Name: Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin, tek hücre salgılarını etiketsiz nanoplasmonik algılama ile yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte haritalamak için. Bu yöntem, hücreler arası iletişimi ve parakrin ile otokrin sinyal yollarını araştırmak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

1. Nanoyapı Fabrikasyon <ol><li> Nano fabrikasyon için alt-tabakalar olarak 170 um (No. 1.5) yaklaşık bir kalınlığa sahip 25 mm çapında bir cam lamelleri seçin. </li><li> En az 6 saat boyunca (bir sülfürik asit ve hidrojen peroksit 1 oranında 3) pirana çözeltisi içinde lamelleri bırakın. Ultra saf M 18.2 deiyonize saf su (DDW) bol miktarda piranha batırılmış lamel yıkayın. DİKKAT: Piranha asit, organik maddelerle reaksiyona girerek şiddetle ve son derece dikkatli ele alınmalıdır. </li><li> E-ışın buharlaştırma yoluyla lamelleri Mevduat 10 nm krom ince film nanoyapıların örneklenmesinden ve görüntüleme sırasında şarj etkilerini önlemek için. </li><li> Çift-katlı bir birinci tabaka 45 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de etil laktat, metil metakrilat (MMA_EL6) kopolimerden oluşan karşı Spin ve daha sonra 150 ° C&#39;de pişirilir. Daha sonra 180 ° C&#39;de fırında 45 saniye boyunca 3000 rpm&#39;de poli-metil metakrilat (950PMMA_A2) ikinci katı dönerler. </li><li> Pıtırtın iki tabakalı 300 uc / cm 2 &#39;lik bir alan dozu ile 25 kV elektron demeti litografi (EBL) kullanarak direnmek. Izopropil alkol içinde geliştirir (IPA) / metil izobütil keton (MIBK): 01/02 ve IPA içinde durulayın. </li><li> Mevduat Ti (5 nm) bir e-ışın buharlaştırıcı kullanılarak madde üzerinde / Au (80 nm) film. </li><li> Altın birikimi ardından, kopolimer iki katmanlı 4 saat aseton substrat ıslatarak karşı kaldırın. </li><li> Nanoyapı şekil ve boyutunu onaylamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile substrat inceleyin, oda sıcaklığında 60 saniye için CR-7 pürüzlendirici kullanarak ıslak etch yoluyla yüzeye kalan krom kaldırın ve sonra DDW içinde durulayın. </li><li> Dizileri arasında hücre görüntüleme için odayı terk 33 mikron merkezden merkeze dizi aralığı tasarlayın. Desen bir e-ışın yazıcı kullanarak 300 nm sahada her dizi için 20 x 20 desen nanoyapılar. Her çip 80 ± 2.5 nm yüksekliğinde tipik bir nanoyapı boyutunda 300 diziler ve 70 ± 2.5 nm Diame içeriyorter. </li><li> Boyut ve bütünlükte doğrulanması için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak dizilerin bir alt kümesini kontrol edin. </li><li> UV kürleme epoksi kullanılarak lamel arkasına bir destek halkası, tipik olarak silikon takın. </li></ol> 2. Chip Temizlik ve Öz-montajlı Monolayer Uygulaması <ol><li> % 5 hidrojen, aynı koşullar altında 5 dakika boyunca temizleme odası sonra 45 saniye için% 95 bir argon 300 mTorr karışımı içinde 40 W bir güçte, temizlik ve fiş rejenere plazma kül için. </li><li> 3 aşağıdakilerden oluşan iki bileşenli bir etanolik çözelti içinde tiol çip daldırarak hemen plazma külleme sonra, altın nano işlerlik: (CH2) SH- 1 oranında 8 -örn 3-OH (DPT) ve ya bir amin ile, bir bileşen, veya karboksil fonksiyonel grup, yani, SH- (CH2) 11 -örn 3-NH2 (spn) ya da SH- (CH2) 11 -örn 3-COOH (SPC). </li><li> Chip i bırakınn tiol Çözelti O / N kendinden monte tek tabaka (SAM) oluşturulması için. </li><li> Azot gazı ile etanol ve kuru ile çip durulayın. </li><li> Gerekirse, 4 ° C &#39;de en fazla 2 hafta içinde işlevselleştirilmiş çip saklayın. </li><li> Kullanıma hazır tercih ligand bağlı olarak kimyası kullanılarak bir ligant ile SPN&#39;sini ya SPC bileşenini reaksiyona girerek (bakınız aşağıda). Not: cips yeniden ve zaman yeniden Fonksiyonlu onlarca olabilir. Belirli bir çip 6 ay bir yıl boyunca değişir dönemler için de kullanılabilir. Belirli bir dizide ölçülen spektrumları güvenilir biofunctionalization ardından plazma külleme tarafından tekrarlanan Rejenerasyonlarda, sonra yeniden üretilir. 29 </li></ol> 3. Yüzey Fonksiyonlandırma ve Kinetik Karakterizasyonu Not: ligand ve analit arasındaki kinetik hız sabitlerini karakterize ticari SPR enstrüman fonksiyonlandırılmış çip kullanın, hem de non-spesifik b SAM direncini incelemek içinINDING. Verimli yüzey işlevsellik izin akış oranları ve mikroakışkan tasarımları geniş bir yelpazesi var. Biz piyasada mevcut SPR beri biz onun tavsiye debileri etrafında standardize. Biz, bu akış hızı, tüm SPR araçlarının tipiktir ve bu nedenle sınırlayıcı değildir olduğuna dikkat edilmelidir. Tüm fonksiyonlandırmalar LSPR yonga üzerinde doğrudan yapılabilir, ancak bir mültipleksli araçtır çünkü bizim LSPR mikroakışkan kurulum değil oysa bizim iş yükünü azaltmak yoktu çünkü SPR enstrüman bir zorunluluk değildir. <ol><li> Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi SAM ticari bir çıplak altın çip işlevselleştirilmesi. </li><li> 133 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid mM (EDC) ve 33 DDW içinde N-hidroksisukinimid mM (NHS) için 10: 1 karışımı SPC göre SAM kullanılıyorsa, bir 1 karboksil grubunu aktive Min. </li><li> 30 ul / dk&#39;lık bir akış oranı kullanılarak 300 sn için ilgili antikor / ligand ile aktive edilmiş karboksil grubunu eşleniği. Ligantlar hazırlayınpH 6 fosfat tamponu, tipik olarak, ancak bu molekülün bağlı olarak değişebilir. </li><li> Ligand konjüge edilmesinden sonra, 30 ul / dk&#39;lık bir hızda 300 saniye süreyle bir deaktivatör adım olarak, fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde 0.1 M etanolamin akar. Etanolamin spesifik olmayan bağlanma minimize yardımcı olur. </li><li> Konsantrasyon aralığı kullanılarak 100 ul / dakikalık bir akış hızında ilgi analiti tanıtılması ve kinetik analiz yazılımı kullanılarak kinetik hız sabitleri hesaplar. