Name: HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Keşfedin fare modelinde iki foton mikroskopi kullanarak serebral vasküler mimariyi nicelendirme yöntemini. Bu teknik, HIV kaynaklı nöroinflamasyonda kortikal kapiller ağlardaki değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokolün tamamlanması boyunca teknik tavsiyeleri için Rochester Üniversitesi Multifoton Çekirdeği'nden Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan ve Dr. Linda Callahan'a teşekkür ederiz. Ayrıca, uzman istatistiksel tavsiyeleri için Dr. Changyong Feng'e ve bu yazıda kullanılan başlık plakası tasarımı için Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Dr. Maiken Nedergaard'a teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) T32GM007356 ve R01DA026325 hibelerle desteklenmiştir; ve Rochester Üniversitesi AIDS Araştırma Merkezi hibe P30AI078498 (NIH) tarafından.

Hayvan Kaynakları Rochester Üniversitesi Komitesi Üniversitesi Bu yazıda yapılan tüm işlemleri onayladı. 1. Ön cerrahi hazırlanması (ve fare) <ol><li> Gerekli tüm ekipman ile cerrahi alan hazırlayın. Önceden% 70 etanol kullanılarak işlem sırasında kullanılan tüm araçları sterilize edin. İsteğe bağlı olarak, bir cam boncuk sterilizatör kullanın veya araçları sterilize etmek otoklav. </li><li> Bir izofluran buharlaştırıcı bağlı bir izofluran indüksiyon odasında fare yerleştirin. 1 L / dakikalık bir hızda 4% izofluran seviyelerini ayarlayın. Not: astrosit-özgü glial fibriler protein (GFAP) promoteri (HIV Tat-Tg fareleri) ile tahrik edilen bir doksisiklin (DOX) uyarılabilir HIV-1 Tat transgen, burada bildirilen deneylerde, fareler için 10 HIV etkisini incelemek için kullanılmıştır Daha önce tarif edildiği gibi 7,10 -1, serebral vasküler yapısı üzerinde nöro-inflamasyonu neden olmuştur. </li><li> Yavaşça ve fare gözlemlemek için indüksiyon odasına ipucu# 39; ın düzeltilmesi refleks. Düzeltilmesi refleks bastırılmış edildikten sonra,% 2 izofluran düzeyini ayarlamak ve cerrahi tezgah burun konisi indüksiyon odasından hava akışını yönlendirmek. </li><li> Hızla su infüzyon ısıtma pedi indüksiyon odasından fareyi hareket ettirin. Burun konisi ile izofluran (% 1.5-2) uygulanmaya devam. Solunum hızı (RR) izleme yoluyla değerlendirilen bireysel fare toleransına göre anestezi ayarlayın. Not: RR depresyon serebral kan akımı ve damar çapı değerlendirmesini değiştirerek fizyolojik gaz parametrelerini perturb olabilir. Dakikada 55-65 nefes arasında RR tutmaya çalışın. Kalp atım hızı (KAH), aynı zamanda anestezi derinliği değerlendirmek kullanılabilir; damar çapı fizyolojik değişiklikleri önlemek için dakikada 300-450 atım arasında HR tutun. Tipik olarak, anestezi verilen bir fare 1 L / dk 1.5-2.0 izofluran% arasında yeterli olacaktır. </li><li> Ayrıca anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak tutam gerçekleştirin. Fare, iletişimi yanıt vermezsecerrahi girişim rüler. </li></ol> İnce kafatası Kranial Window 2. Hazırlık <ol><li> Fare gözlerine yapay gözyaşı jeli uygulayın. Tamamen makas veya elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare derisi saç kaldırmak. </li><li> Povidon-iyot çözeltisi uygulayarak saç derisini sterilize; kurumasını bekleyin. Sonra, bir ışık mikroskobu altında, tamamen parietal kemikler işaretleme, kuyruk frontal kemik ve Bregma açığa fare derisi deri kaldırmak. </li><li> Kolay çıkartılması için membranlar kurutmak için kafatasına% 10 ferrik klorür solüsyonu az miktarda uygulanır. Yavaşça kafatası kazıyarak # 5/45 forseps ile kurutulmuş membranlar çıkarın. </li><li> Headplate pencerenin etrafında tutkal ince bir tabaka sürün. Yavaşça pencereye merkezindeki ilgi alanı tutmak, fare kafatası karşı headplate basın. Tutkal polimerize etmek headplate dental çimento bir damla uygulanır. </li><li> Ince bir tabaka sürünheadplate penceresinin kenarında tutkal tuzlu tutmak için bir rezervuar oluşturmak için. Tutkal kuruduktan sonra, fare headplate koşum içine headplate vida. Not: Bu prosedürde kullanılan fare headplate kablo demeti, bir metal taban ve iki metal sütunlu bir yapıdır. Her sütunda bir bahar ve bir kanat somun var. Headplate bahar üstüne yerleştirilir ve baş seviyesi ve hareket etmiyor kadar kanat somun sıkılır. </li><li> 6000 rpm&#39;de Microtorque matkap bağlanmış bir matkap ucu ile headplate penceresinden herhangi bir tutkal çıkarın. Gemilere yapısal hasarlara neden olabilir fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için her 10-15 saniyede durdurun. <ol><li> Yeni bir matkap ucu yardımıyla, orta hatta (headplate penceresinin çapının üçte biri) yanal olarak Microtorque matkap 1,5 mm yerleştirin. 