Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Bu deneyin genel amacı, görünür ışık kullanarak enzimatik reaksiyonları sürdürmektir. Bu yaklaşımda ışık, hafif reaksiyon koşulları altında yağ asitlerini terminal alkinlere dönüştürmek için kullanılır. Dekarboksilasyon, CC bağlarının kırılmasını gerektirir.

Ve bu bağ çok kararlıdır, bu da bunu çok zor bir reaksiyon haline getirir. Işık kullanımı, böylesine zor bir reaksiyonu elde etmek için sürdürülebilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem için ilk olarak, enzimlerin inaktivasyonuna yol açan reaksiyona doğrudan hidrojen peroksit eklemeye çalıştığımızda aklımıza geldi.

Bu tekniğin temel avantajı, sabit miktarda hidrojen peroksit sağlamasıdır. İlk olarak, enzimimizi karakterize etmek için ışıkla çalışan biyokataliz için saflaştırılmış OleT kullandık. Daha sonra, endüstriyel uygulamaların geliştirilmesi için önemli olacak ham ekstraktı da test ettik.

Sentetik OleT genini ekspresyon vektörüne klonladıktan ve plazmiti metin protokolünde tarif edildiği gibi E.Coli'ye dönüştürdükten sonra, hücreleri mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile üç mililitre LB ortamı içeren iki test tüpüne aşılayın. Ön kültürleri 15 saat boyunca bir çalkalayıcıda inkübe edin. Kültürün iki mililitresini, iki adet bir litrelik şişede ampisilin ile 200 mililitre LB'ye seyreltin.

Şişeleri, kültürler 0,6 ile 0,8 arasında 600 nanometrede optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 santigrat derece ve 180 RPM'de bir çalkalayıcıda inkübe edin. Daha sonra, kültürlere 0.5 milimolar delta aminolevulinik asit ekleyin. Daha sonra şişelere mililitre başına 0.2 mikrogram tetrasiklin ekleyerek hücreleri indükleyin.

Kültürleri 20 santigrat derece ve 180 RPM'de 15 saat inkübe edin. İndüksiyondan sonra, kültürleri santrifüj tüplerine boşaltın ve tüpleri 20 dakika boyunca 12000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı atın.

50 mililitre buz gibi soğuk Tris tamponunda pipetleyerek peletleri yeniden süspanse edin ve süspansiyonu konik bir santrifüj tüpüne aktarın. 15 dakika boyunca 4000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek devam edin. Süpernatanı atın ve pipetlemeyi tekrarlayarak her peleti üç mililitre tamponda yeniden süspanse edin.

Döngüler arasında bir dakika duraklayarak 30 saniyelik üç döngü ile sonikasyon yaparak hücreleri parçalayın. Daha sonra, lizatı 20 dakika boyunca 15000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve ardından hücresiz ekstraktı dikkatlice konik santrifüj tüplerine pipetleyin. Işık tahrikli biyokataliz için ham ekstraktın hazırlanması için, üç mililitre bir hücresiz ekstraktın 10 kilodaltonluk bir santrifüj filtresine aktarın ve küçük molekülleri çıkarmak için dört santigrat derecede 4000 kez G'de santrifüjleyin.

Proteini üç mililitre Tris içinde tekrar süspanse edin. Işık tahrikli biyokatalizde OleT'in aktivitesini karakterize etmek için proteinin saflaştırılması gerekir. Protein saflaştırmasını başlatmak için, dengelenmiş nikel NTA spin kolonlarına üç mililitre hücre serbest ekstraktı yükleyin.

Sütunları alt tapalar ve vidalı kapaklarla kapatın. Ve reçine eşit şekilde dağılana kadar hafifçe çalkalayın. Sütunları bir üst çalkalayıcıda inkübe ederek devam edin.