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma, sorunlu ise, SPC veya SPN&#39;sine DPT oranını arttırır. </li></ol> 4. LSPR Genel Ayarlar <ol><li> Mikroskop ayarları: <ol><li> Numuneyi aydınlatmak Koehler bir 100 W Halojen lamba kullanın. Rezonans kayması (Şekil 2) katkıda yok dalga boylarını ortadan kaldırmak için ışık yolu uzun bir pas filtresi (genellikle 593 nm kesme) kullanın. </li><li> LSPRi veri toplama için, 40X yağ immersio bir ters mikroskop kullanmakn hedefi (1.4 NA) ve bir thermoelectrically 16 bit CCD kamera soğutmalı. </li><li> Aynı anda Görüntülerini ve spektrumları elde etmek için mikroskop çıkış portuna bir ışın ayırıcı yerleştirin. </li><li> 37 sıcaklık kontrollü mikroskop sahne C ° ve 4 saat için dengelenmeye. </li><li> Sırasıyla% 5 ve% 95 CO 2 konsantrasyonu ve nem düzenleyen mikroskop ek kuluçka düzeneğini birleştirin. </li></ol></li><li> Chip hazırlanması ve montajı: <ol><li> SPR deneylerden belirlenen en uygun iki bileşenli SAM oranları, Bölüm 2 de tarif edildiği gibi LSPR çip işlevselleştirilmesi. </li><li> Aşağıdaki gibi bir ısmarlama mikroakışkan tutucu içinde çip yükleyin. Bir alüminyum alt parçası üzerinde çipi yerleştirin. Bu alt parçası ve silikon conta ve şeffaf plastik üst parça arasındaki çip Sandwich. Derleme kelepçe 4 vidayı kullanın. </li><li> 1 karışımı: Tipik bir SPC-tabanlı tiyol uygulaması için, bir 1 ul kat 300 damlaEDC 133 mM ve DDW NHS 33 mM Ture SPC tiyol bileşeninin karboksil grupları etkinleştirmek için. </li><li> 10 dakika bekleyin ve elle 10 mM PBS ile yüzey durulama. </li><li> Ligand çözeltisi 300 ul kaplama damla ilgi ligandı (tipik haliyle bir antikor ya da antikor fragmanı) ile aktive karboksil grubuna bağı içerir. </li><li> 30 dakika bekleyin ve elle 10 mM PBS ile durulayın. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bir çip üzerinde kat PBS içinde 0.1 M etanolamin 300 ul bırakın. 10 dakika boyunca bekleyin. </li><li> PBS% 0.005 Tween 20 (PBS-T20) içeren etanolamin yıkayın. </li><li> Değişen menisküs ilgili verilerin dalgalanmaları azaltmak için çip üzerinde bir kuvars parçası yerleştirin. </li><li> Mikroskop monte ederken PBS-T20 tamponu ile ıslak çip tutun. </li><li> Isıtmalı sahne numune tutucu içine sıkıca LSPR yonga takımını yerleştirin ve mikroakışkan tüp takın. </li><li> Montaj ve akış met Mikroakiskan boru takınffer (veya hücre çalışmaları için serum özgür medya) kararlı bir duruma gelene kadar ulaşılır. </li><li> Montaj ve mikroskop, en az 2 saat boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> Merkez dizi spektroskopisi için fiber optik ile aynı hizada olacak şekilde joystick&#39;i kullanarak çip hizalayın. Spektroskopik veri bir spektrometre ve spektral analiz yazılımı kullanılarak alınır. </li><li> Yazılım otofokus, Zeiss Kesin Odaklama veya eşdeğer otofokus aygıtı kullanarak deney boyunca odak dizileri tutun. </li></ol></li></ol> 9E10 hibridoma hücrelerinden anti-c-myc Salgıları 5. LSPR Görüntüleme Not: Bu çalışma için kullanılan hibridoma hücre çizgisi, bir kimyasal tetikleyici gerektirmeyen yapısal olarak ve bu nedenle anti-c-myc antikoru eksprese <ol><li> C-myc peptidi ile nano işlerlik. Bu klon 9E10 hibridoma hücreleri tarafından salgılanan bir anti-c-myc antikorları için 1.77 nM&#39;lik bir KD değerine sahiptir. </li><li> Kültür tamamlandıktan hibridoma hücreleri% 5 CO2 altında 37 ° C &#39;de T75 şişesi içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik e büyüme ortamı. / Ml 4 x 10 5 hücre bir hücre yoğunluğuna koruyun. </li><li> Hücre salgılama çalışmaları için, santrifüj ile T75 şişesi pelet hücreleri, salgılanan antikorların çıkarın ve 4 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğunu ayarlamak için RPMI-1640 serumsuz vasat (SFM) ile iki kez yıkanır. </li><li> LSPR cips onları tanıtan önce canlılığı hücreleri ve testi Hasat. </li><li> Elle mikropipet ile LSPR cips üzerine hücre solüsyonu 50 ul tanıtın. Birkaç dakika sonra 25 ila 50 hücre LSPR fiş yüzeyine yapışır. </li><li> Mikroakışkan perfüzyon sistemi kullanılarak taze SFM ile çözelti içinde kalan hücrelerin silsin. </li><li> 10 mikron içinde yakın görüntüleme için LSPR diziler, seçin, ancak hücreleri ile örtüşmeyen. </li><li> Sinyal salgılanan bir anti-c-myc antib özgü sağlamakOdies ve mevcut antikorlar olmayan ve antikorlar ile, ancak çözelti içinde, c-myc peptid ile doyurucu bir konsantrasyonu varlığı ile bloke bağlanma siteleri ile hücre kültür ortamı getirmektedir. </li><li> Anti-c-myc antikorları (250 nM) ile doyurucu bir çözeltisi, her çalışma sonunda sensörler kalibre edin. Bu her çalışma biofunctionalization profiline göre fraksiyonel doluluk sensörleri yanıtını normale yardımcı olur ve belirler. </li><li> Görüntü hizalama yazılımı kullanarak X ve Y yönünde sürüklenme düzeltin. </li></ol>

<ol><li>Ludwig, A. -K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Small+vesicles+participating+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).</li>
<li>Letterio, J. J., Roberts, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by TGF-beta.</a> Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).</li>
<li>Werner, S., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+wound+healing+by+growth+factors+and+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of wound healing by growth factors and cytokines.</a> Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-fibroblast+interactions+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Gazagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorospot+assay+to+detect+single+T+lymphocytes+simultaneously+producing+multiple+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).</li>
<li>Han, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyfunctional+responses+by+human+T+cells+result+from+sequential+release+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).</li>
<li>Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+analysis+of+the+frequencies+and+rates+of+cytokine+secretion+from+single+cells+by+quantitative+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving.</a> Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).</li>
<li>Shirasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+imaging+of+protein+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell imaging of protein secretion.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li>
<li>Milgram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+real+time+monitoring+of+B-cells+hybridoma+secretion+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).</li>
<li>Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+in+instrumental+design+for+surface+plasmon+resonance-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).</li>
<li>Ermakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+Few+Metallo-Protein+Molecules+Using+Color+Centers+in+Nanodiamonds%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds.</a> Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).</li>