4000 rpm&#39;de ince bu konum etrafında kafatası başlayın. Doğrudan aşağı yönlü baskı ile kafatası arasında hafifçe matkabı hareket ettirin. </li><li> Kes drilling her 10-15 sn fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için. Bu süre zarfında, bir sıkıştırılmış hava spreyi kullanarak birikmiş kafatası tozu temizleyin. </li><li> 5-10 saniye kafatası soğumaya RT tuzlu su damla. Yavaşça kafatası inceltme devam etmek yumuşak bir doku ile tüm sıvıyı çıkarın. </li></ol></li><li> Kafatasının son incelme için, headplate haznesindeki tuzlu küçük bir hacim yerleştirin ve hafifçe küçük damarlar açıkça görülebilir kadar ilgi alanı üzerinde diş MicroBlade süpürün. </li></ol> Fizyolojik Parametrelerinin 3. İzleme <ol><li> Kafatası tamamen inceltilmiş sonra, sahibinden fare ayırmak ve sırtında üzerine yerleştirin. Yavaşça açıkça medial uyluk açığa her iki arka bacaklarını aşağı bantlayın. </li><li> Makas veya elektrikli tıraş makinesi ile hem medial uyluk üzerinde saç çıkarın. Povidon-iyot ile uyluk kapsayan cerrahi siteyi dezenfekte edin. </li><li> Femoral ven üzerinde medial sağ uyluk cilt üzerinde Pinchve arter 5. forseps kullanarak. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın. Not: Sol uyluk cerrahi komplikasyon (vasküler anomaliler, rüptüre damarlar) durumunda saklıdır. </li><li> Cerrahi siteye% 0,9 tuz yaklaşık 3-5 damla uygulayın. Bu damarların büyük büyütme, hem de damarların nemli sitesi tutmak ve önlenmesi kurutma sağlar. Açık açık iki # 5/45 forseps kullanılarak femoral nörovasküler demet içine diseksiyon ile arter femoral ven ayırın. </li><li> Yaklaşık 1 cm arayla femoral arter altında cerrahi sütür iki, 3 cm&#39;lik parçalar yerleştirin. Kateterizasyon sırasında aşırı kan kaybını önlemek için yardımcı olacak bir damar turnike oluşturmak için üst dikiş saat yönünde çevirin. </li><li> Yaylı makas kullanılarak femoral arter küçük bir kesi yapmak. Kateter arter içinde sıkıca kadar kesi ve peşin yoluyla arter kateteri yerleştirin. </li><li&gt; sızıntı ve uygun kateter yerleştirme değerlendirmek için üst sütür (turnike) açılmak. Sütürler kullanılarak geminin içindeki kateter etrafında iki knot bağlayarak femoral artere kateter sabitleyin. </li><li> Kan pıhtılaşmasını önlemek için kateter ile heparin 10 ul (100 lU / ml) enjekte edilir. Sonra, cerrahi basit bir kesintiye desen 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sağ uyluk kapatın. </li><li> Intraperitoneal sağ alt kadranda içine üretan 50 ul (1.2 mg / g) enjekte edilir. Beş dakika sonra intraperitonal üretan 100 ul bir toplam sol alt kadrana bir 50 ul enjeksiyon ile tekrarlayın. Eşzamanlı anestezi derinliği için fare tekrar kontrol ederken yavaşça yaklaşık% 0.25 izofluran seviyesini düşürür. Not: bağırsakları perfore kalmaması arka karın duvarı boyunca periton boşluğu içinde yüzeysel iğne tutun. Bu karın rektus mu kısma yapılabiliruzak iç organlardan ve sonra enjekte scles. </li><li> Kılcal tüp kullanarak, kateter arter kan 40 ul örnek toplamak. Bir tuzlu dolu dört yollu ve heparin şırınga ile donatılmış kan basınç dönüştürücü kateter takın. </li><li> Kateterin istenmeyen kaldırılmasını önlemek için cerrahi alete tansiyon dönüştürücüyü bantlayın. Ortalama arter basıncı izleme başlayın. </li><li> Bir kan gazı analizörü giriş portuna kan dolu kılcal tüpü yerleştirin. Tüm kan ekstre edildikten sonra, giriş portundan kılcal tüp kaldırmak. O 2 ve CO 2 kan gazları, kan gazı analizörü yazdırılan bir kağıt üzerinde görünecektir. </li></ol> Floresan Boya 4. Enjeksiyon <ol><li> 5. forseps kullanarak medial sol uyluk üzerinde cilt sıkıştırın. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın. Dekstran konjuge kırmızı yayan rhodamine boya hazırlayın(70 kDa) (serum fizyolojik içinde eritilmiş 10 mg / kg). </li><li> Femoral bağlı bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga vein.Using bulun şırınga 130 ul hattına görüntüleme için uygun bir floresan boya daha önce hazırlanan çözelti çizin. Şırınga içine tamamen boya çizim ve sıkıca şırınga duvara iterek tüm hava kabarcıklarını çıkarın. <ol><li> Viraj sert bir yüzey konik tarafı yukarı bastırarak yaklaşık 30 derecelik bir açıyla 30 G iğne. Boya ile iğne doldurun ve 100 ul örneği bırakarak, herhangi bir aşırı sıvı atın. </li></ol></li><li> Yavaş yavaş femoral ven içine boya 100 ul örneği enjekte edilir. İğneyi çıkardıktan sonra, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon siteye sürekli hafifçe baskı uygulayın. Boya 5 dakika dönmesine izin verin. Not: