Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip tek tek hücrelerden protein salgılanmasını ölçmektir. Bu, tek hücre salgılarının etiketsiz görüntülenmesi için cam kapak fişleri üzerinde altın plazmonik Nanosensörlerin litografik olarak üretilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, sensör çipi temizlenir ve kendi kendine monte edilen tek tabaka ile kaplanır ve daha sonra salgılanan analit proteinleri için yüksek afiniteye sahip ligandlarla işlevselleştirilir.

Daha sonraki hücreler, uzay ve zamandaki salgılarını ölçmek için işlevselleştirilmiş sensör çiplerine entegre edilir. Sonuçlar, tek tek hücrelerden gelen protein salgılarının, etiketlemeye gerek kalmadan hem mekansal hem de zamansal olarak haritalanabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, parakrin ve otokrin sinyal yollarının hücre motilitesini nasıl yönettiği gibi hücreler arası iletişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedüre başlamak için, nanoyapıların modellenmesi ve görüntülenmesi sırasında yük etkilerini önlemek için elektron ışını buharlaşması ile önceden temizlenmiş kapak fişleri üzerine 10 nanometre krom ince bir film bırakın. Bu dönüşü takiben, etil laktat, metilmetakrilat kopolimerinden oluşan ilk çift katmanlı direnç tabakası 2000 RPM'de 45 saniye boyunca bekletilir. Ardından, alt tabakanın oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra alt tabakayı 150 santigrat derecede pişirin.

İkinci polimetilmetakrilat katmanını 3000 RPM'de 45 saniye döndürün ve alt tabakayı 150 santigrat derecede pişirin. Çift katman, elektron ışını litografisi veya EBL kullanılarak direnç gösterir. Bir izopropil alkol veya IPA metil izobütil keton veya MIBK iki ila bir oranında geliştirin ve IPA'da durulayın.

Oda sıcaklığında 10 saniye boyunca CR yedi aşındırma kullanarak ıslak aşındırma yoluyla geliştirilen nanoyapı alanından kromu çıkarın ve ardından deiyonize edilmiş, damıtılmış damıtılmış suda durulayın Altın biriktirmeyi takiben elektron ışını evaporatörünü kullanarak alt tabaka üzerine bir titanyum altın film biriktirin. Kopolimer çift tabakasını kaldırın. Alt tabakayı dört saat boyunca asetonda bekleterek direnin.

Ardından, nanoyapı şeklini ve boyutunu doğrulamak için bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak alt tabakayı inceleyin. Elde edilen nanoyapılar tipik olarak 300 nanometrelik bir aralık ile ayrılır. 20'ye 20 nanoyapı dizisi, merkezden merkeze 30 mikron aralıklarla yerleştirilmiştir.

Hücre görüntüleme için geniş alan bırakarak, tipik bir çip 300 dizi içerecektir. Kalan kromu, oda sıcaklığında 60 saniye boyunca CR yedi aşındırma kullanarak ıslak kenar yoluyla alt tabakadan çıkarın. Daha sonra alt tabakayı deiyonize damıtılmış suda durulayın.

Ardından, boyut ve tekdüzeliğin doğrulanması için atomik kuvvet mikroskobunu kullanarak bir dizi alt kümesini inceleyin. Bu desenli cam kapak kayması, lokalize yüzey plazması ve rezonans veya LSPR yongalarının temizlenmesi ve yenilenmesi için uygun temizleme prosedürleri izlendiği sürece birden çok kez kullanılabilir. 300 mili'de 40 watt gücünde plazma külü, 45 saniye boyunca% 5 hidrojen ve% 95 argon karışımına.

Plazma küllenmesinden hemen sonra altın yüzeyi ve nano yapıları işlevsel hale getirin. Çipi, üçe bir oranında SPO ve SPC'den oluşan iki bileşenli bir etanol tiyol çözeltisine daldırarak. Kendi kendine monte edilmiş bir tek tabaka oluşturmak için çipi gece boyunca tiyol çözeltisinde bıraktıktan sonra, etanol ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın, çipi alüminyum bir alt parçaya yerleştirerek LSPR çipini özel yapım bir mikroakışkan tutucuya yükleyin.