<li>Haes, A. J., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoscale+optical+blosensor%3A+Sensitivity+and+selectivity+of+an+approach+based+on+the+localized+surface+plasmon+resonance+spectroscopy+of+triangular+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).</li>
<li>Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+resonance+of+nitrogen-vacancy+centers+in+optically+trapped+nanodiamonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).</li>
<li>Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSPR-based+nanobiosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">LSPR-based nanobiosensors.</a> Nano Today. 4, 244-251 (2009).</li>
<li>Barbillon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+chemical+gold+nanosensors+based+on+localized+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Gold+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance.</a> Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).</li>
<li>Endo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+label-free+detection+of+antigen-antibody+reaction+using+localized+surface+plasmon+resonance-based+core-shell+structured+nanoparticle+layer+nanochip%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip.</a> Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).</li>
<li>Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+peptide+nucleic+acid-DNA+hybridization+using+localized+surface+plasmon+resonance+based+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor.</a> Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).</li>
<li>Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+localized+surface+plasmon+resonance+biosensor%3A+First+steps+toward+an+assay+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease.</a> Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).</li>
<li>Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+lipid+bilayer+formation+and+lipid-membrane-mediated+biorecognition+reactions+studied+with+a+new+nanoplasmonic+sensor+template%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template.</a> Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).</li>
<li>Park, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regeneratable%2C+label-free%2C+localized+surface+plasmon+resonance+%28LSPR%29+aptasensor+for+the+detection+of+ochratoxin+A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A.</a> Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).</li>
<li>Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+immunoassay+by+localized+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance.</a> Nanotechnology. 21, (2010).</li>
<li>Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell-based+assay+using+localized+surface+plasmon+resonance+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor.</a> Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).</li>
<li>Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).</li>
<li>Oh, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Nanoplasmonic+Sensing+for+Cellular+Functional+Immunoanalysis+Using+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood.</a> ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).</li>
<li>Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Protein+Secretions+from+Single+Cells+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time.</a> Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).</li>
<li>Raphael, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Methodology+for+Quantitative+LSPR+Biosensing+and+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging.</a> Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).</li>
<li>Raphael, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+LSPR+imaging+for+biosensing+with+single+nanostructure+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution.</a> Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).</li>
<li>Raphael, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+methodology+for+quantitative+LSPR+biosensing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging.</a> Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).</li>
<li>Henn, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+single-cell+IgG+secretion+frequency+and+rates+in+human+memory+B+cells+by+CpG+DNA%2C+CD40L%2C+IL-21%2C+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division.</a> Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).</li>
<li>Bramswig, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Carcinoembryonic+Antigen+Activates+Endothelial+Cells+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).</li>
</ol>

Yararlı yorumlar ve tartışmalar için George Anderson'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Deniz Araştırma Laboratuvarı Nanobilim Enstitüsü ve Ulusal Araştırma Konseyi Araştırma Ortaklığı Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada açıklanan LSPR görüntüleme tekniğinin, hücre salgılarını tespit etmek için daha geleneksel metodolojilere göre çok sayıda avantajı vardır. Birincisi, tekniğimizin zaman çözünürlüğü saniyeler mertebesindeyken, EliSpot olarak bilinen bir immünosand testi olan ticari alternatif, 2 ila 3 günlük tipik bir zaman çözünürlüğüne sahiptir. 7,32 Sonuç olarak, Şekil 6'da gösterilenler gibi protein salgılama hızındaki ani değişiklikleri çözebildik. İkincisi, çip üzerine dağıtılmış dizilere sahip olmak, salgılanan sinyalin uzay ve zamanda izlenmesine olanak tanır ve bu da difüzyona dayalı hücre salgısı modelleriyle daha titiz karşılaştırmalara olanak tanır. Ek olarak, Şekil 6'da gösterilen kontrol dizisi gibi diziler, görüntüde tipik olarak odak kayması gibi araçsal faktörlerden kaynaklanan genel değişiklikleri çıkarmak için kullanılabilir. Üçüncüsü, tekniğimiz hücrelerde herhangi bir değişiklik gerektirmez. İstenirse, deney, floresan proteinler gibi yaygın olarak kullanılan etiketleri içerebilir, ancak bu tür etiketlerin hücre canlılığını veya homeostazını olumsuz etkileyebileceğine dair endişeler varsa, yaklaşımımızın etiketsiz doğası bunları gerektirmez. Dördüncüsü, spektroskopik verileri kullanarak, yüzeye bağlı ligandların fraksiyonel doluluğuna ilişkin nicel bilgilerin hesaplanabileceğini gösterdik.
