HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Bu prosedürün genel amacı, HIV virotoksine uzun süre maruz kaldıktan sonra kortikal kılcal ağlardaki değişiklikleri ölçmektir. Bu yöntem, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların patogenezine katkıda bulunabilecek kortikal kapiller morfolojideki önemli değişikliklerin incelenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çoklu kılcal morfolojik parametrelerin fizyolojik olarak doğru bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların patogenezi hakkında fikir verebilir. Alzheimer hastalığı gibi damarsal değişikliklerin meydana geldiği diğer hastalıklara da uygulanabilir. Anestezi uygulanmış bir farenin gözlerine suni gözyaşı jeli uygulayarak bu işleme başlayın.

Ardından, elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak başını tıraş edin. Ardından, kafa derisini sterilize etmek için povidon iyot çözeltisi uygulayın ve kurumasını bekleyin. Işık mikroskobu altında, parietal kemikleri, kaudal frontal kemikleri ve bregma noktasını tamamen ortaya çıkarmak için hayvanın kafa derisini çıkarın.

Kolay çıkarılması için zarı kurutmak için kafatasına az miktarda yüzde on ferrik klorür çözeltisi uygulayın. Daha sonra, kafatasını forseps ile hafifçe kazıyarak kurumuş zarı çıkarın. Ardından, kafa plakası penceresinin etrafına ince bir yapıştırıcı tabakası sürün.

İlgilenilen alanı pencerenin ortasında tutmak için kafa plakasını farenin kafatasına hafifçe bastırın. Daha sonra, yapıştırıcıyı polimerize etmek için kafa plakasına bir damla diş çimentosu uygulayın. Ardından, tuzlu suyu tutmak için bir rezervuar oluşturmak için kafa plakası penceresinin kenarı boyunca ince bir yapıştırıcı tabakası uygulayın.

Yapıştırıcı kuruduktan sonra, kafa plakasını fare kafası plakası kablo demetine vidalayın. 6.000 rpm'ye ayarlanmış bir mikro torp matkaba bağlı bir matkap ucu kullanarak kafa plakası penceresindeki yapıştırıcıyı çıkarın. Fare kafatasının aşırı ısınmasını önlemek için her 10 ila 15 saniyede bir durun.

Bundan sonra, yeni bir matkap ucu kullanarak, 4.000 rpm'de ayarlanmış bir mikro torp matkap kullanarak kafatasını inceltmeye başlayın. Matkabı doğrudan aşağı doğru baskı yapmadan kafatası boyunca nazikçe hareket ettirin. Kafatası tamamen inceldiğinde, fareyi tutucusundan ayırın ve sırtına yerleştirin.

Medial uylukları net bir şekilde ortaya çıkarmak için her iki arka bacakta da nazikçe bantlayın. Daha sonra her iki medial uyluğun üzerindeki tüyleri çıkarın ve uylukları povidon iyot ile kaplayarak cerrahi bölgeyi dezenfekte edin. Daha sonra, medial sağ uylukta, femoral ven ve arterin üzerindeki cildi nazikçe çıkarın.

Ameliyat bölgesine yaklaşık üç ila beş damla% 0.9 salin uygulayın. Daha sonra, femoral nörovasküler demet halinde künt bir şekilde diseke ederek femoral veni arterden ayırın. Şimdi, femoral arterin altına, yaklaşık bir santimetre arayla iki adet üç santimetrelik cerrahi dikiş parçası yerleştirin.

Kateterizasyon sırasında aşırı kan kaybını önlemeye yardımcı olacak vasküler bir turnike oluşturmak için üst dikişi saat yönünde çevirin. Daha sonra, farenin fizyolojik parametrelerini izlemek için kateterin daha sonra yerleştirileceği yaylı makas kullanarak femoral arterde küçük bir kesi yapın. Bu prosedürde, farenin medial sol uyluğundaki cildi çıkarın.

Sonra, femoral veni bulun. Bir mililitrelik bir şırınga ve 30 gauge bir iğne kullanarak, 130 mikrolitre floresan boya çözeltisi hazırlayın. 100 mikrolitre boyayı yavaşça femoral ven içine enjekte edin.

İğneyi çıkardıktan sonra, herhangi bir kanamayı durdurmak ve boyanın beş dakika boyunca dolaşmasına izin vermek için enjeksiyon bölgesine sabit ve hafif bir basınç uygulayın. Daha sonra ameliyat bölgesini dikişlerle kapatın. Fareyi dikkatlice karnına çevirin ve fare kafası plakası kablo demetine yerleştirin.

