Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü
28 Aralık 2015
3D sferoidlerin iç G1 tutuklanan ve dış proliferatif bölgelerindeki hücreleri tanımlamak ve izole etmek için floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) ve görüntü analizi veya akış sitometrisi kullanarak iki tamamlayıcı yöntemi açıklıyoruz.
Bu yöntemin genel amacı, 2D hücre kültürüne kıyasla hücre döngüsü durumlarına ve steroid içindeki konumlarına göre hücreleri çok hücreli bir steroidden tanımlamak, karakterize etmek ve izole etmektir. 3D OID modeli, sferosları akış sitometrisi ve görüntüleme teknikleriyle eşleştirerek tümör mimarisini ve mikro çevresini taklit ettiği için in vivo olarak kanserin biyolojisini özetler. Bu yöntem, tümör mikro çevresinin ilaç duyarlılığını, hücre hareketliliğini ve proliferasyonunu nasıl değiştirdiği gibi kanser alanındaki temel soruları yanıtlayabilir.
Bu yöntemin temel avantajı, hücre döngüsünün gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlaması ve prosedürün yapılacağını gösteren belirli bir steroid bölgesinden canlı hücrelerin saflaştırılmasına izin vermesidir Laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan keskin bir araştırmacı, 100 mililitre Hank'in denge tuzu çözeltisi veya HBSS içinde% 1.5 aros mikrodalgada pişirerek 3D steroid oluşumu için hazırlanmaya başlayın veya üç ila beş dakika aralıklı olarak şişeyi döndürün. AROS'un tamamen çözüldüğünü. Daha sonra hemen 100 mikrolitre aros solüsyonunu düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna pipetleyin. Aros'un katılaşmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Daha sonra, FCI yapılarını eksprese eden melanom hücrelerinin %80'lik bir birleşme hücre kültürünü hücre kültürü inkübatöründen çıkarın. Hücreleri 10 mililitre HBSS ile yıkayın. EDTA'ya 1,5 mililitre% 0,05 ekleyin ve ardından hücreleri yaklaşık iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Hücreler resüsleri ayrıldıktan sonra, onları 10 mililitre hücre kültüründe askıya alın. Orta. Hücreleri bir hemo, sitometre ve ters mikroskop kullanarak manuel olarak sayın ve hücre kültürü ortamında mililitrede 25.000 hücreye seyreltin. Ardından, 96 kuyulu aros plakasının her bir oyuğunu kaplamak için 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu pipetleyin.
Hücre sferoidleri oluşturmak için plakayı yaklaşık üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir Forex objektifi ve bir faz kontrast filtresi kullanarak ters çevrilmiş bir mikroskopta sferoidleri görüntüler. Sferoidler, hücre steroidini kesitleme ve görüntüleme için hazırlamak için kompakt, kabaca küresel hücre agregatları olarak görünmelidir.
Onları bir şahin tüpüne taşımak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Sonra steroidin koninin dibine yerleşmesine izin verin. Daha sonra, orta bi emişi çıkarın ve ardından sferoidleri oda sıcaklığında en az iki saat boyunca %10 nötr tamponlu formin içinde inkübe ederek sabitleyin.
SP daha sonra hücrenin kesitlenmesini ve görüntülenmesini takiben birkaç gün boyunca HBSS'de dört santigrat derecede saklanabilir. Sphe görüntü analiz yazılımını açın ve yalnızca nicelik yapılandırmasını seçin. Ardından yeni bir kitaplık oluşturun ve ham veri dosyasını kitaplığa sürükleyerek küresel konfokal görüntü dosyasını içe aktarın.
Ardından, komutları protokol penceresinde doğru sırayla sürükleyip bırakarak bir görüntü analizi protokolü oluşturmak için ölçümler sekmesine gidin. Yeşil kanaldaki nesneleri bulmak için, bulma bölümündeki nesneleri bul komutunu protokol penceresine sürükleyip bırakın ve uygun kanalı seçin. İşleniyor altında bulunan bir aç komutu ekleyin ve ardından hücreleri ayırmak için ayrı bir dokunma nesneleri komutu ekleyin.
Son olarak, filtreleme bölümünden nesneleri boyuta göre ekleyin ve hariç tutun. Hücresel olmayan küçük nesneleri dışlamak için 50 mikrometreden küçük nesneler için komut. Ardından, protokol penceresine yeni bir nesneleri bul komutunu sürükleyip bırakın.