Metalik nanopartiküllerin üretilmesi için EBL'ye çok sayıda alternatif yöntem vardır. Bununla birlikte, EBL'nin, incelenen optiklere ve hücrelere en iyi şekilde uyacak şekilde nanoyapı ve dizi boyutlarını optimize etmek için önemli ölçüde esneklik sağladığını bulduk. Ayrıca çiplerin plazma külleme yoluyla kolayca yeniden üretilebilmesi de kritik öneme sahiptir. Bu sayede tipik bir çip onlarca kez kullanılabilir. Biyoişlevselleştirme detayları, spesifik uygulama için değiştirilmelidir. Burada sunulan protokol, yüzeyi nispeten küçük c-myc peptit ligandları ile konjuge etti. Tam antikorlar gibi daha büyük ligandlar tipik olarak daha fazla boşluk ve dolayısıyla daha yüksek bir SPO/SPN/SPC oranı gerektirir. Ne olursa olsun, canlı hücre deneylerinde spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için iyi oluşturulmuş bir SAM katmanı gereklidir. Genel olarak, daha büyük moleküler ağırlıklı analitler LSPR tarafından daha kolay tespit edilir. Bu nedenle, tek hücreli tezahüründe bu teknik, sitokinler gibi küçük proteinlerin salgılanmasını tespit etmek için uygun olmayabilir. 
Mevcut kurulum, bireysel yapışık olmayan hücreleri incelemek için kullanılmıştır. Bu çalışmada bildirilen sonuçların doğrudan uygulanabilir olduğu önemli sayıda salgılanan sinyal proteini ve vezikül vardır. Örneğin, onlarca yıldır kanser için tanısal bir belirteç olan karsinoembriyonik antijen (CEA). Kolon kanseri hücrelerinin binlerce molekül/hücre/saat hızında CEA salgıladığı bilinmektedir ve moleküler ağırlığı 180 kDa'dır ve bu da IgG antikorlarınınkini aşmaktadır. CEA'nın otokrin ve parakrin sinyal yollarında yer aldığına inanılmaktadır, ancak bu sekresyonların uzay-zamansal doğası hiçbir zaman ölçülmemiştir. Tekniğimiz bu sinyal sorularını doğrudan ele alabilir. Bu çalışmanın bir uzantısı, tek hücrelerden CEA salgılanmasının uzay-zamansal doğasını ölçmek olacaktır. 33 Gelecekteki çalışmalar, LSPRi'yi yapışık hücrelerin iki ve üç boyutlu hücre kültürleriyle entegre etmeye de odaklanacaktır. Bir dizi salgılanan proteini paralel olarak tespit edebilen çoğullanmış dizileri içeren bu teknik, hücre salgılarına ve bunların komşu hücreleri nasıl etkilediğine yeni bir pencere açma potansiyeline sahiptir.

Inter-hücresel iletişim içinde ve hücre dışında hem birçok fizyolojik faaliyetlerin düzenlenmesi için çok önemlidir. Proteinlerin ve veziküller çeşitli daha sonra, farklılaşma, yara iyileşmesi, bağışıklık tepkisi, göç ve proliferasyon gibi kompleks hücresel süreçleri tetikler salgılanabilir. Hücre içi sinyal yollarının 1-5 arızaları kanseri, ateroskleroz da dahil olmak üzere pek çok bozukluklarda implike edilmiştir ve diyabet, birkaç isim. Optimum hücre salgılama tahlili mekansal ve zamansal olarak ilgili sinyalizasyon yolları bozmadan ilgi salgılanan proteini eşleme kapasitesine sahip olmalıdır. Bu şekilde, konsantrasyon profilinin ve alıcı hücrelerin tepki arasındaki nedensel ilişki anlaşılabilir. Ne yazık ki, en yaygın olarak kullanılan floresan bazlı tekniklerin birçoğu bu kriterlere uymayan. Floresan füzyon proteinleri w analiti etiketlemek için kullanılabilirhücreyi ithin ancak salgı yolu bozabilir veya salgılanan eğer, ölçmek zordur hücrenin dışında yaygın kızdırma sonuçları. Floresan immunosandwich bazlı deneyler, hücresel salgıları tespit etmek için en sık kullanılan teknikler, ancak, tipik olarak, tek tek hücrelerin izolasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, algılama antikoru verme tipik olarak durur veya deney ve antikor etiket büyüklüğü sona 6-11, 150 kDa IgG, aşağı sinyalizasyon bir engeldir. Bu bariyerlerin bir etiket içermeyen bir teknik, görüntü proteini salgıları ve mevcut etiket içermeyen teknolojiler arasından kullanılan plazmon rezonans (SPR) yüzey lokalize yüzey plasmon rezonans (LSPR) sensörler iyi adaylardır tercih edilir çünkü. 12-17 Bu sensörleri yaygın proteinler, eksozom ve diğer biyo-analit bağlama çalışmaları için kullanılmıştır. 18-24 LSPR, plasmonik nanostr halindeuctures cam kapak slipleri lithographically desenli ve standart geniş alan mikroskopisi konfigürasyonlar yoluyla da görülebilir ışık kullanılarak heyecan edilebilir. Nedeniyle nano ayak izi, cam taban çoğunluğu 25-28. Böyle canlı hücre mikroskopi ile entegrasyon için uygun parlak alan ve iyi bu sondalar yapma floresan mikroskobu gibi yaygın görüntüleme teknikleri kullanılabilir Biz gerçek zamanlı ölçüm göstermiştir sırasıyla 225 msn ve 10 um, mekansal ve zamansal çözünürlükte Fonksiyonlu altın plasmonik nano kullanarak hibridoma hücrelerinden antikor sekresyonların. Temel çip konfigürasyonu Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 28 mikroskop çıkışı, ışık yolu görüntü için kullanılan bir CCD kamera ve nano belirli bir