HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, HIV virotoksini tat'e uzun süreli maruz kalma sonrası kortikal kılcal damar ağlarındaki değişimleri nicelendirmektir. Bu yöntem, HIV ile ilişkili nörokognitif bozuklukların patogenezine katkıda bulunabilecek kortikal kılcal damar morfolojisindeki temel değişimlerin incelenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla kılcal damar morfolojik parametresinin fizyolojik olarak doğru bir şekilde nicelendirilmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların patogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, Alzheimer hastalığı gibi vasküler değişikliklerin meydana geldiği diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu prosedüre, anestezi uygulanmış bir farenin gözlerine yapay gözyaşı jeli sürerek başlayın.

Ardından, elektrikli bir tıraş makinesi kullanarak hayvanın başını tıraş edin. Daha sonra, kafa derisini sterilize etmek için povidon iyot solüsyonu uygulayın ve kurumasını bekleyin. Bir ışık mikroskobu altında, paryetal kemikleri, kaudal frontal kemikleri ve bregma noktasını tamamen açığa çıkarmak için hayvanın kafa derisini kaldırın.

Membranın kolayca çıkarılabilmesi için kurutmak amacıyla, kafatasına düşük miktarda yüzde on'luk ferrik klorür çözeltisi uygulayın. Ardından, kafatasını pensle nazikçe kazıyarak kuruyan membranı çıkarın. Daha sonra, kafa plakası penceresinin etrafına ince bir katman yapıştırıcı sürün.

İlgi alanını pencerenin merkezinde tutmak için baş plakasını farenin kafatasına nazikçe bastırın. Ardından, yapıştırıcıyı polimerize etmek için baş plakasına bir damla diş çimentosu uygulayın. Sonrasında, salini tutacak bir rezervuar oluşturmak için baş plakası penceresinin kenarı boyunca ince bir yapıştırıcı tabakası sürün.

Yapıştırıcı kuruduktan sonra, kafa plakasını fare kafa plakası tertibatına vidalayın. Mikro-torp matkabına takılı bir matkap ucu kullanarak, 6,000 rpm hızında ayarlayarak kafa plakası penceresindeki tüm yapıştırıcıyı temizleyin. Fare kafatasının aşırı ısınmasını önlemek için her 10 ila 15 saniyede bir durun.

Bundan sonra, yeni bir matkap ucu kullanarak, 4,000 rpm hızına ayarlanmış bir mikro-torp matkap ile kafatasını inceltmeye başlayın. Matkabı, doğrudan aşağı doğru baskı uygulamadan kafatası üzerinde nazikçe hareket ettirin. Kafatası tamamen inceltildiğinde, fareyi tutucudan ayırın ve sırt üstü yatırın.

Medial uylukların net bir şekilde açığa çıkması için her iki arka ekstremiteyi nazikçe bantla sabitleyin. Ardından her iki medial uyluktaki tüyleri temizleyin ve uylukları povidon iyot ile kaplayarak cerrahi bölgeyi dezenfekte edin. Sonrasında, sağ medial uylukta, femoral ven ve arterin üzerindeki deriyi nazikçe kaldırın.

Cerrahi bölgeye yaklaşık üç ila beş damla %0.9 saline uygulayın. Ardından, femoral nörovasküler pakete künt diseksiyon yaparak femoral veni arterden ayırın. Şimdi, femoral arterin altına, yaklaşık bir santimetre arayla, üç santimetrelik iki adet cerrahi sütur yerleştirin.

Kateterizasyon sırasında aşırı kan kaybını önlemeye yardımcı olacak bir vasküler turnike oluşturmak için üst sütürü saat yönünde döndürün. Ardından, farenin fizyolojik parametrelerini izlemek için kateterin daha sonra yerleştirileceği femoral arterde yaylı makas kullanarak küçük bir insizyon yapın. Bu prosedürde, farenin sol uyluğun medial kısmındaki deriyi çıkarın.

Ardından, femoral veni bulun. Bir mililitrelik bir şırınga ve 30 gauge iğne kullanarak, 130 µL floresan boya çözeltisi çekin. Boyanın 100 µL'sini yavaşça femoral vene enjekte edin.

İğneyi çıkardıktan sonra, kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine sabit ve hafif bir baskı uygulayın ve boyanın dolaşması için beş dakika bekleyin. Ardından, cerrahi bölgeyi sütürlerle kapatın. Fareyi dikkatlice karnının üzerine çevirin ve fare baş plakası kemerine yerleştirin.

