Name: Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Keşfedin, 3D melanom kürelerinde FUCCI kullanarak hücre döngüsü durumunu görüntüleme ve akış sitometrisi ile hücre izolasyonu yöntemlerini. Bu teknik, tümör mikroçevresinin kanser hücre davranışı üzerindeki etkisini incelemek için canlı hücreleri gerçek zamanlı analiz etme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Bayan Danae Sharp ve Bayan Sheena Daignault'a teşekkür ederiz. FUCCI yapılarını sağladıkları için RIKEN, Wako-city, Japonya'dan Dr. Atsushi Miyawaki'ye, Philadelphia'daki Wistar Enstitüsü'nden Dr. Meenhard Herlyn ve Bayan Patricia Brafford'a, hücre hatları sağladıkları için, Yüzüncü Yıl Enstitüsü'ndeki Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Tesisine olağanüstü teknik destek için teşekkür ederiz. Volocity yazılım teknik desteği için Bay Chris Johnson ve Dr. Andrew Barlow'a teşekkür ederiz. N.K.H., Avustralya'daki Melanom ve Cilt Kanseri Araştırma Enstitüsü'nün Cameron üyesidir. K.A.B., New South Wales Kanser Enstitüsü üyesidir (13/ECF/1-39). W.W., Yeni Güney Galler Kanser Enstitüsü'nün bir üyesidir (11 / CDF / 3-39). Bu çalışma, RG 09-08 ve RG 13-06 (Yeni Güney Galler Kanser Konseyi), 570778 ve 1051996 (Öncelik odaklı işbirlikçi kanser araştırma programı/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Vakfı), 08/RFG/1-27 (Yeni Güney Galler Kanser Enstitüsü) ve APP1003637 and APP1084893 (Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi) proje hibeleri tarafından desteklenmiştir.

1. Fucci Transdüksiyonu ve Hücre Kültürü <ol><li> Fucci iletimi <ol><li> Stabil Fucci ifade eden hücre hatları oluşturmak, daha önce 7 açıklandığı gibi lentivirüs ko-transdüksiyonunun kullanarak mKO2-hCdt1 (30-120) ve MAG-hGem (1-100) 15 oluşturur. Not: Fucci sistemi şimdi ticari olarak elde edilebilir. </li><li> Tek hücreli sıralama ile parlak floresan ile alt klonları oluşturun. Bir 96-yuvalı plaka içine flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile AG ve KO (sarı) hem pozitif Sıralama, tek hücreler, daha önce tarif edildiği 7,16. </li></ol></li><li> Melanom hücre kültürü <ol><li> Kültür C8161 insan melanoma hücresi, daha önce tarif edildiği 7,17. </li></ol></li></ol> 2. 3B küre formasyonu (daha önce tarif edilen 3,9) <ol><li> Agaroz plaka hazırlığı <ol><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya fosfat Buffere, 100 ml% 1.5 agaroz (ya da asal agar) çözündürünGirdap şeklinde karıştırarak 3-5 dakika süreyle mikrodalgada kaynatılarak d salin (PBS). Agaroz tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. </li><li> Derhal bir çok kanallı pipet kullanarak, düz tabanlı 96 oyuklu doku kültürü plakası oyuk başına agaroz çözeltisi 100 ul dağıtmak. Not: Agaroz, kısa bir süre sonra ipuçları katılaşabilir birden fazla agaroz levhası yapmak, bu sorun, uçları plakalar arasında değiştirilmelidir üstesinden gelmek için. </li><li> En az 1 saat süre ile agaroz sertleşmeye düz bir yüzeye 96 oyuklu plaka bırakın. </li></ol></li><li> Agaroz üzerine Hücre hazırlanması ve bindirme <ol><li> T75 şişesi içinde% 80 karışacak hücreleri büyütün. HBSS, 10 ml ile yıkayınız. </li><li> Normal ortam, 10 ml% 0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve tekrar süspansiyon 1.5 ml kullanarak hücreleri ayırın. </li><li> Hemasitometre 18 veya diğer otomatik sayım yöntemi kullanılarak hücre sayımı. </li><li> Normunda 25.000 hücre / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse hücrelerinal ortamı. </li><li> Oyuk başına 5000 hücre nihai sayıda hücre süspansiyonu 200 ul agaroz kuyu Yerleşimi. </li><li> Hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 ve 37 ° C) geri plakaları üzerinde yaklaşık olarak 3 gün küreler oluşturma. Not: bir küremsi oluşturulması için geçen zaman, farklı hücre hatları arasında değişir. Bazı hücre çizgileri de bu yöntemi kullanarak sferoidler oluşturmazlar. </li><li> 4x objektif ve bir faz kontrast filtresi kullanılarak bir inverted mikroskop ile görüntü sfero morfolojisi. Başarılı bir şekilde sferoidler, kompakt, kabaca küre şeklindeki hücre agrega üretecek ve oyuk başına sadece bir küremsi olmalıdır oluşturan bir hücre çizgisi. Not: İsteğe bağlı: sferoidler oluşturmuşlardır sonra, bu büyüme ve invazyon 3,7,17 ​​ve daha fazla analiz için kolajen ya da diğer matris içine transplante edilebilir. Kollajen spher için yeterli çözünene kadar 37 ° C &#39;de 2 mg / ml kollajenaz 500 ul ile tedavi, kollajen sferoidler kaldırmak içinOID&#39;ler medya (yaklaşık 30 dakika) içine serbest gelmek. Yavaşça 1 ml pipet kullanarak parçacıklarının kaldırın. </li><li> Kesit