dizinin fraksiyonel doluluk (Şekil 2 nicel olarak belirlenmesi için bir fiber-optik açıdan bağlanmış spektrometre arasında bölünür ). ProtocAynı anda standart aydınlık alan mikroskobu kullanarak hücrelerin tepkisini izlerken bu yazıda sunulan ol tek hücre salgılarının gerçek zamanlı ölçümü için deneysel tasarım açıklanır. Multidisipliner yaklaşım hücre çizgilerinin nano üretim, analitlerin yüksek afıniteli bağlanma için nano-fonksiyonalizasyonu, hem de non-spesifik bağlanma en aza indirilmesi ve ticari bir Yüzey Plazmon Rezonansı kullanarak hız sabitleri karakterize (SPR) enstrüman için bir yüzey optimizasyonu, entegrasyonu içerir substrat ve görüntü ve spektral verilerin analizi üzerine. Biz cep salgıları ve alıcı hücrelerle onların nedensel ilişkilerin uzay-zamansal haritalama için elverişli teknoloji olmak için bu tekniği tahmin ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>25&#160; mm çaplı cam lameller</td><td>Bioscience Tools&nbsp;</td><td>CSHP-No1.5-25</td> <td>ve nbsp; 170 & plusmn; 5 ve mikro; m optimaldir</td></tr><tr><td>Poli-metil metakrilat</td><td>Microchem</td><td>PMMA 950 A4</td><td></td></tr><tr><td>Etil laktat metil metakrilat</td><td>Microchem</td><td>MMA EL6</td><td></td></tr><tr><td>Elektron ışını evaporatörü</td><td>Temescal</td><td>FC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Elektron ışını litografisi</td><td>Raith</td><td>Serisi 150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>CR-7 krom aşındırıcı</td><td>Cyantek</td><td>CR-7</td><td></td></tr><tr><td>Taramalı elektron mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td></td></tr><tr><td>Atomik kuvvet mikroskobu</td><td>Veeco</td><td>Nanoskop III</td><td></td></tr><tr><td>Plazma külleme sistemi</td><td>Teknikler Serisi</td><td>85 RIE</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m8.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH<alt>2</alt>)<alt>11</alt>-EG<alt>3</alt>-COOH (SPC)</td><td>Prochimia</td><td>TH 003m11n3-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH<alt>2</alt>)<alt>11</alt>-EG<alt>3</alt>-NH<alt>2</alt> (SPN)</td><td>Prochimia</td><td>TH 002-m11.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>Yüzey plazmon rezonans sistemi</td><td>Biorad</td><td>XPR36</td><td></td></tr><tr><td>Çıplak altın çip</td><td>Biorad</td><td>GLC çipi</td><td>Tek tabakayı çıkarmak için plazma küllü</td></tr><tr><td>1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid</td><td>Thermo</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td> N-hidroksisüksinimid (NHS)</td> <td>Thermo</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Pentilamin-Biotin&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21345</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Neutraavidin</td><td>Thermo</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo</td><td>28374</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td>Mikroskop 40X yağa daldırma objektifi ile donatılmıştır; Pecon GmbH'den CO2 ve nem inkübasyonu</td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca R2</td><td>Termoelektrik soğutmalı (16 bit)</td></tr><tr><td>Spektrometre</td>, <td>Okyanus Optiği</td><td>QE65Pro</td><td></td></tr><tr><td>Spectrasuite</td><td>Okyanus Optiği</td><td>versiyon1.4</td><td></td></tr>, <tr><td>c-myc peptit HyNic Etiketi</td>: <td>Solulink</td><td>SP-E003</td><td></td></tr>, <tr><td>monoklonal anti-c-myc antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4439</td><td></td></tr><tr><td>Hibridoma hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-1729</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik Çözeltisi (100 kez;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Serum ücretsiz ortam RPMI 1640&nbsp;</td><td>Canlandırıcı</td><td>&nbsp; 11835-030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine DHPE</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L-1392</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücre salgıları uzay-zamansal görüntüleme için bir etiket içermeyen tekniği

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Hücreler arası iletişim, temel hücresel aktivitelerin sürdürülmesine yardımcı olan karmaşık bir sistemin ayrılmaz bir parçasıdır. Sonuç olarak, bu tür sinyallerin arızalanması birçok rahatsızlığa yol açabilir. Hücreden hücreye sinyalleşmeyi anlamak için, yerel ortamı rahatsız etmeden hücreden salgılanan moleküllerin uzamsal ve zamansal doğasını incelemek önemlidir. Protein sekresyonunu incelemek için çeşitli tahliller geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler tipik olarak ilgili sinyal yollarını bozan floresan problara dayanmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için etiketsiz bir teknik gereklidir.