Ardından, tertibatı sıkıştırmak için dört vida kullanarak çipi bu alt parça ile bir silikon conta ve şeffaf plastik bir üst parça arasına sıkıştırın. Tipik bir SPC bazlı tiyol uygulaması için, SPC tiyol bileşeninin karboksil gruplarını aktive etmek için deiyonize distile suya bire bir 133 milimolar EDC ve 33 milimolar NHS karışımından 300 mikrolitre damlatın. 10 dakika bekledikten sonra, yüzeyi 10 milimolar PBS ile manuel olarak durulayın, ardından aktive edilmiş karboksil grubunu ilgilenilen ligand ile 300 mikrolitre ligand solüsyonunu damlatarak birleştirin.

Bir saat bekledikten ve yüzeyi 10 milimolar PBS damla kodu ile duruladıktan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için çip üzerinde PBS içinde 300 mikrolitre 0.1 molar etanolamin. 10 dakika bekledikten sonra etanolamini 20 veya PBST 20 arasında %0,005 içeren PBS ile yıkayınız. Ardından, değişen bir menisküsle ilgili verilerdeki dalgalanmaları azaltmak için çipin üzerine bir kuvars parçası yerleştirin.

Mikroskoba monte ederken çipi PBST 20 tamponu ile ıslak tutun. Mikroakışkan boruyu düzeneğe ve sabit bir duruma ulaşılana kadar akış tamponuna takın. Ardından LSPR çip düzeneğini ısıtılmış s'ye sıkıca yerleştirin.tage numune tutucusu.

Bu yöntem için optik kurulum burada gösterilmiştir. Halojen lambadan gelen ışık, nano plazmonik tepkiye katkıda bulunmayan dalga boylarını ortadan kaldırmak için 593 nanometre uzunluğunda geçiren bir filtreden geçirilir. Işık daha sonra doğrusal olarak polarize edilir ve numune, plazmonik altın nanoyapıların uyarılması için 40 x 1.4 sayısal açıklık objektifi ile aydınlatılır.

Saçılan ışık, objektif tarafından toplanır ve cam alt tabakadan gelen arka plan sinyalini azaltmak için çapraz bir polarizörden geçirilir. Eşzamanlı spektroskopik ve görüntü analizi için toplanan ışık yoluna 50 50 ışın ayırıcı yerleştirilir. Düzeneğin ve mikroskobun en az iki saat dengelenmesine izin verdikten sonra, merkezi dizi spektroskopi için fiber optik ile hizalanacak şekilde joystick'i kullanarak çipi hizalayın.

Hibrit DOMA hücrelerini santrifüjleme ile kültürledikten ve peletledikten sonra, hasat edin, ardından LSPR çiplerine eklemeden önce canlılıklarını test edin. Bunu takiben, 50 mikrolitre hücre solüsyonunu bir mikro pipet ile LSPR çiplerine manuel olarak verin. Son olarak, LSPR çiplerini görüntülemeye hazırlamak için mikroakışkan bir profüzyon sistemi kullanarak çözelti içinde kalan hücreleri taze serum içermeyen ortamla yıkayın.

Kare dizileri vurgulayan bir LSPR görüntüleme görüntüsünün yer paylaşımı ve sol alttaki hücreyi vurgulayan iletilen ışıkla aydınlatılmış bir görüntü burada gösterilmektedir. Floresan membran boya çubuğu Domine ile boyanmış bir hücre olan DHPE, filopodia benzeri uzantılar sergiler. Bu tür uzantılar dizilerle örtüşürse, protein salgılama spektrometrisi verileri için yanlış bir pozitif verirlerdi, cmic işlevselleştirilmiş dizilere doymuş bir antis cmic antikor çözeltisinin eklenmesinden önce ve sonra burada görüntülenir.

Bu yöntem, dizileri kalibre etmek için kullanılır. Dizilerin kalibrasyonu, sensörlerin tepkisini normalleştirmeye ve her çalıştırmanın biyo işlevselleştirme profiline dayalı olarak kesirli doluluğun belirlenmesine yardımcı olur. Ayrışma sabitini belirlemek ve LSPR çipi için ana hatlarıyla belirtilen aynı protokolü kullanarak spesifik olmayan bağlanmaya karşı direnci incelemek için ticari bir SPR cihazı kullanılır.

İki diziden normalleştirilmiş değerler burada gösterilir. Bir dizi hücrenin 10 mikrometre yakınındaydı, kontrol ise hücreden 130 mikrometre uzaktaydı. Kontrol dizisinin düz tepkisine göre hücreye en yakın dizinin normalleştirilmiş yanıtındaki ani artış, salgılanan antikorların lokalize bir patlamasının göstergesidir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip tek tek hücrelerden protein salgılarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.