan cihazlarını ambalajlarından dikkatlice çıkarmak için steril forseps kullanın ve steril bir milimetre biyopsi zımbası kullanarak steril bir Petri kabına yerleştirin. Her numune için cihazlarda bir delik oluşturun. Kültür odalarının yazışmalarında.

Basınçtan zarar görebilecekleri için mikro oluklara çok yakın delmemeye dikkat edin. Daha sonra, cihazları% 70 etanol içinde ortaya çıkararak sterilize edin. Sıkışan havanın tamamını dışarı atmaya özen gösterin.

Daha sonra cihazları etanolden çıkarın ve steril bir akış başlığı altında tamamen kurutun. Ayrıca, kapak fişlerini %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve steril akış başlığının altında kurumaya bırakın. Devam etmeden önce en az üç saat bekleyin.

Her bir kapak kızağını altı kuyulu bir plaka içindeki bir kuyuya yerleştirin. Ardından mikroakışkan cihazı kapak kızağına yerleştirin ve izolasyon cihazı ile cam kapak kızağı arasında tam yapışmayı sağlamak için forseps ile nazikçe ama sıkıca bastırın. Daha sonra, kültür odalarının her birine mililitre başına 0.1 miligram 150 mikrolitre pipetleyin, poli D lizin.

Ardından, odalardaki tüm havayı çıkarmak için mikroakışkan cihazları beş dakika boyunca vakum altına yerleştirin. Odaların içinde hala hava görülebiliyorsa. Poli D lizin çözeltisini odalara geri koyun.

Cihazları ertesi gün 37 santigrat derecede gece boyunca poli de lizin ile inkübe edin. Hazneleri üç kez steril damıtılmış suyla yıkayın ve ardından hazneleri mililitre başına 150 mikrolitre beş mikrogram, lamin çalışma solüsyonu ile doldurun ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi trigeminal gangliyonlar ve diş germ kültürleri için onarım ortamı.

Diseksiyon bölgesini ve stereoskopu %70 oranında etanol ile temizleyin ve diseksiyon aletlerini fedakârlık sonrası yerleştiriniz. Evre E 14.5 ila E 17.5 fare embriyoları ile hamile bir farenin alt karın çevresindeki cildi inceleyin. Sonra makas kullanarak karnı dikkatlice açın.

Rahmi bulun, çıkarın ve buzla dolu bir tüpe yerleştirin. Soğuk PBS: embriyoları inceleyin ve tek tek buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına yerleştirin. Tüm embriyolar ekstra embriyonik dokulardan çıkarıldıktan sonra, makas kullanarak başlarını ayırın.

Trigeminal gangliyonlara zarar vermemeye dikkat ederek mikro diseksiyon, makas kullanarak alt çeneyi başın geri kalanından ayırın. Ardından, kafayı alın ve soğutulmuş bir diseksiyon camı Petri kabına yerleştirin. Cildi ve kafatasını çıkarmak için forseps kullanın.

Sonra forsepsleri sefalonun altına yerleştirin ve kaldırın. Sefalon ve beyinciği çıkarmak için, trigeminal gangliyonları lokalize edin ve trigeminal gangliyonları trigeminal sinirlerden ayırmak ve gangliyonları temizlemek için forseps ve diseksiyon iğnelerini kullanın. Diseksiyon iğnelerini bıçak olarak kullanarak soğuk PBS'de saklayın.

Dili ve çeneyi çevreleyen cildi çıkarın. Çenenin orta hattı boyunca keserek sol ve sağ hemi çeneleri ayırın. Daha sonra diş mikroplarını bulun ve trigeminal gangliyonların ve diş mikroplarının diseksiyonundan sonra diseksiyon iğneleri kullanarak izole edin, laminini mikroakışkan cihazlardan çıkarın ve odaları ilgili ortamın 200 mikrolitresi ile doldurun.

Forseps ile, diseke edilmiş trigeminal gangliyonları ve diş mikroplarını biyopsi zımbası ile oluşturulan deliklere nazikçe aktarın. Diş mikroplarının yüzmediğinden ve kapak kızaklarına temas edene kadar battığından emin olun. Kültür, numuneler 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde.

Ortamı değiştirmek için kültür ortamını 10 gün boyunca her 48 saatte bir değiştirin. İlk olarak, pipeti kuyucukların dış tarafına doğru tutarak ortamı çıkarın. Daha sonra, kültür döneminde odacıkların karşısında bulunan wellerin yan tarafına taze ön ısıtma ortamını ekleyin.

Işık mikroskobu kullanarak kokültürleri herhangi bir zamanda görüntüleyin. Kültür süresinden sonra, hazne başına bir oyuğa 150 mikrolitre PBS pipetleyerek ve PBS'nin haznelerden akmasına izin vererek hazneleri yıkayın. Son yıkamadan sonra yıkamayı toplam üç kez tekrarlayın.

PBS'yi çıkarın ve PBS'deki 150 mikrolitre %4 paraform aldehiti hazne başına bir kuyucuğa pipetleyerek ve diğer hazneye akmasına izin vererek numuneleri sabitleyin. Cihazı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra odaları PBS ile iki kez yıkayın ve immünofloresan boyama ve büyümenin görüntülenmesi gibi daha ileri analizlere devam edin.

Kömür kültürü sırasında, trigeminal gangliyonlardan gelen nöritler, kültür bölmesinden dallanır ve gelişmekte olan diş tohumuna doğru uzanır. Daha yüksek bir büyütmede, aksonal odacıklardan ve mikroakışkan cihazdaki mikro oluklardan uzanan nöritler görülebilir. Sinir büyümesinin ilerlemesi, inovasyon gelişimini tanımlamak için zaman içinde izlenebilir.

Bu prosedürü takiben, örneğin yeniliği takiben hedef dokulardaki gen ekspresyonu veya protein salgılanması değişikliklerini incelemek için RNA veya PROTEİNİZASYON gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.