için / görüntüleme (kollajen izole edilmiş ya da agaroz üzerinde 3-5 gün için büyütülmüştür olarak)% 10 nötr tamponlu formalin içinde düzeltme sferoidler (DİKKAT: Formol bir çeker ocak kullanılmalıdır), oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca (RT) 4 ° C&#39;de ya da gece (O / N). Sferoidler birkaç gün 4 ° C&#39;de HBSS depolanabilir. </li></ol></li></ol> 3. Sfero Vibratome Kesit <ol><li> Mikrodalgada 500 ml&#39;lik bir cam şişeye HBSS 100 ml düşük erime noktasına sahip agaroz 5 g çözündürülür. Dönen bir orta ısı ayarını kullanın. DİKKAT: Basınç serbest böylece çözüm kaynar zaman gevşek kapağı tutun. Sıcak cam şişe tutarken yanık elleri korumak için koruyucu ısıya dayanıklı eldiven kullanın. </li><li> Agaroz hafifçe soğuyana kadar bekleyin - bu yüzden şişe elleri yakmadan dokundu edilebilir. </li><li> Approxima dökünbir Coulter sayacı fincan ya da benzeri plastik kalıp tabanına agaroz tely 2 mi. Hemen sıvı mümkün olan en küçük hacimde 1 ml pipet kullanılarak (bakınız bölüm 2.2.8) sabit sfero aspire. Agaroza sfero ekleyin. (10&#39;a kadar) bir kaç sferoidler fincan başına eklenebilir. </li><li> Agaroz 2 mi daha fazla parçacıklarının örtün. İkinci katman eklenmeden önce agaroz sertleşmesini önlemek için hızlı bir şekilde yapın. </li><li> Agaroz, en az 3 saat süreyle karanlıkta oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Bu noktada bardak 2-3 4 ° C&#39;de kısa bir süre için muhafaza edilebilir HBSS ml su kaybını önlemek için üst üste. </li><li> Bardaktan agaroz çıkarın. O Vibratome metal blok üzerine oturur ve sferoidler agaroz üstüne yakın şekilde parçacıklarının içeren agaroz Trim. Sferoidler agaroz içindeki küçük beyaz nesneler olarak görülebilir. Süper blok agaroz tutkal. </li><li> Damıtılmış su ile doldurun ve Vibratome vibratome blok monte edin. Yı kurVibratome düşük hızda (ayar 2) ve yüksek titreşim (8 ayar) kullanarak 100 mikron bölümleri kesmek için. 16 ° kesme bıçağı açısını ayarlayın. , Vibratome aç vibratome ışığını açmak ve 100 mikron sfero kesitler kesilir kadar agaroz üst bölümleri kesmek. 24 oyuklu bir plaka içerisinde HBSS kesilmiş sferoid bölümleri yerleştirin. </li><li> Görüntü analizi için orta bölümleri seçin. Cımbız kullanarak slayt üzerine bölüm düz transfer ederek slaytlar Mount bölümleri. Vakum yağ ile bir 10 ml&#39;lik bir şırınga gövdesi içinde doldurmak; slayt kenarları kapalı çalışan montaj medya önlemek ve lamel altında bölümüne mühür yardımcı olmak amacıyla bölümünün kenarlarında vakum gres ince bir çizgi ekleyin. Montaj orta ve bir lamel ile bölüm örtün. Oje ile lamel kenarları mühür. Mağaza görüntüleme önce 4 ° C&#39;de slaytlar. </li></ol> 4. Konfokal Resim Alma <ol><li> Bir 10X kullanarak bir orta Fucci küremsi bölümünün z-dilim görüntü almakveya 20X objektif olarak önceden 7 nitelendirdi. Çakışma ya da karışma Kusabira ORANGE2 ve Azami Green arasında meydana emin olun. Birden sfero bölümleri arasındaki görüntü analizi karşılaştırarak ise, lazer gücü ve diğer ayarları örnekler arasında aynı tutmak. </li></ol> Akış Sıralama için 5. Hoechst Dye Difüzyon Deneyi <ol><li> 15 ml tüp canlı parçacıklarının (agaroz tohumlama sonrası 3-5 gün) aktarın. Sferoidler yerçekimi tüpün dibine dinlendiriniz. Birkaç sferoidler tüp başına lekeli olabilir. Yaklaşık 20 sferoidler akış sitometrisi için yeterli hücre sayıları elde etmek için ihtiyaç duyulmaktadır. </li><li> Aşırı orta çıkarın ve normal ortam içinde seyreltilmiş 10 uM Hoechst 1 ml. Yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin parçacıklarının. Inkübasyon sırasında bir veya iki kez parçacıklarının tekrar süspansiyon hafif iterek kullanın. Not: Kuluçka süresi Hoechst boya küremsi nüfuz ne kadar değiştirilmesi için değiştirilebilir. Bu göre değişirküremsi boyutu, yoğunluğu ve hücre çizgisi. Bazı büyük / yoğun küremsiler için% 100&#39;den daha az olan maksimum bir boya penetrasyonu olabilir. </li><li> Gravite çökelmesi ile 5 ml HBSS ile hafifçe sferoidler yıkayın. <ol><li> İsteğe bağlı: boya penetrasyonu görüntüleme için: 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında veya O / N, en az 2 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin ile parçacıklarının sabitleyin. , Vibratome bölümleri hazırlayın Yukarıdaki adımlarda 3 ve 4&#39;te açıklandığı gibi konfokal slaytlar ve görüntü üzerinde monte edin. </li></ol></li><li> Birbirinden sferoidler kırmak için her 10 dakikada bir iterek yaklaşık 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 0.05 tripsin / EDTA, 1 ml sitometrisi trypsinize sferoidler akışı için hücreleri hazırlamak