Bu yazıda, tek bir hücreden protein salgılarını tespit edebilen etiketsiz bir lokalize yüzey plazmon rezonans görüntüleme (LSPRi) teknolojisinin üretimini ve uygulamasını açıklıyoruz. Plazmonik nanoyapılar, standart bir cam lamel üzerine litografik olarak desenlendirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilen ışık mikroskoplarında görünür ışık kullanılarak uyarılabilir. Lamelin sadece küçük bir kısmı nanoyapılar tarafından kaplanır ve bu nedenle bu teknik, floresan ve parlak alan görüntüleme gibi yaygın teknikleri birleştirmek için çok uygundur.
Bu protokolde, sensör nanofabrikasyonu ve müteakip biyoişlevselleştirme, ligand ve analitin bağlanma kinetiği karakterizasyonu, çip ve canlı hücrelerin entegrasyonu ve ölçülen sinyalin analizini içeren multidisipliner bir yaklaşım kullanılmaktadır. Bir bütün olarak, bu teknoloji, hücresel salgıları haritalamak ve bunları yakındaki hücrelerin tepkileriyle ilişkilendirmek için genel bir etiketsiz yaklaşım sağlar.

Tipik bir canlı hücre salgı çalışmasında yer alan veri toplama birden modları vardır. 3 kare diziler vurgular bir LSPRi görüntü bir bindirme göstermektedir, ve alt sol tarafındaki hücreyi vurgular iletilen ışık aydınlatılmış görüntü. Veriler, tipik olarak aşağıda tarif edilen normalleştirme hesaplanması için analit ile doyurucu bir çözüm getirilmesi ve ardından 3 saatlik bir süre boyunca toplanır. Floresan görüntüleri de bir filtre küp otomatik geçiş yoluyla veri toplama rutin entegre edilebilir. Şekil 4 floresan membran boya rodamin DHPE ile boyanmış bir hücre içinde lamellipodia benzeri uzantıları (oklar) sergiler. Böyle uzantıları dizileri ile üst üste olsaydı onlar protein salgılaması için yanlış pozitif verecekti. Görüntülerinin birden fazla modları olması gibi olaylar belirlemenize yardımcı olabilir. Şekil 5 spektrometresi önce verileri ve kıç gösterirer satüre solüsyonunun koyulmasını ticari olarak c-myc fonksiyonalize diziler anti-c-myc antikorları satın alınan (400 nM). Resim hücreleri bu deneyde yer aldı. Spektrum kırmızı shift ve yoğunluğunda bir artış, hem görüntüler. İki eğri altındaki alanlar arasındaki fark CCD kamerada LSPRi modunda dizi görüntü yoğunluğunda bir artışa neden olur. Bir doğrusal olmayan en küçük kareler analizi yaklaşımı spektrumdan yüzeye bağlı ligandların fraksiyonel doluluk sonucuna geliştirilmiştir. 30,31 Deneyin sonunda, doymuş yoğunluk değerlerinin (fraksiyonel doluluk ≈ 1 örneğin) aşağıdaki formülü kullanarak her bir dizi için normalleştirilmiş bir yanıt hesaplamak için kullanılmıştır: Zaman noktası t zaman noktasında t normalize şiddeti, deney, nihai doymuş yoğunluğu başında ilk şiddeti ve dizinin ölçülen yoğunluğu nerede </em&gt;, sırasıyla. Iki dizi ile ilgili normalize değerleri Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. Bir dizi, bir kontrol olarak kullanılmıştır, diğer ise araştırılmaktadır hücrenin 10 um içinde olduğu hücreden 130 um&#39;lik bir mesafe vardı. Kontrol dizisi düz yanıt hücre nisbetle en yakın dizinin normalize cevap ani artış, salgılanan antikorların lokalize bir patlamasının bir göstergesidir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> 1. Sensör Tasarımı Şekil. Tipik bir canlı hücre salgılanması deneyi geometrisini tasvir. Hücre (mavi sfero) bir çizim biofunctionalized altın nano dizileri içerir LSPR çip üzerine yatırılır. Yüzeye bağlanan Y-şekilli moleküller olarak gösterilen bu durumda antikorlar yakınlaştırılmış görünümü, ilgi hücre salgılanması olarak ölçülürfonksiyonlandırılmış nanoyapıların. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> Şekil 2. Optik Kur. Bir halojen lambadan gelen ışık aydınlatılmış ilk uzun geçiş filtresi (LP) tarafından filtre edilir. Işık doğrusal (P1) polarize ve 40X / 1.4 NA objektif yoluyla numune aydınlatır edilir. Dağınık ışık bir çapraz polarize (P2) yoluyla objektif ile toplanır ve geçirilir. A 50/50 ışın ayırıcı (BS) eşzamanlı spektroskopik ve görüntülerinin analizi için toplanan ışık yoluna sokulur. Sağ Üst:. 300 nm sahada ayrılmış 9 ayrı nanoyapıların bir atomik kuvvet mikroskopisi görüntü <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> Şekil 3. Canlı Hücre LSPRi Çalışması. A 12 diziler çevrili tek bir hibridoma hücre (sol alt) gösteren iletilen ışık ve LSPRi görüntü birleşti. Bu kontrastlı görüntü. Ölçek çubuğu 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> Şekil 4. Canlı Hücre Floresan Çalışması. Bir zar boya olan rhodamine DHPE, lekeli bir tek hibridoma hücresinin bir floresan sahte renkli görüntü. Diziler genellikle görünmeyen floresan görüntüleme modunda ise, yakındaki bir dizi ab burada gözlemlenebilirsağ alt köşedeki kare yoksundur. Hücre hücreleri (oklar) dışarı doğru uzanan dokunacı benzeri uzantıları (muhtemelen filopodia ya lamellipodia), ancak bir dizi ayrılmış olması görülebilir. Ölçek çubuğu 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> Şekil 5. Spektral Şekli. Öncesinde ve anti-c-myc antikor 400 nM çözeltisinin giriş sonra c-myc işlevselleştirilmiş diziden elde edilen spektrumlar. Hiçbir hücreleri bu çalışmada hazır bulundu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src= &quot;/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; Şekil 6. Tek Hücre salgılanması. 