alternatif, sağ femoral ven başka cerrahi sitenin yaratılması yoluyla daha fazla kan kaybını önlemek için floresan boya enjeksiyon için yerine kullanılabilir. Buna ek olarak, eğerHayvan cerrahi siteden kontrolsüz kanama, bu çok fazla heparin kateteri yıkamak için verildiğini bir göstergesi olabilir. Orada 10-15 dakika içinde hiçbir pıhtılaşma ve fare kanama hala devam ediyorsa, yeni bir fare ile deney yeniden başlatmayı düşünün. </li><li> Daha sonra dikkatli bir şekilde mide üzerine fareyi çevirmek, 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sol uyluk kapatın ve fare headplate koşum içine yerleştirin. </li></ol> Vivo İki-Foton Görüntüleme 5. <ol><li> Sürekli anestezi seviyesini korumak için emin olun, iki foton mikroskop cerrahi cihazı taşıyın. Headplate rezervuar içine% 0,9 tuz az miktarda koyun ve tuzlu su ile temas, böylece mikroskop objektif indirin. Aydınlık görüntüleme objektif kullanılarak ilgi alanı bulun </li><li> Floresan boya için uygun bir dalga boyuna iki-fotonlu lazer uyarımı ayarlayın. 25x o kullanan iki foton görüntüleme başlayınbjective. Bu deneylerde 780 nm&#39;lik bir dalga boyunda heyecan bir kırmızı ışık rodamin boya konjüge edilmiş bir dekstran kullanılan unutmayın. Emisyon filtresi bandpass 607/36 bir boya floresans tespit etmek ve emisyon filtresi bandpass 480/20 arteryal otoflüoresan tespit etmek için kullanıldı </li><li> Görünümü ekranda yatak bir kılcal bulun ve iki foton görüntüleme yazılımı kullanarak kılcal damarların optik zoom 2. Edinme görüntüleri kullanarak bu bölgeyi büyütmek. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, dekapitasyon servikal dislokasyon ile fare kurban. </li></ol> 6. Ex Vivo İki Foton Görüntüleme <ol><li> Ekstra ince makas kullanarak, fare frontal kemikler interparietal kemikleri kafa derisi bir kesi yapmak. Işaretçi parmak ve başparmak ile kafatası kenarlarına cilt sabitleyin. </li><li> Medial interparietal kemik altında ekstra ince makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca kafatası kesti. Bregma işaretleme sonra yaklaşık 3 mm kafatası kesme durdurun. Not: Beyni kesilmesini önlemek için kafatası keserken yukarı yönlü baskı uygulayın. </li><li> # 5 forseps kullanarak, beyinden gelen kafatası ayırmak ve dikkatle beynin yüzeyine herhangi meninksler kaldırmak. Kalan Meninksler yanlışlıkla beyin lacerate olabilir; Aşırı bakım Bunu önlemek için alınmalıdır. Beyin kafatası boşalana kadar yavaşça yavaşça ileri ilerleyen beynin altında 5. forseps kaydırın. Not: aşağı yönlü baskı beyin delinmesiyle önlemek için kullanılması gerektiğini söyledi. </li><li> Fareler için belirli bir beyin kesit aracı beyin yerleştirin. Beynin üzerinde yapay beyin omurilik sıvısının damla uygulayarak beyin yıkayın. </li><li> Bregma bregma 0 dan beynin 2 mm koronal bölümü çıkarın -2. Yukarı bakacak 0 bregma ile yapay beyin omurilik sıvısı içeren içbükey cam slayt üzerine koronal bölümü (bölümün en kafatası parçası) yerleştirin. Yavaşça beyin sl kapakBir cam kapak slip ile buz. Not: Bu damar mimarisini deforme olabilir bir kez beyin bölümünde yer cam basarak kaçının. </li><li> Mikroskop sahneye slayt aktarın ve kapak kayma% 0,9 tuz az miktarda koyun. Bu tuzlu su ile temas edene kadar mikroskop objektif indirin. Aydınlık objektif kullanarak beynin orta hat bulun. </li><li> İki foton görüntüleme başlayın ve tekrar 25x objektif kullanarak orta hat bulun. Koronal bölümün kortikal yüzeyinde boyuna fissür arayarak bunu gerçekleştirmek. Orta hat üzerinde görüntüleme ekranın sağ kenarına yerleştirin ve yanal üç tam kare (orta hattan yaklaşık 1.5 mm) izleyici ekran üzerinde hareket. Bu deneylerde, görüntüleme parametreleri adım 5.2 not belirtilenlerle aynı olduğunu not edin. </li><li> Kılcal damarlar görünümü ekranda zorlukla görülebilir hangi derinliğe bulun. Odak ilave 20 uçağı düşürünmikron z-yığınının üst belirlemek için. </li><li> 1 mikron görüntü kalınlığı ayarlayın. 