için. Not: sferoitlerin tek bir hücre süspansiyonu içine almak zor koşullar optimize edilmesi gerekebilir. Bu işlemden sonra C8161 4 günlük küremsi Canlılık yaklaşık 95% &#39;dir. </li><li> Üreticilerin protokole göre bir yakın kızıl ötesi canlı / ölü boyası ile Leke hücreleri. Daha sonra, 1 ile düzeltmek HBSS ile yıkayınyaklaşık 30 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin mi. Hücreler akış analizden önce birkaç gün süreyle 4 ° C&#39;de HBSS depolanabilir. </li></ol> Hoechst Lekeli Fucci sferoidlerin 6. Akım Sitometri Analizi <ol><li> Sağlamak hücreler, bir hücre süzgecinden geçirilmesiyle clumped değildir. Hoechst 1-5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda (% 5 fetal dana serumu ile PBS) buz gibi soğuk FACS yıkama Fucci sferoidler lekeli yeniden süspanse edin. Yuvarlak 5 ml alt tüpler numune 200 ul aktarın. </li><li> 6.1 açıklandığı gibi aşağıdaki tek renk kontrol örnekleri hazırlayın: un lekeli melanoma hücreleri; Yapışkan melanom hücrelerinin 1 saat boyunca 10 uM Hoechst ile boyandı; Azami Green, sadece melanoma hücreleri ifade edilmesi; ve Kusabira Turuncu yalnızca melanoma hücreleri sentezleyen. Not: Tek renkli kontrol haftalar ya da aylar boyunca 4 ° C &#39;de,% 0.1 sodyum azid ile yıkama formalin içinde sabitlenmiş ve FACS depolanabilir. </li><li> Run tek hücre süspansiyonları oDaha önce olduğu gibi uygun lazerler ve tek renkli / boyanmamış denetimleri ile analizör sitometri na akışı 7,16 nitelendirdi. </li><li> Aşağıdaki gibi dış sfero hücreleri vs iç analiz etmek gibi FlowJo gibi ticari sitometri yazılımını kullanın: <ol><li> İleri Dağınık Işık Yan Dağınık Işık (SSC) karşı (FSC) ana hücre popülasyonu üzerinde yolluk pislikleri temizleyin. </li><li> FSC vs FSC (Alan) (Yükseklik) kullanan tek hücreler üzerinde yolluk çiftleri kaldır </li><li> Canlı / ölü düşük nüfus yolluk canlı hücreler için Kapısı. </li><li> Hoechst &quot;dış&quot; hücreleri olarak Hoechst ile boyanmış yapışık hücrelere olumlu sinyale göre kapılı yüksek hücreler, tanımlayın. </li><li> &quot;Iç&quot; hücreleri gibi, un-boyanmış kumanda sinyaline dayalı kapılı Hoechst düşük ya da negatif hücreler, tanımlayın. </li><li> Iç ve dış nüfusta geçildikten sonra, hücreler daha da Fucci yeşil kırmızı (G1), sarı (erken S), (S / G2 / M) veya negatif (erken G1) için kapı olabilir. Not: Ctek renk kontrollerini kullanarak ompensation düzgün Fucci, kırmızı, sarı, yeşil ve negatif popülasyonları tanımlamak için gerekli olabilir. </li></ol></li><li> Deney optimize edilmiş ve Hoechst penetrasyon konfokal mikroskopi ile doğrulandıktan sonra, daha önce canlı hücre alt-popülasyonlarının daha fazla analiz için 7,16 tarif edildiği gibi bir akış hücre sıralayıcı üzerine sabitlenmesi hücrelere çalıştırın. </li></ol> Fucci Sfero Bölüm 7. Görüntü Analizi <ol><li> Açık yazılım, örneğin. Volocity, miktar tayini SADECE yapılandırmayı seçin. </li><li> Yeni bir kitaplık oluşturun. Kütüphaneye konfokal ham veri dosyası sürükleyerek yazılımı içine Fucci sfero konfokal görüntü dosyasını içe aktarın. Alternatif olarak, Dosya&gt; İçe Aktar komutunu kullanın. </li><li> Bir görüntü analizi protokolü oluşturmak için ölçümler sekmesine gidin. Protokol sürükleyip protokol penceresinde aşağıdaki gibi doğru sırayla uygun komutları bırakarak inşa edilmiştir. </li><li> Obj bulECTS yeşil kanal: find protokol penceresine (&#39;Bulma&#39; bulundu) komutu nesneleri sürükleyin (&#39;Processing&#39; bulunan) bir açık komutu protocol.Add bulmak nesneleri doğru kanal, daha sonra ayrı bir dokunaklı nesneleri seçmek Komut (&#39;Processing&#39; bulundu - Bu hücreleri ayıracak). Boyutu &lt;50 um Nesneleri Hariç Tut (&#39;Filtreleme&#39; bulundu - bu küçük hücresel olmayan nesneleri hariç tutar). Not: find eşiği, açık yineleme sayısını nesneleri değişkenler gibi, nesnelerin büyüklüğü ayrılacak ve nesne maskeleri görüntüyü eşleştirmek kadar dışlamak için nesnelerin büyüklüğü elle optimize edilmelidir. </li><li> Kırmızı kanal nesneleri bulun: Kırmızı kanal için yukarıdaki gibi nesneleri bulmak Tekrar. Yeşil ve kırmızı protokoller ayrı ayrı ayarlanması gerekebilir. Not: çekirdekler G2 olmak nedeniyle, yeşil çekirdekler genellikle biraz daha büyüktür. </li><li> Bulunan nesneleri doğru onaylayın: Kırmızı onaylayın ve yeşil nesneleri maçkapatarak ve protokol tarafından bulundu kırmızı ve yeşil maskeleri görüntülerken (hide veya göstermek kanal komutunu kullanarak) yeşil ve kırmızı kanallarda görüntüde kırmızı ve yeşil çekirdekler. Görüşleri seçenekleri (Ölçümler&gt; Geri Bildirim seçenekleri) nesne maskelerine görünümünü