Tek hücreli Seviyesinde Kavitasyon Kabarcık (ler) -Hücre Etkileşim ve Sonuç biyoetkiler incelenmesi için yüzey Desenlendirme ile mikroakışkan Sistemi

Bu deneysel prosedürün genel amacı, tandem kabarcıkların oluşumunu ve tek tek hedef hücrelerin konumunu ve şeklini hassas bir şekilde kontrol etmek için yüzey modellemesi kullanarak mikroakışkan hapsinde kavitasyonun neden olduğu biyoetkileri araştırmaktır. Bu mikroakışkan sistem, terapötik ve ses yayını ve ses çalışması ile ilgili olan bu transit kavitasyon kabarcıklarının ve hücrelerinin denenmesini sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, yüzey desenlemeden elde edilen hassasiyetin iyileştirilmesinden kaynaklanmaktadır.

Tek tek hücrelerin biyolojik etkilerini incelememize izin verir ve güvenilir kabarcık-kabarcık etkileşiminden yüksek bir akış yüklemesidir. Prosedürlerin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü çip adımlarındaki yüzey modellemesi ve hücre hazırlığı, çeşitli teknikler ve uçlar içeren karmaşıktır. Temiz oda kıyafeti giyerken tüm mikrofabrikasyon prosedürlerini temiz bir odada gerçekleştirin.

Her bir altın noktanın alanını 25 ila 30 mikron kare arasında tasarlayın, böylece kabarcık oluşumu için lazer enerjisini emecek kadar büyük, ancak tek tek hücrelerin ona yapışmasını önleyecek kadar küçük olacak. Kimyasal bir başlıktaki cam sürgüyü metin protokolüne göre temizleyin, ardından döndürme kaplama başlığına ilerleyin. Döndürme kodlayıcıyı iki saniyede 1000 RPM'ye çıkacak ve bu hızı beş saniye boyunca koruyacak, ardından üç saniyede 3000 RPM'ye çıkacak ve bu hızı 30 saniye boyunca koruyacak şekilde programlayın.

Ardından, vakumu kullanarak cam sürgüyü döndürme kodlayıcıya sabitleyin. Ardından, sürgüyü P20 ile örtün ve sıkma döngüsünü başlatın. Ardından, aynı döngüyü kullanarak NFR negatif fotoğraf direncini uygulayın.

Şimdi, slaytı 95 santigrat derecede sıcak bir tabakta 60 saniye pişirin. Oda sıcaklığına soğutulduktan sonra fotolitografiyi gerçekleştirin. Krom maskeyi maske hizalayıcıya monte edin ve desen tarafının sürgüye doğru aşağı baktığından emin olun.

Ardından, fotolitografi tarifini dokuz saniyelik UV pozlaması ile sert pozlama moduna ayarlayın ve cam alt tabakayı maske ile hizalayın. UV'ye maruz kaldıktan sonra, slaydı 95 santigrat derecede bir dakika pişirin ve ardından eskisi gibi soğumaya bırakın. Slayt üzerindeki deseni geliştirmek için, 60 saniye boyunca geliştirici solüsyonuna yerleştirin, ardından slaytı damıtılmış suyla yıkayın ve nitrojen gazı ile kurulayın.

Mikroskobik inceleme ile deseni onayladıktan sonra, slaydı 120 santigrat derecede beş dakika pişirin ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Şimdi, slaytı plazma ile reaktif iyon aşındırma makinesinde 500 tor ve 100 watt'ta 90 saniye boyunca temizleyin. Bir E-ışını evaporatörü kullanarak, numuneyi plaka tutucuya bantlayın.

Makineyi 5 nanometrelik bir titanyum tabakası ve ardından 15 nanometrelik bir altın tabakası biriktirecek şekilde programlayın. Bu konum tamamlandığında makineyi havalandırın. Daha sonra, NFR direncinin üzerinde duran altını çıkarmak için slaytı gece boyunca bir fotorezist sökücü çözücü kabına batırın.