100 um için görünüm ekranı indirin ve piksel% 1&#39;den az doygun olduğu gibi boyunca lazer gücünü ayarlamak. Not: z-yığın görüntüleri 100 ardışık 500x500x1 um görüntülerin bir dizi derlenmektedir. Daha doğru post işleme hesaplamaları olacak z yığın büyük. Genellikle, 100 mm veya daha büyük bir z-yığını toplamak için çalışmayın. </li><li> Bitişik XY simgesi ardından XY tekrarlayın simgesine basın. Z-yığın tamamlandığında, Seri Bitti simgesine basın ve dosyayı kaydedin. </li></ol> 7. Veri İşleme <ol><li> ImageJ yazılım in vivo kapiler görüntüyü açın. Elle iki foton yazılımı elde edilen değerlere dayalı uzaktan oranı piksel olarak ayarlayın. <ol><li> Araçlar menüsünden * düz * simgesini seçin. Oppo bir kılcal duvardan uzanan bir çizgi çizinsitesi kılcal duvar ve ImageJ tarafından sağlanan uzunluğu kaydedin. Bu açık bir şekilde, kapiler duvarlardan kenarlarını görselleştirmek amacıyla görüntüyü yakınlaştırmak için gerekli olabileceğini not edin. </li><li> Kılcal boyunca farklı yerlerde adımı yineleyin 7.1.1, yanı sıra görüntüde birden kılcal damarlar. </li></ol></li><li> Böyle Amira gibi analitik yazılım içine z yığın dosyasını açın. Alt uygulama araç çubuğundan Filament Editör simgesini seçin <ol><li> Üst veya z-yığının altına ya yaklaşık 20 Move izleyiciyi izleyici kalınlığını ayarlayın. </li><li> İz simgesini seçin ve yüklenen görüntü üzerine imleci. Şekil 2C açıklanan yerlerde kılcal damarların yerleştirin düğümleri; segmentler otomatik komşu düğümler arasında görünecektir. Tüm z-yığınının boyunca kılcal Trace. Not: thr kılcal izlemek için uç noktaları ve şube noktaları arasında düğümleri yerleştirmek için gerekli olacaktırZ-yığın oughout. </li><li> Bu düğümler kaldırmak için, Ara Kaldır simgesini tıklatın. Not: Bu Kaldır Seçili simgesini seçerek Seç Tek simgesini kullanarak döngü seçerek ve elle kaldırılması gerekir hatalı döngüye segmentleri oluşturabilirsiniz. Döngüler izleme sırasında aynı bölgede görünmeye devam ederse, bu düğümlerin farklı kılcal damarların yerleştirildi olasıdır. </li><li> Izleme tamamlandıktan sonra, otomatik olarak ayıklanır vasküler parametreleri içeren bir elektronik tabloyu açmak için Graph Bilgisi simgesini seçin. Düğümleri ve segment sayısının ana görünümü ekranda mevcuttur. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coat+of+many+colors%3A+neuroimmune+crosstalk+in+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection.</a> Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).</li>
<li>Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+associated+dementia%3A+symptoms+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 associated dementia: symptoms and causes.</a> Retrovirology. 3, 28(2006).</li>
<li>Antinori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+research+nosology+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).</li>
<li>Clifford, D. B., Ances, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder.</a> The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).</li>
<li>Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%3A+pathogenesis+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmune+pharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities.</a> Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+production+of+IL-17A+induces+glial+activation%2C+microvascular+pathology+and+enhances+the+neuroinflammatory+response+to+systemic+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia.</a> PloS one. 8 (2), e57307(2013).</li>
<li>Silva, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+central+nervous+system+expression+of+HIV-1+Tat+leads+to+accelerated+rarefaction+of+neocortical+capillaries+and+loss+of+red+blood+cell+velocity+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity.</a> Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Bruce-Keller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+causes+rapid+increases+in+glial+activation+and+neuronal+injury+in+the+striatum+of+inducible+HIV-1+Tat+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice.</a> Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+hypercapnia+reveals+an+underlying+cerebrovascular+pathology+in+a+murine+model+for+HIV-1+associated+neuroinflammation%3A+role+of+NO-cGMP+signaling+and+normalization+by+inhibition+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterase-5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 253(2012).</li>
<li>Farber, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+and+agent-specific+dilation+of+intracerebral+microvessels+by+volatile+anesthetics+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices.</a> Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada tarif edilen yöntem, deneysel modeller / ayarları geniş bir beyin mikrovasküler yapılarını analiz etmek için uygulanabilir. Bu yöntemin başarılı olması için, üç kritik adım hakim olması gerekmektedir. İlk olarak, ince kafatası penceresi kafatası ya da altta yatan beyin zarar vermemelidir. Bu inceltme sırasında kafatası delinme ya da ısı kaynaklı damar kaçağa neden kolaydır. Floresan boya odak düzlemi içine sızabilir ve kılcal belirsiz gibi bu görüntüleme engelleyebilir. Kafatası sık ince kafatası hazırlanması sır...