değiştirmek için kullanılabilir. </li><li> Sarı nesneleri (erken S fazı hücreleri) bul: sarı hücreleri bulmak (&#39;birleştiren&#39; bulundu) komutu yeşil hücreler kırmızı bir Bilgisayar&#39;ı ekleyin. Herhangi bir küçük olmayan hücreli nesneler dışlamak için (&#39;Filtreleme&#39; bulundu &lt;50 mikron) boyutuna göre nesneleri hariç. </li><li> (G1 faz hücreleri) münhasıran kırmızı nesneleri bulun: (&#39;birleştiren&#39; bulunan) kırmızı hücrelerin sarı hücreler, sadece kırmızı çekirdekleri bulmak çıkartmak için. Oluşturulan küçük hücresel olmayan nesneleri kaldırmak için (&#39;Filtreleme&#39; bulundu) boyutu &lt;50 um, nesneleri hariç tut. </li><li> Münhasıran yeşil nesneleri (S / G2 / M faz hücreleri) bulun: sadece yeşil bulmak yeşil kanal için tekrarlayın. Hayırte: hala kalan hücresel olmayan nesneler varsa, bir filtre nüfus komutu sadece korumak için (&#39;Filtreleme&#39; bulundu) Özel yeşil veya özel kırmızı protokollere eklenebilir 0.25 daha büyük bir şekil faktörü ile nesneleri. Bu dairesel olmayan nesneleri kaldırır. </li><li> Sfero anahat bul: Bir bulmak kullanarak sfero anahat bulun (sfero kenarında daha hücreleri vardır hangisi) yeşil veya kırmızı kanalı (&#39;Bulma&#39; bulundu) komutu nesneleri. Bir çok alt eşik (find bulunan değişkenleri nesneleri) bireysel hücrelere kıyasla sfero anahat bulmak için kullanılan gerekecektir. <ol><li> Daha sonra nesneleri gürültü çıkarmak (&#39;Filtreleme&#39; bulunan) ince bir filtre kullanmak, daha sonra (&#39;Processing&#39; bulundu) nesneler delikleri doldurmak (&#39;Processing&#39; bulundu) nesneler katılmak için close komutunu kullanın. Son olarak, küçük nesneleri (sfero boyutuna bağlı olarak) &lt;30,000 um kaldırmak için boyutuna göre nesneleri dahil değildir. Not: Bu protokol sfero anahat doğru dek elle optimize edilmesi gerekecektir. Kullanılacak gerekecektir ancak bu genellikle daha az hassas bir sfero bölüm ve (&#39;birleştiren&#39; bulunan) bir ters komutu ile bir - bir aydınlık görüntü de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Dan olması gereken asgari mesafeler görselleştirmek outline.To sfero kenarına hücre sentroidinden, sarı münhasıran yeşil ve münhasıran kırmızı toplumlarından (&#39;İlişkin&#39; bulundu) Tedbir mesafeleri: sfero anahat çekirdeklerin mesafeleri ölçmek En yakın sfero kenarına hücre, geribildirim seçenekleri (Ölçümler&gt; Geri Bildirim seçenekleri&gt; İlişkiler) &#39;de ilişkileri sekmesinde gösteri mesafelerde açın. </li><li> Protokolü kaydedin. Bu protokol Ölçümleri kullanılarak diğer görüntülere yeniden uygulanabilir&gt; protokol komutunu geri yükleyin. </li><li> Bir ölçümler öğe oluşturun (Ölçümler&gt; Ölçüm Item). Veri analizi kullanılarak analiz edilebilirfonksiyonlar. <ol><li> Ölçümler kalemindeki analiz sekmesine gidin. Analiz menüsüne gidin (Analiz&gt; Analiz) ve sfero kenarına (yeşil veya sarı kırmızı) hücre sentroidinden, sayı ile özetlenmiş ve nüfus tarafından düzenlenen minimum mesafeyi analiz. </li><li> Kenarından belirli bir mesafede bulunan hücrelerin sayısını saymak için bir filtre (Analiz&gt; Filtre) oluşturmak. Şekil 2&#39;de asgari mesafe için filtre (örn asgari mesafe 80 &quot;dış&quot; nüfus verir az olduğu) Hoechst penetrasyon dayanmaktadır. Alternatif olarak, daha fazla analiz için bir elektronik tabloya ihracat ham veri. </li></ol></li></ol>

<ol><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Melanoma+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Healthcare%22%5BJournal%5D)">Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo.</a> Healthcare. 2, 27-46 (2014).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Reid, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+multicellular+tumor+spheroid+models+for+high-content+imaging+and+screening+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+chemical+genomics+and+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery.</a> Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth%2C+invasion%2C+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+cell+%26+melanoma+research%22%5BJournal%5D)">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).</li>