Ertesi gün, slaytı asetonla, ardından IPA ile yıkayın ve ardından nitrojenle kurulayın. Slaytı DI su ile durulayın ve tekrar nitrojen ile kurulayın. Şimdi, slaytı 115 santigrat derecede beş dakika ısıtın.

Ardından, 90 saniye boyunca 100 watt'ta bir oksijen plazma asher kullanarak altın nokta desenli slaytı temizleyin. Adada birden fazla hücrenin toplanma olasılığını en aza indirirken, kare bir bölgede yeterli hela hücresinin yayılmasını kolaylaştırmak için her fibronektin kodlu adanın alanını 700 ila 900 mikron kare arasında olacak şekilde ayarlayın. Fabrikasyon, altın deseninkine çok benzer.

Slaytı daha önce olduğu gibi döndürün, S18 pozitif fotorezist kullanın ve kodlama üzerinde 115 santigrat derecede pişirin. Ardından, maske üzerindeki işaretleri alt tabaka üzerindekilerle hizalayarak fotolitografi yapın. Doğru açıyı onaylamak için orta kısımdaki deseni kontrol edin ve altın noktalardan H desenine olan mesafeyi ayarlayın.

UV pozlamasını pişirme sonrası olmadan dokuz saniye boyunca çalıştırın. Bir sonraki fark, geliştirme adımının sadece 45 saniye sürmesidir. Reaktif iyon aşındırma için parimetreleri 500 tor 100 watt'a ve 90 saniyeye ayarlayın.

Ardından, bir parça parafin film üzerine bir damla PLLG peg pasifleştirici solüsyon uygulayın ve solüsyonu slaydın desen tarafına sandviçleyin. Baloncukları yakalamaktan kaçının. 45 dakika sonra slaytı filmden çıkarın.

Slaytı DI suyla durulayın ve ardından nitrojenle kurulayın. Ardından, slaytı art arda fotorezist sökücü 1165'e batırın. Daha sonra DI suyunda yüzde 50 1165.

Sonra sadece DI suyu. Her banyo sırasında, çözeltiyi 90 saniye boyunca bir ultrason banyosunda çalkalayın. Şimdi, slaytı sıcak bir plaka üzerinde kurutun, ardından bir kurutucuya kapatın ve 4 santigrat derecede saklayın.

Slaytları, metin protokolünde açıklandığı gibi bir mikro kanal çipine birleştirin. PLLG peg'i çevresel alandan çıkarmak için reaktif iyon aşındırma kullanmadan önce cam alt tabakanın desenli alanını küçük PDMS levhası ile korumaya dikkat edin. Desenli camı RIE makinesinden alın ve küçük PDMS levhasını çıkarın.

Mikrokanal PDMS'yi azaltılmış bir oksijen plazması dozu ile işlemden geçirdikten sonra, bir stereoskop altında desenli cam alt tabakaya hizalayın. Mikro kanal PDMS'yi ve desenli cam alt tabakayı uyumlu temasa getirin. Şimdi çipi kullanmaya devam edin.

İlk olarak, PBS'yi dakikada bir mikrolitre hızında 30 dakika boyunca mikrokanaldan aşağı akıtarak çipi hazırlayın. Daha sonra çipi aynı akış hızında 45 dakika boyunca fibronektin çözeltisi ile demleyin. Beklerken, hücreleri mililitrede beş milyon hücrede hazırlayın.

Sağlıklı durum ve yüksek izdiham bu prosedür için kritik öneme sahiptir. Daha sonra, çipten akan çözeltiyi PBS ile değiştirin ve akış hızını dakikada on mikrolitreye yükseltin. PBS'nin beş dakika boyunca akmasına izin verin.

