Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, yığın mikrosirkülasyonundaki hemodinamik ve inflamatuar belirteçlerdeki dinamik değişikliklerin uzun süreler boyunca izlenmesine izin veren intravital mikroskopi ile fare beynindeki mikrosirkülasyonu incelemektir. Bu teknik, birçok çalışma türü için kullanıldığı La Jolla Biyomühendislik Enstitüsü'nde geliştirilmiştir. Örneğin, plasmodium burgi onca enfeksiyonunun seyri sırasında ve serebral sıtmanın ekspresyonu sırasında hemodinamik değişikliklerin takibi.

Bu, intravital mikroskopi çalışmalarından iki hafta önce ilk olarak kronik bir kraniyal pencerenin implante edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, düşük büyütmede yüksek çözünürlüklü bir dijital görüntü kullanarak kraniyal pencerenin genel morfolojisini kaydetmektir. Prosedürün üçüncü adımı, konvansiyonel ve floresan aydınlatma kullanarak intravital mikroskopi görüntüleri elde etmek ve damar çapı ve RBC hızının çevrimiçi ölçümleri için özel çalışma alanlarını seçmektir.

İşlemin son adımı, floresan işaretli spesifik antikorlar aracılığıyla kazık damarlarındaki lökosit ve trombosit aderansının intravital analizini yapmaktır. Sonuç olarak, bu koşullarla ilişkili hemodinamik değişiklikleri belirlemek için beyin intravital mikroskobu yoluyla fizyolojik patofizyolojik veya hastalıklı durumların serebral aynalama modellerinde in vivo, mikro dolaşım değişikliklerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, beyni dış etkenlere veya yapay ortama maruz bırakmadan fizyolojik ortamında gözlemlememizdir: intravital mikroskopi, görüntü, manyetik rezonans ve anjiyografiye kıyasla uzamsal ve zamansal çözünürlüklere sahip olması ve mikroskobik seviyeden mikroskobik seviyeye bakmamıza izin vermesidir.

Bu yöntem, intravital mikroskopiden iki ila üç hafta önce akut ve kronik hastalık sırasında hemodinamik ve inflamatuar değişiklik gibi beyin mikrosirkülasyonunun fizyolojisi ve patofizyolojisindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Sekiz ila 10 haftalık farelerde bir kraniyotomi yapılır, ancak hayvanın kafasına bir titanyum çubuk yerleştirilmediği daha önce gösterilmiştir. Kronik kraniyal pencere, deney günü implante edildikten aylar sonra bile kazık mikrosirkülasyonunun incelenmesine izin veren stabil bir preparattır.

İlk olarak, hayvanı farenin kuyruk damarından önceden hazırlanmış floresan etiketli eritrositlerle infüze edilmiş stereotaksik bir çerçeveye yerleştirmeden önce hayvanın vücut ısısını kontrol edin. Bu, daha sonra gösterilecek olan eritrosit takibini mümkün kılacaktır. Daha sonra fareyi flor ile hafifçe uyuşturun.

İndüksiyon için %4, bakım için bir ila %2. Daha sonra, hayvanı bir ısıtma yastığı üzerindeki stereotaksik bir çerçeveye yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Kulak çubuklarını kullanarak kafayı dikkatlice sabitleyin ve sağ ve sol kolları kullanarak seviyeyi ayarlayın.

Kraniyal penceredeki kapak sürgüsünü mineral yağ ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin. Daha sonra bir dijital kameraya bağlı bir stereo mikroskop kullanarak, pencerenin altındaki gemilerin birkaç panoramik fotoğrafını çekin. Panoramik fotoğrafları bir bilgisayara aktardıktan sonra, yazdırılacak, tanımlanacak ve tarih atılacak en iyisini seçin.

Bu fotoğraf, damar çapı ve kırmızı kan hücresi hızlarının ölçümleri için bir harita olarak kullanılacak ve intra vital mikroskopiye başlamak için daha sonra gösterilecektir. Fareyi özelleştirilmiş bir intravital mikroskop aşamasına aktarın. Diş akriliği tarafından oluşturulan kuyudan yararlanarak kraniyal pencereye bir damla su koyun.

Sayısal açıklığı 0,5 olan 20 x suya daldırma objektifi kullanılır. Görüntüler iki kamera, bir bilgisayara ve monitöre bağlı bir dijital düşük ışık, yüksek hızlı kamera ve bir VCR Bandına bağlı düşük ışıklı bir analog kamera, bir zaman damgası ve bir renkli monitör kullanılarak kaydedilir Ölçüm için damarları seçmeden önce, preparatın kalitesini değerlendirmek için damarları kontrol edin ve tüm damarlarda kan akıp akmadığını kontrol edin, Ardından ölçülecek kapları seçin. Farklı çaplarda mekanları ve arterleri içermeli ve pencerenin açığa çıkardığı alan içinde farklı yerleri kapsamalıdır.