<li>Lucas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NOXA+and+MCL-1+as+a+strategy+for+sensitizing+melanoma+cells+to+the+BH3-mimetic+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+model+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology+%3A+journal+of+immunopathology%2C+molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid model in tumor biology.</a> Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tumour+heterogeneity+in+melanoma+therapy%3A+how+do+we+address+this+in+a+novel+model+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Manag%22%5BJournal%5D)">Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system?</a> Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncology%2Fhematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulated+expression+of+zonula+occludens+protein-1+in+human+melanoma+associates+with+N-cadherin+and+contributes+to+invasion+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion.</a> The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).</li>
<li>Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glutamine+transport+to+suppress+melanoma+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer.+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth.</a> International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell division. 6, 22(2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+deep+imaging+of+live+cellular+spheroids+with+light-sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy.</a> Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).</li>
<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer yayın maliyetlerine katkıda bulundu.

Yarı otomatik bir görüntü analiz sferoid iç G1 tutuklandı bölgeyi tanımladık ve dış tabakalar çoğalan. Bu yöntem, bir optik bölümünde kullanılarak canlı küremsiler de kullanılabilir, ya da sabit küremsi bölümlerde, bu farklı bölgelerde hücre döngüsü, ancak (immünofloresan ile) belirteç ekspresyonu, hücre ölümü veya hücre morfolojisi, sadece değişiklikleri tespit etmek. Farklı sfero bölgeler içinde hücre motilitesi de sayısal olabilir - hücre izleme görüntü analizi aşaması ile birlikte canlı konfokal zaman atlamalı görün...

Çok hücreli 3D sferoidler ancak birçok katı kanser için bir in vitro model olarak daha yaygın hale gelmiş ancak son zamanlarda, on bir tümör modeli olarak bilinmektedir. Bunlar giderek daha karmaşık, pahalı ve zaman alıcı in vivo modellerde ve basit, düşük maliyetli 2D tek tabakalı modeli 1-6 arasında bir ara ürün olarak yüksek verimli ilaç keşif ekranlarında kullanılmaktadır. 2B kültüründe çalışmalar genellikle in vivo olarak çoğaltılması mümkün değildir. Birçok kanser tiplerinin Sferoid modelleri büyüme karakteristiklerine, ilaç duyarlılığı, ilaç nüfuzu, hücre-hücre etkileşimi, katı tümörler 6-11, in vivo görülür oksijen ve besin maddeleri ve nekroz gelişiminin kısıtlı durumu taklit etmek mümkündür. Sferoidler sfero 7 periferisinde bir nekrotik çekirdeği, bu çekirdeği soran sakin ya da G1 tutuklandı bölge ve çoğalan hücreleri geliştirme. Bu bölgelerin gelişimiHücre yoğunluğu, proliferasyon hızı ve küremsi 12 boyutuna bağlı olarak değişebilir. Bu farklı alt bölgelerde görülen hücresel heterojenite kanser tedavisi direnci 13,14 katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür. Bu nedenle, bu bölgelerdeki hücrelerin analiz yeteneği ayrı anlayış tümör ilaç yanıtları için çok önemlidir. Hücre döngüsünün 15 farklı aşamalarında bozulmuş olan Cdt1 ve geminin floresan etiketleme, - ve yeşil (AG Azami Green) - floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (Fucci) sistemi kırmızı (KO Kusabira Turuncu) dayanmaktadır. Böylece hücre çekirdekleri erken S sarı, G1 kırmızı ve S / G2 / M fazında yeşil görünür. Biz burada iki tamamlayıcı yöntemler tarif hem hücreler G1 tutuklandı merkezi veya dış proliferatin ikamet olup olmadığını belirlemek için görüntüleme yazılımı veya tahlil sitometri bir boya difüzyon akışı kullanımı ile birlikte, hücre döngüsünü belirlemek için Fucci kullanarakg halkası ve sfero kenarından tek tek hücrelerin mesafe. Ve / veya hedeflenen terapilerin mevcudiyetinde uzun bir süre için durması G1 kalması mümkün ve yeniden olabilir Bu yöntemler, biz sfero merkezinde hipoksik bölgelerinde bu melanoma hücreleri göstermiştir önceki yayında, geliştirilmiştir daha elverişli şartlar ortaya çıktığında 7 hücre döngüsü girin.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agaroz düşük erime noktası</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Asil agar&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>Sferoidler</td></tr><tr><td>için agaroz yapmak için</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Sferoidler yapmak için</td></tr><tr><td>%0,05 tripsin/EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>%10 formalin</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>DİKKAT: Zararlı, aşındırıcı. Kişisel Koruyucu Ekipman Kullanın, yapın &nbsp; nefes dumanı değil (bir duman dolabında açın).