İnsan Bağışıklık Yetmezliği Virüsü 1 (HIV-1) virüs enfeksiyonunun akut fazında beyni işgal ve verimli onların aktivasyon yol mikroglia ve beyin ikamet makrofajlar hem bozar - ve her iki konak kaynaklı inflamatuar mediatörlerin ve çözünür HIV-1 serbest bırakma Böyle Tat ve (1,2 gözden) gp120 olarak virotoxins. Sonuç olarak, kronik nöroenflamatuar devlet HIV-1 İlişkili Nörokognitif Bozuklukları (EL) 3-5 patogenezine katkıda düşünülmektedir MSS içinde kurulmuş olur. HIV-1 Tat veya farelerin merkezi sinir sistemi içinde, interlökin (IL) -17A arasında kronik aşırı mikrovasküler seyrelmesi 6,7 ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Bu kronik Nöroenflamasyon serebral damarlarda üzerindeki etkileri yoluyla EL patogenezine katkıda bulunabileceği ihtimalini yükseltir. Ayrıca bu soruyu incelemek için, biz serebral vasküler yapıda çalışılmıştır ölçmek için yöntemler geliştirmişlerdirtures. Bu kağıt, kademeli bir uzunluğu, toplam kademeli bir uzunluk ve ortalama kılcal çap ve ince bir kafatası kortikal pencereden kılcal ağ şebekeleri in vivo görüntüleme kullanılarak total kılcal hacmi ve ortalama kılcal düğümleri, kılcal kesimlerinin sayısı ölçülmesi için bir yöntem tarif eder (daha önce tarif edilen modifiye protokolleri) 8,9, hem de iki foton mikroskopi kullanılarak beyin bölümlerinin ex vivo görüntüleme. In vivo ince kafatası kortikal pencere serebral çevrenin korunması için izin verir çünkü beyin dilimleri kılcal ağları ex vivo görüntüleme rekonstrüksiyonu sağlarken Bu kombine yaklaşım, serebral vasküler parametrelerin bütünsel bir kantitatif sağlar üç boyutlu, tam kılcal ağ şebekeleri, - daha sonra ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak belirlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Leica Mikroskop</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Yoğunluklu Işık</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Yastığı</td><td>Stryker&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/POMPA</td><td>Gaymar Sanayi A.Ş.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 İzofluran Buharlaştırıcı</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Yapay Gözyaşı Jeli Butler</td><td>AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-İyot çözeltisi&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Bonn Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ferrik Klorür Çözeltisi</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Prizma Anında Yapıştırıcı Jel</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Dental Çimento</td><td>Çalma</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II El Aleti Kiti</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Mikro Matkap</td><td>İnce Bilim Araçları</td> için Çapak <td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Dental Microblade)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Üretan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Grup 2B Kanserojen</td></tr><tr><td>Örgülü</td><td>Sütür Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Bahar Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Arteriyel Kateter</td><td>SAI İnfüzyon Teknolojileri</td><td>MAC-01</td><td>Kateterin ucu, çapını azaltmak için manuel olarak gerildi.</td></tr><tr><td>Kan Basıncı Moniter</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Kan Basıncı Dönüştürücü ve Kablo Dünyası</td><td>Hassas Aletler</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Kan Gazı Analizörü ve nbsp;</td><td>Siemens&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; l Kılcal Boru</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-dextran (70.000 MW, tuzlu su içinde çözülmüş 10 mg / kg)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Yetişkin Fare Beyin Dilimleyici</td><td>Matrisi Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Çoklu Foton Mikroskobu</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa lazer</td><td>Spektrumları-Fizik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging'den ulaşılabilir.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hiv kaynaklı nöroinflamasyondan bir fare modeli İki foton mikroskop kullanarak serebral vasküler mimarlık niceleme