Deneyimizde, kafatası penceresindeki çeşitli alanları görüntülerken ölçüm için 12 damar seçiyoruz. Damarları seçmek için, her nokta için daha önce çekilmiş olan PY damar sisteminin fotoğrafında ölçülecek her noktanın kesin konumunu açıklayın, damar çapı bir görüntü kesme cihazı kullanılarak ölçülür. Nokta seçildikten sonra, teknenin görüntüsü dikey konumda hizalanır ve görüntü tam tersi olana kadar kesilir.

Aşırılıklar hizalanır ve okuma belgelenir. Eritrosit takibi için her nokta dijital kamera tarafından en az 30 saniye süreyle kaydedilir ve video görüntüleri saniyede 150 kare hızında kaydedilir. Bu hız, saniyede altı milimetreye kadar hızların belirlenmesi için bir video karesinde bir hücrenin bir ila altı görüntüsünü elde etmek üzere ayarlanmıştır.

Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve uygun yazılımı kullanarak anesteziden kurtulmak için kafesine geri koyun. Elde edilen video görüntüleri dijitalleştirilir ve XY. Her hücre görüntüsü için koordinat verileri elde edilir. Hücre konumları, görüntü analizi yerine manuel olarak belirlenir.

Eğitimli bir gözlemcinin gözünün, genel olarak gözlemlenen maksimum floresan konumuna karşılık gelen bir hücrenin merkezinin konumu hakkında iyi bir tahmin verdiği göz önüne alındığında. Çoğu hücre oryantasyonu için, her bir damardaki 15 hücre için konum ve hız belirlemeleri yapılır. Gemi çapı ve RBC hızı ölçümleri mevcut olduğunda ortalama RBC hızını elde etmek için bir ortalama.

Her bir damardaki kan akışının hesaplanması, Q'nun kan akışına eşit olduğu, V'nin RBC hızına eşit olduğu ve D'nin damar çapına eşit olduğu iki kare çarpı PI çarpı V üzerinden Q eşittir D formülü kullanılarak yapılabilir. İntravital mikroskopi, FSE etiketli albümin ve Texas Red ile etiketlenmiş pan lökosit belirteci CD 45'e karşı antikorların bir karışımı ile aşılanmış bir hayvan üzerinde gerçekleştirilir. Floresan etiketli albümin, penetran damarlar da dahil olmak üzere vasküler ağın daha iyi görselleştirilmesine izin verir ve özellikle serebral sıtma gibi hastalık durumlarında perfüze edilmemiş veya perfüze edilmemiş damarları kontrol etmek için yararlıdır.

Floresan etiketli anti CD 45 antikorları, lökosit yuvarlanmasını ve yığın damarlarına yapışmasını tanımlamayı ve ölçmeyi kolaylaştırır. Lökosit adezyonunun miktar tayini, 100 mikronluk bir damar uzunluğundaki lökosit sayısı sayılarak yapılır. Haddeleme, 30 saniye boyunca aynı 100 mikron uzunluğunda kan hızından önemli ölçüde daha yavaş bir hızda hareket eden lökositlerin sayısının sayılmasıyla ölçülür. Gösterilen.

Burada, yüksek hızlı floresandan hücre takibi ile mikrovasküler kırmızı kan hücresi hızı ölçümlerine bir örnek verilmiştir. Video kayıtları, resimler A'dan F'ye, mikrosirkülasyonun dizi görüntüleridir. Her resim, yüksek hızlı kamera tarafından kare kare yakalanan tek bir akan kırmızı kan hücresinin konumunu temsil eder.

Temsili bir deneyden elde edilen bu grafik, zaman içinde yığın kan akışındaki değişiklikleri göstermektedir. Plasmodium, burgi, onca ile enfekte olmuş farelerde ve enfekte olmamış kontrol farelerinde, kontrol farelerinde ise yığın kan akışı zamanla nispeten stabildir. PBA ile enfekte fareler, serebral sıtma gelişimi sırasında kan akışında bir pazar düşüşü gösterir.

Altıncı günde, anti CD 45 ile boyanan Texas kırmızı floresan antikorları, plasmodium burgi onca ile enfekte olmuş bir farenin yığın damarlarına yapışan çok sayıda lökosit ortaya çıkarır. Bu prosedür, bugün burada bulunan tek bir işin yanı sıra geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir. İn vivo olarak kullanılabilecek herhangi bir optik teknik bu modele uyarlanabilir ve doku, oksijen seviyesi dokusu, pH reaktif oksijen türleri ve lökositlerle endotel etkileşimi gibi parametreler bu modelde incelenebilir.