</td></tr><tr>IR <td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>vibratom</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coulture cup</td> yakınında canlı/ölü <td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Sferoidleri kesit almak için kalıp</td></tr><tr><td>hemositometre</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz</td><td>Sigma</td><td>C5138&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi analizörü</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Flow sitometri yazılımı</td></tr><tr><td>Vakum gresi</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarlar</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (ticari yapılar)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Yalnızca geçici transfeksiyon</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 & # 956; m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı 5 ml tüpler (steril)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı 5 ml tüpler (steril olmayan)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging- ve sitometrisi tabanlı hücre pozisyonu analizi ve 3d melanom küresellerde hücre döngüsü

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Üç boyutlu (3D) tümör sferoidleri, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürüne kıyasla, in vivo tümör mikroçevresinin daha doğru bir modeli olarak kanser araştırmalarında kullanılır. Sferoid model, hücre-hücre etkileşimi, hipoksi ve besin yoksunluğu ve ilaç penetrasyonunun etkilerini taklit edebilir. Bu modelin bir özelliği, sferoidin dış katmanlarında çoğalan hücrelere sahip, G1 tutuklanmış hücrelerden oluşan bir halka ile çevrili nekrotik bir çekirdeğin gelişmesidir. Kanser alanında ilgi çekici olan, sferoidin farklı bölgelerinin ilaç tedavilerine ve genetik veya çevresel manipülasyona nasıl tepki verdiğidir. Burada, hücrelerin hücre döngüsü durumunu melanom sferoidleri içindeki konumlarına göre karakterize etmek için ticari yazılım kullanarak sitometri ve görüntü analizi ile birlikte floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) sisteminin kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntemler, zaman içinde ve farklı koşullar altında tümör sferoidlerinin farklı alt bölgelerinde hücre döngüsü durumu, gen/protein ekspresyonu veya hücre canlılığındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.

Tümör parçacıklarının üretilmesi için çeşitli yöntemler bu protokol hücreleri agar veya agaroz 3,7,9 kültürlenir yapışmayan bir büyüme yöntemi kullanır vardır. 1 agar üzerinde 3 gün sonra, bir C8161 melanoma sfero bir örneğini göstermektedir. C8161 sferoidler 500 çaplı normal büyüklükte sferoidler oluştururlar - 600 mikron 3 gün sonra (= 565, SD = 19, n = 3 ortalama). Sferoidler oluşturacak diğer melanoma hücre hatları şunlardır: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205Lu (bu, bir ...

3D sferoidlerin iç G1 tutuklanan ve dış proliferatif bölgelerindeki hücreleri tanımlamak ve izole etmek için floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) ve görüntü analizi veya akış sitometrisi kullanarak iki tamamlayıcı yöntemi açıklıyoruz.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Bu yöntemin genel amacı, çok hücreli bir steroidden hücreleri, hücre döngüsü durumları ve steroid içindeki konumlarına göre tanımlamak, karakterize etmek ve izole etmektir. 2D hücre kültürüne kıyasla, 3D OID modeli, tümör mimarisini ve mikroçevresini taklit ederek kanserin in vivo biyolojisini yeniden oluşturur. Sferoidlerin akış sitometrisi ve görüntüleme teknikleriyle eşleştirilmesi sayesinde bu yöntem, tümör mikroçevresinin ilaç hassasiyetini, hücre hareketliliğini ve proliferasyonunu nasıl değiştirdiği gibi kanser alanındaki temel sorulara yanıt verebilir.Bu yöntemin temel avantajı, hücre döngüsünün gerçek zamanlı görselleştirilmesine olanak tanıması ve belirli bir steroid bölgesinden canlı hücrelerin saflaştırılmasına izin vermesidir; prosedür, laboratuvarımızdan bir araştırma asistanı tarafından gerçekleştirilecektir. 100 mililitre Hank's dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içerisinde %1,5 agarı mikrodalga fırında ısıtarak 3B steroid oluşumu için hazırlıklara başlayın; agarın tamamen çözündüğünden emin olmak için erlenmeyi üç ila beş dakika boyunca aralıklı olarak çalkalayın. Ardından, agar çözeltisinden 100 µL'yi düz tabanlı 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna hemen pipetleyin. Agarın katılaşması için plağı bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.Ardından, FCI konstrüktlarını eksprese eden melanoma hücrelerinden oluşan %80 konfluensli bir hücre kültürünü hücre inkübatöründen çıkarın. Hücreleri 10 milliliters HBSS ile yıkayın. 