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü 1 (HIV-1) enfeksiyonu sıklıkla HIV-1 İlişkili Nörobilişsel Bozukluklar (HAND) ile sonuçlanır ve merkezi sinir sistemi (CNS) içinde kronik bir nöroinflamatuar durum ile karakterizedir, esas olarak mikroglia ve beyinde yerleşik makrofajların viral aracılı aktivasyonu tarafından yönlendirildiği düşünülmektedir. HIV-1 enfeksiyonuna ayrıca serebrovasküler kan akışındaki (CBF) değişiklikler eşlik eder, bu da HIV ile ilişkili kronik nöroinflamasyonun CBF'de ve / veya serebral vasküler mimaride değişikliklere yol açma olasılığını artırır. Bu soruyu ele almak için, HIV'in neden olduğu nöroinflamasyon için bir fare modeli kullandık ve bu enflamatuar ortama uzun süre maruz kalmanın beyin damar sistemine zarar verip vermeyeceğini ve kılcal damar ağlarının seyrekleşmesine neden olup olmayacağını test ettik. Bu yazıda, nöroinflamatuar hastalığın bir fare modelinde (HIV-1 Tat transgenik fareler) kortikal kılcal yoğunluktaki değişiklikleri ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu genelleştirilebilir yaklaşım, ince kafatası kortikal penceresinden kortikal kılcal damarların in vivo iki fotonlu görüntülemesinin yanı sıra fare beyni bölümlerindeki kortikal kılcal damarların ex vivo iki fotonlu görüntülemesini kullanır. Bu prosedürler, sırasıyla kılcal ağların görüntülerini ve z-yığın dosyalarını üretir ve bunlar daha sonra serebral vasküler mimarideki değişiklikleri değerlendirmek için kantitatif analize tabi tutulabilir.