Aynı adımları izleyerek kırmızı kanalı seçin ve sonraki tüm komutları uygulayın. Nesneler bulunduktan sonra, kırmızı ve yeşil nesnelerin kırmızı ve yeşil çekirdeğe karşılık geldiğinden görsel olarak emin olmak için kanalı gizle veya kanalı göster komutlarını kullanın. Gerekirse, nesne maskelerinin görünümünü değiştirmek için ölçümlere ve ardından geri bildirim seçeneklerine tıklayın.
Şimdi, erken S fazı hücrelerine karşılık gelen sarı nesneleri bulmak için, birleştirme bölümünde bulunan kesişim komutunu kullanın ve kırmızı nesneleri yeşil nesnelerle kesiştir'i seçin. Yine, nesneleri 50 mikrometreden daha küçük boyuta göre hariç tutun. G tek fazlı hücreleri tanımlamak için, birleştirme bölümünde bulunan çıkar komutunu kullanın ve yalnızca kırmızı nesneleri bulmak için sarı nesneyi kırmızı nesnelerden çıkar'ı seçin.
Benzer şekilde, hem yalnızca kırmızı hem de yalnızca yeşil nesneler için SG iki ve MPH faz hücreleriyle ilişkili olan yalnızca yeşil nesneleri tanımlamak için sarı nesneleri yeşil nesnelerden çıkarın. Şekil faktörü 0,25'ten büyük olan filtreleme bölümünden bir filtre doldurma komutu uygulayarak hücresel olmayan nesneleri gerektiği gibi kaldırın. Ardından S küresel taslağını bulun.
Yeşil veya kırmızı kanaldaki bulma bölümünden nesneleri bul komutunu kullanarak. Tek tek hücreleri tek bir nesnede birleştirmek için işleme bölümünden kapalı bir komut kullanın. Ardından, küredeki delikleri doldurmak için nesnelerdeki delikleri doldur komutunu ekleyin.
Ardından, Sphero nesnesindeki paraziti gidermek için ince bir filtre kullanın. 30.000 mikrometreden küçük nesneleri kaldırmak için nesneleri boyuta göre hariç tut'u seçerek küresel anahattı bulmayı bitirin. Tüm nesneler tanımlandıktan sonra, her bir OID'den S küresel anahattının kenarına olan mesafeyi belirlemek için ilgili bölümden ölçüm mesafeleri ekleyin.
Bunu sarı, yalnızca kırmızı ve yalnızca yeşil popülasyonların her birinde yapın. Hücreden en yakın S küresel kenarına kadar olan minimum mesafeleri görselleştirmek için ölçümler sekmesini açın ve geri bildirim seçeneklerini ve ardından ilişkileri seçin. Ardından mesafeleri göster'i seçin.
Son olarak, protokol tarafından oluşturulan verileri kaydetmek için protokolü kaydedin. Ölçüm bölümünden ölçüm yap öğesini seçin. Daha sonra verileri yorumlamak için ölçüm öğesini seçin, ölçüm bölümündeki analiz sekmesine gidin ve steroid kenarından belirli bir mesafede bulunan hücreleri saymak için analiz menüsü altında Analiz Et'i seçin.
Analiz sekmesinden filtre'yi seçerek bir filtre oluşturun. Örneğin, yalnızca küre kenarına olan uzaklığın 100 mikrondan az olduğu verileri gösterin. Ham verileri dışarı aktarmak için dosya sekmesinden dışa aktar'ı seçin ve ardından verileri virgülle ayrılmış veya sekmeyle sınırlı metin olarak kaydedin.
Bu veriler, daha fazla analiz için bir elektronik tablo programında açılabilir. C 8 1 16 1'den üretilen hücre tüfesi. Fuji sistemi ile transdüksiyona tabi tutulan insan melanom hücreleri tespit edildi ve kesitlere ayrıldı.
Hücre döngüsünün SG iki M fazındaki hücreleri işaretleyen AZA yeşili ve G bir fazındaki hücreleri işaretleyen Berra turuncusu için konfokal görüntüleme yapıldı. Bu görüntüler üst üste bindiğinde, nekrotik çekirdek gibi temel özellikler beklendiği gibi gözlemlenebilir. Kırmızı G, bir tutuklanmış hücreler bu nekrotik çekirdeğe daha yakın baskınken, kırmızı ve yeşil çoğalan hücreler steroidin dış kenarına doğru gradyan bir şekilde artar veya oksijen ve besin maddelerine erişim en fazladır.