İn vivo iki fotonlu görüntüleme için, cerrahi cihazı iki fotonlu mikroskobuna taşıyın ve hayvanın anestezi seviyesini koruduğunuzdan emin olun. Daha sonra, tuzlu su ile temas edecek şekilde kafa plakası rezervuarına ve alt mikroskop objektifine az miktarda %0.9 salin yerleştirin. Ardından, parlak alan görüntüleme hedefini kullanarak ilgilendiğiniz alanı bulun.

Daha sonra, iki foton görüntülemeye başlayın. Görüntüleme ekranında bir kılcal yatak bulun ve optik yakınlaştırmayı kullanarak bu alanı da büyütün. İki foton görüntüleme yazılımını kullanarak kılcal damarların görüntülerini elde edin.

Ex vivo iki foton görüntüleme için, kafa derisinde interparietal kemiklerden kafası kesilmiş farenin ön kemiklerine kadar bir kesi yapın. İşaret parmağı ve başparmak ile cildi kafatasının yanlarına sabitleyin, ekstra ince makası medial interparietal kemiğin altına yerleştirin ve kafatasını bregma noktasından yaklaşık üç milimetre sonrasına kadar sagital sütür boyunca kesin. Daha sonra, kafatasını beyinden ayırın ve forseps ile beynin yüzeyindeki meninksleri dikkatlice çıkarın.

Kafatasından kurtarmak için forsepsleri beynin altına yavaşça kaydırın. Daha sonra, beyni farelere özgü bir beyin matrisine yerleştirin ve ACSF damlalarıyla yıkayın. Ardından, milimetre kalınlığında bir koronal beyin bölümünü çıkarın.

Beyin bölümünü, bölümün en ön kısmı yukarı bakacak şekilde ACSF içeren içbükey bir cam slayt üzerine yerleştirin. Ardından beyin dilimini bir cam kapak kılıfı ile nazikçe kapatın. Slaytı mikroskop aşamasına aktarın ve kapak fişine az miktarda %0,9 salin yerleştirin.

Mikroskop objektifini tuzlu su ile temas edene kadar indirin. Ardından, parlak alan hedefini kullanarak beynin orta çizgisini bulun. Şimdi, iki foton görüntülemeye başlayın ve 25x objektifi kullanarak orta çizgiyi tekrar bulun.

Bunu, koronal bölümün kortikal yüzeyindeki uzunlamasına fissürü arayarak gerçekleştirin. Ardından, görüntüleme ekranının sağ kenarını orta çizgiye yerleştirin ve görüntüleyici ekranını üç tam kare üzerinde yanlamasına hareket ettirin. Kılcal damarların görüntüleme ekranında zar zor göründüğü derinliği bulun.

Ardından, z yığınının üst kısmını belirlemek için odak düzlemini 20 mikrometre daha alçaltın. Görüntü kalınlığını bir mikrometreye ayarlayın. Görüntüleme ekranını 100 mikrometre kadar indirin ve lazer gücünü, piksellerin yüzde birinden daha azı aşırı doygun olacak şekilde ayarlayın.

Son olarak, z-stack'i edinin. Bu şekilde beyin dilimi hazırlandıktan sonra orta hattan yaklaşık 1,5 milimetre uzaklıkta bir görüntüleme alanı yer almaktadır. 100 mikrometrelik bir z-yığını, Amira Analitik Yazılımında analiz için kullanılan üç boyutlu bir görüntü üretir.

Kılcal ağ daha sonra bir kılcal damarın başına ve sonuna veya bir kılıcın diğerine dallandığı herhangi bir yere düğümler yerleştirilerek manuel olarak izlenir. Bu, morfolojik parametrelerin otomatik olarak çıkarıldığı tamamen iskeletleştirilmiş bir görüntü üretir. Kılcal düğümlerin sayısı, segmentler, ortalama segment uzunluğu ve toplam segment uzunluğu, fare beyin dilimlerinin iki foton ex vivo görüntülemesi kullanılarak çıkarılabilir.

Burada, kılcal damar ağlarının iki boyutlu bir görüntüsü, kılcal çapın çıkarılabildiği ve kılcal çap ve ex vivo görüntülemeden elde edilen toplam segment uzunluğu kullanılarak toplam kılcal damar hacminin hesaplanabildiği in vivo görüntüleme ile üretilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa üç buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, izofluran kortikal kılcal damarların vazodilatasyonuna neden olabileceğinden ve böylece verileri çarpıtabileceğinden, sabit bir anestezi seviyesini korurken hızlı hareket etmek önemlidir.

Bu prosedür sırasında, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozukluklarda ve diğer nörodejeneratif hastalıklarda görülen patojenik değişikliklerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilen kırmızı kan hücresi hızı veya kırmızı kan hücresi akısı gibi diğer kılcal parametreler elde edilebilir. Deneylerinizde iyi şanslar.