İnce kafatası kortikal pencere kortikal kılcal damarların in vivo iki foton görüntüleme (Şekil 1) sağlar. Görüntüye uygun alan çok sayıda, farklı kılcal (Şekil 1A) gösterir. Aynı görüş alanında, herhangi bir arteryel hücre duvarı otofloresansı vardır ve ikinci harmonik üretimi 11 (Şekil 1B) ile indüklenen örneğin kolajen floresan gibi diğer floresan sinyalleri, söz konusu olabilir. <p class="jove_content" fo:keep-...

Bu makale, beyindeki vasküler mimarinin in vivo ve ex vivo iki foton mikroskobu kullanılarak ölçülebileceği bir yöntemi açıklamaktadır.

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Bu prosedürün genel amacı, HIV virotoksini tat'e uzun süreli maruz kalma sonrası kortikal kılcal damar ağlarındaki değişimleri nicelendirmektir. Bu yöntem, HIV ile ilişkili nörokognitif bozuklukların patogenezine katkıda bulunabilecek kortikal kılcal damar morfolojisindeki temel değişimlerin incelenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla kılcal damar morfolojik parametresinin fizyolojik olarak doğru bir şekilde nicelendirilmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların patogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, Alzheimer hastalığı gibi vasküler değişikliklerin meydana geldiği diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu prosedüre, anestezi uygulanmış bir farenin gözlerine yapay gözyaşı jeli sürerek başlayın.Ardından, elektrikli bir tıraş makinesi kullanarak hayvanın başını tıraş edin. Daha sonra, kafa derisini sterilize etmek için povidon iyot solüsyonu uygulayın ve kurumasını bekleyin. Bir ışık mikroskobu altında, paryetal kemikleri, kaudal frontal kemikleri ve bregma noktasını tamamen açığa çıkarmak için hayvanın kafa derisini kaldırın.Membranın kolayca çıkarılabilmesi için kurutmak amacıyla, kafatasına düşük miktarda yüzde