15, tek bir hücrenin um ve 130 mikron uzaklıkta bulunan bir (Kontrol) içinde bulunan bir dizi tepki. Ölçek çubuğu 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekil hücrelerden protein salınımını yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükle ölçmektir. Bu, tek hücre salınımlarının etiketsiz görüntülenmesi için cam lameller üzerine litografik olarak altın plazmonik nanosensörler üretilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, sensör çipi temizlenir, kendi kendine düzenlenen tek tabaka (self-assembled monolayer) ile kaplanır ve ardından salınan analit proteinlerine yüksek afinitesi olan ligandlarla fonksiyonelleştirilir.Ardından, salgılarını uzay ve zaman boyutunda ölçmek amacıyla hücreler fonksiyonelleştirilmiş sensör çiplerine entegre edilir. Sonuçlar, tekil hücrelerden gelen protein salgılarının, herhangi bir markalama işlemine gerek duyulmadan hem mekânsal hem de zamansal olarak haritalanabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, parakrin ve otokrin sinyal yolaklarının hücre hareketliliğini nasıl yönettiği gibi, hücreler arası iletişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu prosedüre başlamak için, nanoyapıların desenleme ve görüntüleme aşamaları sırasında yük etkilerini önlemek amacıyla, önceden temizlenmiş lameller üzerine elektron demeti evaporasyonu ile 10 nanometer kalınlığında bir krom ince film kaplayın. Bu işlemin ardından, etil laktat ve metilmetakrilat kopolimerinden oluşan çift katmanlı direncin ilk katmanını 2000 RPM hızında 45 saniye boyunca uygulayın. Daha sonra, substratın oda sıcaklığına soğumasını bekleyip substratı 150 degrees Celsius sıcaklıkta fırınlayın.Polimetilmetakrilatın ikinci katmanını 3000 RPM'de 45 saniye boyunca döndürün ve altlığı 150 °C'de pişirin. Çift katmanlı direnci elektron demeti litografisi veya EBL kullanarak desenleyin. İkiye bir oranında izopropil alkol (IPA) ve metil izobutil keton (MIBK) ile geliştirme yapın ve IPA ile durulayın.Oda sıcaklığında 10 saniye boyunca CR seven aşındırıcı kullanarak ıslak aşındırma yoluyla nanoyapıların geliştirilmiş alanındaki kromu giderin ve ardından deiyonize, distile su ile durulayın. Altın biriktirme işleminin ardından, elektron demeti evaporatörü kullanarak altlığın üzerine bir titanyum altın film tabakası çöktürün. Altlığı dört saat boyunca asetonda bekleterek kopolimer çift katmanlı direnci kaldırın.Ardından, nanoyapı şeklini ve boyutunu onaylamak için altlığı bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak inceleyin. Ortaya çıkan nanoyapılar genellikle 300 nanometrelik bir hatve ile birbirlerinden ayrılırlar. 20'ye 20'lik nanoyapı dizileri, merkezden merkeze 30 mikron ara ile yerleştirilmiştir.Hücre görüntüleme için yeterli alan bırakacak şekilde, tipik bir çip 300 dizi içerecektir. Substrat üzerindeki kalan kromu, oda sıcaklığında 60 saniye boyunca CR seven aşındırma işlemiyle ıslak kenar yöntemiyle temizleyin. Ardından substratı deiyonize distile su ile durulayın.Ardından, boyut ve tekdüzeliği doğrulamak için dizilerin bir alt kümesini atom kuvvet mikroskobu ile inceleyin. Bu desenli cam lam, lokalize yüzey plazmon rezonansı veya LSPR çiplerinin temizliği ve rejenerasyonu için uygun temizleme prosedürleri uygulandığı sürece defalarca kullanılabilir. %5 hidrojen ve %95 argon içeren 300 mTor karışımında, 40 watt güçte 45 saniye boyunca plazma küleştirme işlemi yapın.Plazma küllemeden hemen sonra altın yüzeyi ve nanoyapıları fonksiyonelleştirin. Çipi, üç birim SPO ve bir birim SPC'den oluşan iki bileşenli bir etanol tiyol çözeltisine daldırın. Kendi kendine organize olan bir tek tabaka (self-assembled monolayer) oluşması için çipi tiyol çözeltisinde gece boyunca beklettikten sonra, etanol ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurutun; ardından LSPR çipini, çipi bir alüminyum taban parçası üzerine yerleştirerek özel yapım bir mikroakışkan tutucuya yükleyin.Ardından, düzeneği sıkıştırmak için dört vida kullanarak çipi bu alt parça ile bir silikon conta ve şeffaf plastik bir üst parça arasında sandviç şeklinde yerleştirin. Tipik bir SPC tabanlı tiyol uygulaması için, SPC tiyol bileşeninin karboksil gruplarını aktive etmek amacıyla, deiyonize distile su içinde 133 millimolar EDC ve 33 millimolar NHS'nin bir bire bir karışımından 300 µL'yi damla kaplama yöntemiyle uygulayın. 10 dakika bekledikten sonra, yüzeyi 10 millimolar PBS ile manuel olarak durulayın ve ardından 300 µL ligand çözeltisini damla kaplama yöntemiyle ekleyerek aktive edilmiş karboksil grubunu ilgili ligandla konjuge edin.Bir saat bekleyip yüzeyi 10 millimolar PBS ile duruladıktan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı minimize etmek için çip üzerine 0.1 molar etanolamin içeren 300 microliter PBS ekleyin. 