1.5 milliliters %0.05 EDTA ekleyin ve ardından hücreleri yaklaşık iki dakika boyunca 37 degrees Celsius'de inkübe edin.Hücreler ayrıldıktan sonra, onları 10 mililitre hücre kültürü ortamında süspande edin. Bir hemositometre ve ters mikroskop kullanarak hücreleri manuel olarak sayın ve hücre kültürü ortamında mililitre başına 25.000 hücre olacak şekilde seyreltin. Ardından, 96 kuyucuklu aros plakasının her bir kuyucuğunun üzerini örtmek için 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu pipetleyin.Hücre sferoitlerinin oluşması için plakayı yaklaşık üç gün boyunca 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. İnkübasyonun ardından sferoitleri, bir Forex objektif ve faz kontrast filtresi kullanarak ters mikroskop altında görüntüleyin. Hücre sferoitlerini kesme ve görüntüleme işlemine hazırlamak için sferoitlerin kompakt, yaklaşık küresel hücre agregatları şeklinde görünmesi gerekir.Bunları bir falcon tüpüne aktarmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Ardından, steroidin konik tabanda çökmesini bekleyin. Sonra, besiyerini vakumla uzaklaştırın ve sferoidleri oda sıcaklığında en az iki saat boyunca %10 nötr tamponlu formalinde inkübe ederek sabitleyin.Hücre kesit alma ve görüntüleme işlemlerinin ardından SP, dört derece santigrat sıcaklıkta HBSS içinde birkaç gün boyunca saklanabilir. Görüntü analiz yazılımını açın ve yalnızca nicelleştirme (quantitation only) konfigürasyonunu seçin. Ardından yeni bir kütüphane oluşturun ve ham veri dosyasını kütüphaneye sürükleyerek sferoid konfokal görüntü dosyasını içe aktarın.Ardından, protokol penceresine komutları doğru sırayla sürükleyip bırakarak bir görüntü analiz protokolü oluşturmak için ölçümler sekmesine gidin. Yeşil kanaldaki nesneleri bulmak için, bulma bölümünden nesneleri bul komutunu protokol penceresine sürükleyip bırakın ve uygun kanalı seçin. İşleme altında bulunan bir aç komutu ekleyin ve ardından hücreleri ayırmak için ayrı bir temas eden nesneler komutu ekleyin.Son olarak, filtreleme bölümünden boyuta göre nesne ekleyin ve hariç tutun. Küçük hücre dışı nesneleri hariç tutmak için 50 micrometers'dan küçük nesneler komutunu verin. Ardından, protokol penceresine yeni bir nesne bulma (find objects) komutunu sürükleyip bırakın.Aynı adımları takip ederek kırmızı kanalı seçin ve sonraki tüm komutları uygulayın. Nesneler bulunduktan sonra, kırmızı ve yeşil nesnelerin kırmızı ve yeşil çekirdeklere karşılık geldiğini görsel olarak doğrulamak için kanalı gizle veya kanalı göster komutlarını kullanın. Gerekirse, nesne maskelerinin görünümünü değiştirmek için ölçümler ve ardından geri bildirim seçeneklerine tıklayın.Şimdi, erken S-fazı hücrelerine karşılık gelen sarı nesneleri bulmak için, birleştirme (combining) bölümünde bulunan intersect komutunu kullanın ve kırmızı nesneleri yeşil nesnelerle kesiştirme (intersect red objects with green objects) seçeneğini belirleyin. Yine, boyutu 50 micrometers'dan küçük olan nesneleri hariç tutun. G1 fazı hücrelerini tanımlamak için, birleştirme bölümündeki subtract komutunu kullanın ve yalnızca kırmızı nesneleri bulmak için kırmızı nesnelerden sarı nesneleri çıkarma (subtract yellow object from red objects) seçeneğini belirleyin.Benzer şekilde, hem sadece kırmızı hem de sadece yeşil olan nesneler için SG iki ve MPH fazı hücreleriyle ilişkili olan sadece yeşil nesneleri belirlemek amacıyla, yeşil nesnelerden sarı nesneleri çıkarın. Filtreleme bölümünden 0.25'ten büyük bir şekil faktörüne sahip bir popülasyon filtresi komutu uygulayarak, gerektiğinde hücresel olmayan nesneleri kaldırın. Ardından S sferoid ana hattını bulun.Yeşil veya kırmızı kanaldan herhangi birini kullanarak bulma bölümündeki nesneleri bul (find objects) komutunu kullanın. Münferit hücreleri tek bir nesne haline getirmek için işleme bölümündeki kapat (closed) komutunu kullanın. Ardından, küre içindeki boşlukları doldurmak için nesnelerde boşlukları doldur (fill holes in objects) komutunu ekleyin.Ardından, Sphero nesnesindeki gürültüyü gidermek için ince bir filtre kullanın. 