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem...

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Source: Nishimura, C.  ve ark. HIV Kaynaklı Nöroinflamasyonun Fare Modelinde İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Serebral Vasküler Mimarinin Ölçülmesi. J. Vis. Exp. (2016). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak fare beynindeki kortikal kılcal damarların in vivo görselleştirmesini göstermektedir. İnce kafatası kortikal pencereli anestezi uygulanmış bir fareye floresan boya enjekte etme, görüntüleme için kurulumu hazırlama ve analiz için beyin mikrovasküler yapılarının ayrıntılı görüntülerini...

 Fare Beyni Mikrovaskülatürünün İn Vivo Görüntülenmesi için İki Foton Mikroskobu 

Kaynak: Arango-Lievano, M. et. al., Serebrovasküler Sistemin Uzunlamasına İn Vivo Görüntülemesi: CNS Hastalıklarıyla İlgisi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, floresan etiketli amiloid plaklarını ve serebral vaskülatürü görselleştirmek için in vivo iki fotonlu görüntülemeyi göstermektedir. Mavi floresan plakları işaretlerken, yeşil floresan serebral kan damarlarını vurgular. İlgilenilen bölgenin 3 boyutlu haritası ve yüksek çözünürlüklü mozaik görüntüleme, amiloid plaklarının beyin damarları ile...

Alzheimer Hastalığı Fare Modelinde Serebral Damarların ve Amiloid Plaklarının İn Vivo Görüntülenmesi

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Bu protokol, farelerde geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben enfarktüs hacimlerini ve kan-beyin bariyeri bozulmasını azaltan tekrarlayan hipoksik ön koşullandırmayı veya sistemik hipoksiye kısa süreli maruziyetleri tanımlar. Ayrıca, nörovasküler korumanın etkinliğini değerlendirmek için inme sonrası enfarktüs hacminin ve kan-beyin bariyeri bozulmasının ikili miktar tayinini detaylandırır.

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Burada mikroskobu tabanlı bir protokol için yüksek çözünürlüklü görüntü ve fare üç boyutlu rekonstrüksiyon nörovasküler birim ve kan - beyin bariyerini beyin serbest yüzer bölümleri kullanarak mevcut. Bu yöntem, görselleştirme, analiz ve BBB, hücre içi organellerin miktar için sağlar.

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

Bu makalenin amacı mikro bilgisayarlı tomografi ve serebral vasospasm ölçmek için kullanılan tüm gemi parçaları hacimleri belirlenmesi sonra farelerde serebrovasküler ağaç 3 boyutlu rekonstrüksiyon sağlayan bir yöntem sunmaktır fare modelleri subaraknoid kanama.

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Keşfedin fare modelinde iki foton mikroskopi kullanarak serebral vasküler mimariyi nicelendirme yöntemini. Bu teknik, HIV kaynaklı nöroinflamasyonda kortikal kapiller ağlardaki değişiklikleri incelemeye yardımcı olur.

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Daha fazla video keşfet