Daha sonra, hazırlanan hücreleri bir şırınga ile çipe enjekte edin. Borudan bir damla aktığında, enjeksiyonu durdurun ve çıkışı sıkıştırın. Ardından, çipi 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.

Daha sonra, prizi serbest bırakın ve çipi beş dakika boyunca dakikada on mikrolitre hücre kültürü ortamıyla yıkayın. Beş dakika sonra, akışı dakikada 0,75 mikrolitreye düşürün ve çipi ve pompayı iki saat boyunca bir inkübatöre aktarın. İki saat sonra, altın nokta desenine yönlendirilmiş zamanlama kontrollerinde ve sonuçları yakalamaya hazır yüksek hızlı bir kamera ile çipi ters çevrilmiş bir mikroskop altında görüntüleyerek tandem kabarcık oluşturmaya devam edin.

50 mikronluk kabarcıklar için, iki lazer arasındaki gecikmeyi 2,5 mikrosaniyeye ayarlayın ve güçlerini on mikrojoule olarak ayarlayın. Ardından, yüksek hızlı kamera kaydını lazerlerle senkronize edin ve 200 nanosaniye pozlama ile saniyede iki milyon kare hızında kayıt yapın. Böylece kabarcık genişlemesi, çökme balonu-kabarcık etkileşimi ve jet oluşumu dinamikleri kaydedilir.

Kabarcık-kabarcık etkileşimleri ve çeşitli kavitasyonun neden olduğu biyoetkiler, tandem kabarcıkların jet oluşumu ile geçici etkileşimleri, ortaya çıkan akış alanının görselleştirilmesi ve jet hızının hesaplanması gibi, açıklanan teknik kullanılarak tek hücre düzeyinde incelenmiştir. Tandem baloncuğun etrafındaki yönlü jet akışı saniyede yaklaşık on metredir, yaklaşık on mikron genişliğindedir ve bu nedenle yakındaki hedef hücreler üzerinde dürtüsel ve lokalize bir saf stres ve stres gradyanı üretebilir. Tandem kabarcığın neden olduğu hücre zarı deformasyonu da incelenmiştir.

Membran deformasyonu ve geri kazanımı, hücre zarının ön kenarına tutturulmuş işlevselleştirilmiş boncukların yer değiştirmesiyle vurgulanır. Bitişik boncuklardan oluşan bir üçlünün koordinatlarından, yerel alan gerinim hesaplandı. Bu şema, hücre yüzeyindeki farklı konumlardaki maksimum alan değişimini gösterir.

Ön kenar esas olarak gerilirken, hücrenin arka kenarı veya yan tarafları sıkıştırılır, bu da tandem kabarcığın neden olduğu püskürtme akışı tarafından üretilen heterojenliği ve hücre deformasyonunu gösterir. Hücre ön kenarındaki alan gerilmesinin zamansal değişimi, birkaç hızlı salınımdan ve ardından yaklaşık 100 mikrosaniye boyunca büyük ve sürekli bir gerilmeden ve ardından birkaç milisaniyelik bir zaman ölçeğinde kademeli bir iyileşmeden oluşur. Bu videoyu izledikten sonra, yüzey deseninden kontrollü şekil ve konuma sahip tek hücrelerin biyolojik etkilerini incelemek için kontrol edilebilir bir kabarcık-kabarcık etkileşiminin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü takiben, hücre iskeleti inceltme ve evlilik görüntüleme gibi diğer önlemler, tandem kabarcık tedavisinin hücre hücre iskeleti yeniden düzenlenmesini incelemek için daha fazla gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, subpretik ultrason alanındaki araştırmacıların, tek hücre düzeyinde kaptasyonun neden olduğu biyoetkileri keşfetmelerinin yolunu açacaktır. Bu prosedürü denerken, hücre modellemesi sırasında başarı için iyi bir hücre birleşmesi ve durumunu korumayı unutmamak önemlidir.

Temiz oda kimyasalları ve lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve lazer gözlüğü takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.