10 dakika bekledikten sonra, etanolamini %0,005 Tween 20 içeren PBS veya PBST 20 ile yıkayın. Ardından, değişen menisküs ile ilgili verilerdeki dalgalanmaları azaltmak için çipin üzerine bir kuvars parça yerleştirin.Mikroskoba yerleştirme işlemi sırasında çipi PBST 20 tamponu ile ıslak tutun. Mikroakışkan tüplerini düzeneğe bağlayın ve kararlı durum sağlanana kadar tampon akışı gerçekleştirin. Ardından, LSPR çip düzeneğini ısıtmalı sahne numune tutucusuna sıkıca yerleştirin.Bu yöntem için kullanılan optik düzenek burada gösterilmiştir. Halojen lambadan gelen ışık, nano plazmonik yanıta katkıda bulunmayan dalga boylarını elemek için 593 nanometrelik bir uzun geçiren filtreden geçirilir. Ardından ışık doğrusal olarak polarize edilir ve plazmonik altın nanoyapıların uyarılması için numune, 40 x 1.4 sayısal açıklıklı bir objektif aracılığıyla aydınlatılır.Saçılan ışık objektif tarafından toplanır ve cam substrattan gelen arka plan sinyalini azaltmak için çapraz bir polarize ediciden geçirilir. Eş zamanlı spektroskopik ve görüntüleme analizi için toplanan ışık yoluna 50/50 bir ışın ayırıcı yerleştirilir. Düzeneğin ve mikroskobun en az iki saat boyunca dengelenmesine izin verdikten sonra, merkezi dizinin spektroskopi için fiber optik ile hizalanmasını sağlamak üzere joystick kullanarak çipi hizalayın.Hibrit DOMA hücreleri kültüre edilip santrifüj ile peletlendikten sonra, hücreleri toplayın ve LSPR çiplerine yerleştirmeden önce canlılık testi yapın. Ardından, bir mikro pipet yardımıyla 50 microliters hücre solüsyonunu manuel olarak LSPR çiplerinin üzerine ekleyin. Son olarak, LSPR çiplerini görüntülemeye hazırlamak için solüsyonda kalan hücreleri, bir mikroakışkan perfüzyon sistemi kullanarak taze serumsuz medya ile yıkayarak uzaklaştırın.Burada, kare dizileri vurgulayan bir LSPR görüntüleme görüntüsünün ve sol alt kısımdaki hücreyi vurgulayan bir iletilmiş ışık aydınlatmalı görüntünün üst üste binmiş hali gösterilmektedir. Floresan membran boyası rod Domine, DHPE ile boyanmış bir hücre, filopodya benzeri uzantılar sergilemektedir. Bu tür uzantıların dizilerle örtüşmesi durumunda, protein sekresyon spektrometre verileri için yanlış pozitif sonuç vereceklerdi; cmic fonksiyonelleştirilmiş dizilere doyurucu bir antis cmic antikor çözeltisinin eklenmesinden önceki ve sonraki durum burada görüntülenmektedir.Bu yöntem, dizilerin kalibre edilmesi amacıyla kullanılır. Dizilerin kalibrasyonu, sensörlerin yanıtının normalize edilmesine ve her çalışmanın biyo fonksiyonelleştirme profiline dayalı olarak kısmi doluluğun belirlenmesine yardımcı olur. LSPR çipi için belirtilenle aynı protokol kullanılarak, spesifik olmayan bağlanmaya karşı direncin incelenmesinin yanı sıra disosyasyon sabitinin belirlenmesi için ticari bir SPR cihazı kullanılır.İki diziden elde edilen normalize edilmiş değerler burada gösterilmiştir. Dizilerden biri hücreden 10 µm mesafedeyken, kontrol dizisi hücreden 130 µm mesafedeydi. Kontrol dizisinin düz yanıtına kıyasla, hücreye en yakın dizinin normalize edilmiş yanıtındaki ani artış, salgılanan antikorların lokalize bir patlamasının göstergesidir.Bu videoyu izledikten sonra, bireysel hücrelerden protein salınımlarının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

a-label-free-technique-for-spatio-temporal-imaging-single-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, tek bir hücreden protein salgılarını tespit etmek için lokalize yüzey plazmon rezonans görüntülemeyi gösterir. Mikroakışkan bir kurulum ve peptit bağlı bir plazmonik nanoyapı çipi kullanarak, rezonans açısında yansıyan ışık yoğunluğundaki değişiklikler, tek bir hücreden salgılanan proteinlerle etkileşimleri ortaya çıkarır.

Tek Bir Hücreden Protein Salgılarını Tespit Etmek için Lokalize Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Tandem kabarcık üretimi için altın nokta çiftleri ve yakındaki tek hücreli modelleme için fibronektin kaplı adalar üretmek üzere bir mikroakışkan çip üretildi. Elde edilen akış alanı, parçacık görüntü hızı ile karakterize edildi ve hücre zarı porasyonu, zar deformasyonu ve hücre içi kalsiyum yanıtı dahil olmak üzere çeşitli biyoetkileri incelemek için kullanıldı.

Tek hücreli Seviyesinde Kavitasyon Kabarcık (ler) -Hücre Etkileşim ve Sonuç biyoetkiler incelenmesi için yüzey Desenlendirme ile mikroakışkan Sistemi

Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.

Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi

Mikropatterned diziler kullanılarak tek hücrelerden floresan muhabir zaman kurslarının alınması için bir yöntem sunuyoruz. Protokolde, tek hücreli dizilerin hazırlanması, canlı hücre tarama zaman atlamalı mikroskopinin kurulumu ve çalışması ve otomatik önseçim, görsel kontrol ve yapıştırma alanı başına hücre entegre floresan zaman kurslarının izlenmesi için açık kaynaklı bir görüntü analiz aracı açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Öğrenin, tek hücre salgılarını etiketsiz nanoplasmonik algılama ile yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte haritalamak için. Bu yöntem, hücreler arası iletişimi ve parakrin ile otokrin sinyal yollarını araştırmak için güçlü bir araç sunar.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Daha fazla video keşfet