Yarı otomatik görüntü analizinin ardından, fucci hücre maskeleri ve S küresel anahat tanımlanabilir. S sferoidinin iç veya dış bölgesindeki kırmızı ve yeşil hücreleri ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanıldı. Bu analiz, G bir fazlı tutuklanan hücrelerin iç bölgede zenginleştiğini, çoğalan hücrelerin ise steroid Edge'e daha yakın olduğunu gösterdi.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, steroidin büyütülmesini, görüntüleme ve analizi içeren bir zaman dilimi olan bir ila iki hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, radlar kollajen matrisine implante edilebilir ve daha sonra bir TimeLapse mikroskobu ile görüntülenebilir. Daha sonra protein veya RNA analizine tabi tutulabilirler ve bu, steroiddeki pozisyonun ve oksijen ve besin maddelerine erişimin kanser hücresi fenotiplerini değiştirip değiştiremeyeceği gibi soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, floresan ubikuitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) ile görüntü analizi ve akış sitometrisi kullanarak iki tamamlayıcı yöntemi sunmaktadır. Bu teknikler, 3D sferoidler içindeki hücre döngüsü durumlarına göre hücreleri tanımlamak ve izole etmek için tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Kanser Araştırmaları
- 3D Hücre Kültürü
Arka Plan
- 3D sferoidler, tümör mimarisi ve mikroçevresini taklit eder.
- Hücre döngüsü durumunu anlamak, kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel 2D kültürler, in vivo koşullarını doğru bir şekilde temsil etmez.
- Akış sitometrisi ve görüntüleme teknikleri, analiz yeteneklerini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri tanımlamak ve karakterize etmek.
- 3D sferoidlerden belirli hücre popülasyonlarını izole etmek.
- Tümör mikroçevresinin hücre davranışı üzerindeki etkisini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Görselleştirme için floresan ubikuitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI).
- Hücre döngüsü durumunu değerlendirmek için görüntü analizi.
- Hücre izole etmek için akış sitometrisi.
- Dokuda kültür plakalarında aros kullanarak 3D sferoidlerin hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- İç G1 döngüsü durmuş ve dış proliferasyondaki hücrelerin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Hücre döngüsü dinamiklerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi sağlanmıştır.
- Sferoidlerin belirli bölgelerindeki canlı hücrelerin izolasyonu gösterilmiştir.
- Tümör mikroçevresinin ilaç duyarlılığı ve proliferasyon üzerindeki etkilerine dair bilgiler sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu yöntemler, kanser biyolojisini incelemek için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır.
- Gerçek zamanlı analiz, 3D modellerde hücre davranışı hakkındaki anlamayı geliştirir.
- Bu teknikler, kanser tedavisinde terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding spatial heterogeneity in tumor spheroids enables mechanistic de-risking of target validation by linking cell cycle status to microenvironmental cues. This approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying proliferation gradients and quiescent niches relevant to drug penetration and resistance. It informs portfolio triage by identifying subpopulations most likely to drive recurrence or therapeutic escape.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping G1 arrest and proliferation to spheroid regions, clarifying pathway dependencies in hypoxic versus nutrient-rich zones.
- Operational Value: Enables isolation of live cells from defined zones for downstream functional assays, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable cell cycle readouts for compound screening, ensuring assay relevance to 3D architecture.
- Operational Value: Standardizes spatial and phenotypic outputs via image analysis, improving reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling necrosis, quiescence, and proliferation gradients observed in vivo.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking position-dependent phenotypes to microenvironmental stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of microenvironmental effects on cell cycle, proceeds to screening via standardized spheroid-based assays, and supports translational research through spatially resolved biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating cell position with cell cycle phases to clarify drug response mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable red/green cell ratios in inner/outer spheroid regions, enabling compound effect tracking.
- Analytics: Provides distance-from-edge measurements and phase-specific masks as quantitative outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling oxygen/nutrient gradients that influence cancer cell phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal tracking of cell viability, gene expression, or drug response across multiple spheroid generations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through spatial resolution of proliferation and quiescence, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and scalability via semi-automated image analysis and flow cytometry isolation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by de-risking targets based on microenvironmental responsiveness.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds that penetrate quiescent niches or target cycling cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FUCCI transduction, spheroid culture, and confocal imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy and image analysis software capable of channel segmentation and morphometric filtering.
- Necessitates standardization across cell lines and matrix conditions for reproducible spheroid formation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-melanoma or stromal co-culture systems.
- Limited by sectioning depth and signal penetration in larger spheroids, affecting core region resolution.