In vivo iki foton görüntüleme için cerrahi düzeneği iki foton mikroskobuna taşıyın ve hayvanın anestezi seviyesini koruduğunuzdan emin olun. Ardından, kafa plakası rezervuarına az miktarda %0,9 saline koyun ve mikroskop objektifini saline ile temas edecek şekilde indirin. Daha sonra, parlak alan görüntüleme objektifini kullanarak ilgilenilen bölgeyi belirleyin.

Ardından, iki foton görüntülemeye başlayın. Görüntüleme ekranında bir kılcal damar yatağı belirleyin ve optik zumu kullanarak bu alanı büyütün. İki foton görüntüleme yazılımını kullanarak kılcal damarların görüntülerini edinin.

Ex vivo iki foton görüntüleme için, başı kesilmiş farenin kafa derisinde interparietal kemiklerden frontal kemiklere kadar bir insizyon yapın. Deriyi işaret parmağı ve başparmakla kafatasının yanlarına sabitleyin, ekstra ince makası medial interparietal kemiğin altına yerleştirin ve bregma noktasının yaklaşık üç milimetre sonrasına kadar kafatasını sagital sütür boyunca kesin. Ardından, kafatasını beyinden ayırın ve beyin yüzeyindeki tüm meningesleri penset yardımıyla dikkatlice temizleyin.

Beyni kafatasından ayırmak için pensi nazikçe beynin altına kaydırın. Ardından, beyni fareler için özgü bir beyin matrisine yerleştirin ve ACSF damlalarıyla yıkayın. Sonrasında, bir milimetre kalınlığında koronal beyin kesiti alın.

Beyin kesitini, kesitin en anterior kısmı yukarı bakacak şekilde ACSF içeren konkav bir lam üzerine yerleştirin. Ardından, beyin kesitini bir lamelliyle nazikçe örtün. Lamı mikroskop tablasına aktarın ve lamelin üzerine az miktarda %0.9 saline ekleyin.

Mikroskop objektifini salin solüsyonuyla temas edene kadar indirin. Ardından, parlak alan objektifini kullanarak beynin orta hattını belirleyin. Şimdi iki foton görüntülemeye başlayın ve 25x objektifini kullanarak orta hattı yeniden tespit edin.

Bunu, koronal kesitin kortikal yüzeyindeki longitudinal fissürü arayarak gerçekleştirin. Ardından, görüntüleme ekranının sağ kenarını orta hatta yerleştirin ve görüntüleyici ekranı lateral yönde üç tam kare boyunca hareket ettirin. Kılcal damarların görüntüleme ekranında zar zor göründüğü derinliği belirleyin.

Ardından, z-yığınının üst kısmını belirlemek için odak düzlemini 20 µm daha aşağı indirin. Görüntü kalınlığını 1 µm olarak ayarlayın. Görüntüleme ekranını 100 µm aşağı indirin ve piksellerin yüzde birinden azının aşırı doygunluğa ulaştığı şekilde lazer gücünü ayarlayın.

Son olarak, z-yığınını edinin. Bu şekilde, beyin kesiti hazırlandıktan sonra, orta hattan yaklaşık 1.5 milimetre uzaklıkta bir görüntüleme alanı belirlenir. 100 mikrometrelik bir z-yığını, Amira Analiz Yazılımı'ndaki analizlerde kullanılan üç boyutlu bir görüntü oluşturur.

Kılcal damar ağı, bir kılcal damarın başlangıcına ve sonuna veya bir kılcal damarın diğerine ayrıldığı herhangi bir konuma düğümler yerleştirilerek manuel olarak izlenir. Bu işlem, morfolojik parametrelerin otomatik olarak çıkarıldığı tamamen iskeletleştirilmiş bir görüntü oluşturur. Kılcal damar düğüm sayısı, segment sayısı, ortalama segment uzunluğu ve toplam segment uzunluğu, fare beyin kesitlerinin iki fotonlu ex vivo görüntülemesi kullanılarak çıkarılabilir.

Burada, kılcal damar çapının çıkarılabildiği ve toplam kılcal damar hacminin, ex vivo görüntülemeden elde edilen kılcal damar çapı ve toplam segment uzunluğu kullanılarak hesaplanabildiği in vivo görüntüleme ile kılcal damar ağlarının iki boyutlu bir görüntüsü oluşturulur. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür doğru şekilde yürütülürse üç buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, izofluran kortikal kılcal damarlarda vazodilasyona neden olup verileri saptırabileceğinden, sabit bir anestezi seviyesini korurken hızlı hareket etmek önemlidir.

Bu prosedür sırasında, HIV ile ilişkili nörokognitif bozukluklarda ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda görülen patojenik değişikliklerin daha derinlemesine anlaşılmasını sağlayabilecek olan eritrosit hızı veya eritrosit akısı gibi diğer kapiller parametreler de elde edilebilir. Deneylerinizde başarılar dileriz.