30.000 µm'den küçük nesneleri temizlemek için boyuta göre nesneleri hariç tut seçeneğini belirleyerek sferoid ana hattının tespitini tamamlayın. Tüm nesneler tanımlandıktan sonra, her bir OID'nin S sferoid ana hattının kenarına olan uzaklığını belirlemek için ilgili bölümden uzaklıkları ölç seçeneğini ekleyin.Bunu sarı, sadece kırmızı ve sadece yeşil popülasyonların her birinde gerçekleştirin. Hücreden en yakın S sferoid kenarına olan minimum mesafeleri görselleştirmek için ölçümler sekmesini açın ve geri bildirim seçeneklerini, ardından ilişkileri seçin. Daha sonra mesafeleri göster seçeneğini belirleyin.Son olarak, protokol tarafından oluşturulan verileri kaydetmek için protokolü kaydedin. Ölçüm bölümünden ölçüm yap öğesini seçin. Ardından verileri yorumlamak için ölçüm öğesini seçin, ölçüm bölümündeki analiz sekmesine gidin ve steroid kenarından belirli bir uzaklıkta bulunan hücreleri saymak için analiz menüsü altından Analiz et'i seçin.Analiz sekmesinden filtreyi seçerek bir filtre oluşturun. Örneğin, yalnızca küre kenarına olan uzaklığın 100 mikron'dan az olduğu verileri gösterin. Ham verileri dışa aktarmak için dosya sekmesinden dışa aktar seçeneğini belirleyin ve ardından verileri virgülle ayrılmış veya sekme ile sınırlandırılmış metin olarak kaydedin.Bu veriler, daha detaylı analizler için bir hesap tablosu programında açılabilir. C 8 1 16 1'den üretilen hücre küreleri. Fuji sistemi ile transduksiyonu yapılmış insan melanoma hücreleri fikse edilmiş ve kesitleri alınmıştır.Hücre döngüsünün G2 M evresindeki hücreleri işaretleyen AZA green ve G1 evresindeki hücreleri işaretleyen Berra orange için konfokal görüntüleme gerçekleştirilmiştir. Bu görüntüler üst üste bindirildiğinde, beklendiği gibi nekrotik çekirdek gibi temel özellikler gözlemlenebilmektedir. Kırmızı G1 fazında duraklamış hücreler bu nekrotik çekirdeğe daha yakın bölgelerde baskınken, kırmızı ve yeşil proliferasyon gösteren hücreler, steroidin dış kenarına doğru, oksijen ve besin maddelerine erişimin en yüksek olduğu yönde gradyan şeklinde artış göstermektedir.Yarı otomatik görüntü analizinin ardından, fucci hücre maskeleri ve S sferoid ana hattı tanımlanabilir. S sferoidinin iç veya dış bölgesindeki kırmızı ve yeşil hücreleri nicelleştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılmıştır. Bu analiz, G1 fazında duraksamış hücrelerin iç bölgede zenginleştiğini, çoğalan hücrelerin ise sferoid kenarına daha yakın bölgelerde baskın olduğunu göstermiştir.Bu teknik bir kez kavrandığında, steroidin büyütülmesi, görüntüleme ve analiz süreçlerini içeren toplam bir ila iki haftalık bir süre içinde tamamlanabilir. Bu prosedürlerin ardından organoidler kollajen matrise implante edilebilir ve ardından TimeLapse mikroskobu aracılığıyla görüntülenabilirler. Daha sonra protein veya RNA analizine tabi tutulabilirler; bu da steroid içindeki konumun, oksijen ve besinlere erişimin kanser hücresi fenotiplerini değiştirip değiştiremeyeceği gibi soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir.

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Burada, biz mevcut her iki mimari beyannamedir bir 3D organotypic Melanom küresel Cilt modeli oluşturmak için bir protokol ve bir organ/tümör vivo içinde ama aynı zamanda çok hücreli karmaşıklık barındırır sistematik deneysel müdahale.

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Tümör hücreleri ve stromal fibroblastların heterotipik etkileşimine dayanan üç boyutlu yeni bir küresel model oluşturulmuştur. Burada, spheroidlerin oluşumunu görselleştirmek için tümör hücreleri ve stromal fibroblastlar, hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskopi ortak kültürünü satıyoruz. Bu üç boyutlu model tümör-stroma etkileşimleri ve test kanser terapötik çalışma için ilgili bir platform sunuyor.

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Burada bir küresel görüntüleme cihazının üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu cihaz kanser hücre sferoidlerinin dinamik veya boyuna floresan görüntülemesini sağlar. Protokol ayrıca kanser hücre invazyonunun analizi için basit bir görüntü işleme prosedürü sunmaktadır.

3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

Tümör sferoidleri, tümör hücresi-mikroçevre etkileşimlerini ve tedavi yanıtını değerlendirmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Mevcut protokol, hızlı optik temizleme kullanarak 3D tümör sferoidlerinin yarı yüksek verimli görüntülenmesi için sağlam ama basit bir yöntemi tanımlamaktadır.

Tümör Sferoidlerinin Yarı Yüksek Verimli Analizi için Hızlı Optik Temizleme

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Keşfedin, 3D melanom kürelerinde FUCCI kullanarak hücre döngüsü durumunu görüntüleme ve akış sitometrisi ile hücre izolasyonu yöntemlerini. Bu teknik, tümör mikroçevresinin kanser hücre davranışı üzerindeki etkisini incelemek için canlı hücreleri gerçek zamanlı analiz etme olanağı sunar.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Daha fazla video keşfet