Ardından sütunu santrifüjleyin. Daha sonra, bir mililitre yıkama tamponu ekleyerek ve iki dakika boyunca 700 kez G'de santrifüjleyerek sütunları yıkayın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Yıkadıktan sonra, kolonları konik santrifüj tüplerine yerleştirin ve her kolona bir mililitre elüsyon tamponu ekleyin. Tüpleri iki dakika boyunca 700 kez G'de santrifüjleyin ve elüsyonu iki kez daha tekrarlayın. Kombine kolon ekstraktlarını 10 kilodaltonluk bir santrifüj filtresine ekleyin ve elüsyon için kullanılan imidazol'ü enzimden ayırmak için 4000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Son olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi protein saflığını ve konsantrasyonunu belirleyin. Biyo dönüşüm prosedürünü başlatmak için, önce tergitol gibi bir yüzey aktif maddenin %10'unu ve 28.4 miligram stearik asidi damıtılmış suya ekleyin ve 10 mililitre 10 milimolar stok çözeltisi elde edin. Çözeltiyi, stearik asit tamamen eriyene kadar 60 santigrat derecede bir ısıtma odasında ısıtın.

Bir sonraki protokole göre bir reaksiyon karışımı hazırlamak için bu çözeltiyi kullanın. İki şeffaf cam tüpe FMN, EDTA, tampon ve stearik asit ekleyin ve 25 santigrat derecede bir su banyosunda karıştırın. Tüplere mililitre başına 200 mikrogram saflaştırılmış enzim veya ham ekstrakt ekleyerek devam edin.

Ve onları iki santimetre mesafeden net bir LED ampulle aydınlatın. Daha sonra, reaksiyonları durdurmak için 20 mikrolitre% 37 hidroklorik asit ile önceden doldurulmuş tüplerde belirli zaman noktalarında 200 mikrolitre numune alın. Daha sonra, her numuneye dahili bir standart olarak beş mikrolitre 10 milimolar miristik asit çözeltisi ekleyin.

Reaksiyon ürünlerini analiz etmek için, tüplere iki kez 500 mikrolitre etil asetat ekleyin. Tüpleri karıştırmak için ters çevirin ve 13.000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Daha sonra, 400 mikrolitre süpernatantları mikro santrifüj tüplerine aktarın ve tüplere basınçlı hava ile hafifçe üfleyerek tamamen buharlaştırın. Tüplere 200 mikrolitre MSTFA ekleyin.

Ve analizden önce numuneleri türetmek için karışımı 60 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Metin protokolünde açıklanan sıcaklık profilini kullanarak bir alev iyonizasyon detektörü ile donatılmış bir gaz kromatografına dört mikrolitrelik bir numune enjekte ederek reaksiyon ürünlerini analiz edin. Daha sonra, bir kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı ile her reaksiyon numunesinde oluşan bir heptadekan ve beta hidroksi asidin oranını belirleyin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi fırın sıcaklığı ve kütle spektrometresi ayarlarını kullanın. Her numuneden bir mikrolitre gaz kromatografına enjekte edin ve kromatogramı kaydedin. Son olarak, her numune için GCMS kromatogramlarını izleyin ve bunları üreticinin protokolüne göre analiz edin.

Enzimatik reaksiyonlardan elde edilen ürünlerin moleküler ağırlıkları, bir kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı kullanılarak belirlendi. Daha uzun asil zincirlerine sahip yağ asitleri için, OleT enzimi, tercihen dekarboksilasyonlarını farklı uzunluklardaki olefinlere katalize eder. Biyotransformasyon reaksiyonundan elde edilen numuneler, bir alev iyonizasyon detektörü ile donatılmış bir gaz kromatografı ile analiz edildi.

Stearik asidin dekarboksilasyonunun, stearik asidin% 99'unun bir heptadekan ila 2-hidroksi stearik asidin 3.3: 1 karışımına dönüştürüldüğü hidroksilasyon reaksiyonundan üç kat daha hızlı meydana geldiği gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, ışıkla çalışan biyokataliz, düzgün bir şekilde performans gösterirsem birkaç saat içinde yapılabilir. Işık katalizinde zorluk, yararlı reaksiyonları ışık hasadına bağlamaktır.

Bizim durumumuzda, FMN molekülü içinde ışığa duyarlılaştırıcı olarak ışığa sahibiz ve bunları hidrojen peroksit olan transfer molekülü aracılığıyla enzimimize bağlıyoruz.