Name: Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin fare beyni mikrosirkülasyonunu intravital mikroskopi ile incelemeyi. Kronik kranial pencere implantasyonu kullanarak hemodinamik ve inflamatuar değişiklikleri canlı olarak gözlemleyin. Bu yöntem nörolojik hastalıkların patofizyolojisini anlamak için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri LJMC için hibe R01-HL87290, R01-HL87290-S1 ve R01-AI082610 tarafından da desteklenmiştir.

1. Kraniotomi 8-10-haftalık farelerde kraniotomi titanyum çubuk baş hayvanın yer almamış olması dışında, daha önce açıklanan 1 olarak önceden yapılması gerekir. Kronik kafa penceresi pial mikrosirkülasyon hatta aylar implante edildikten sonra istikrarlı bir hazırlık izin muayene. Genellikle 2-3 hafta kafatası pencere implantasyon sonrası çalışmaları yapmak. 2. Intravital mikroskopi <ol><li> İki-üç hafta sonra kraniotomi, vücut ısısı kontrol edilmeli ve sonra fare ile hafifçe anestezi izofluran (indüksiyon için% 4, bakım için% 1-2). Hafif anestezi deneysel prosedür sırasında hayvan stres ve rahatsızlık önlemek için kullanılır. </li><li> Hayvanlar daha sonra stereotaksik bir çerçeve ve dikkatle kulak bar kullanarak güvenli bir şekilde baş yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir. Düzeyi, sağ ve sol kolları kullanılarak ayarlanır. Çekirdek vücut ısısını bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. Serebral sıtma ile fareler hipotermi geliştirmek için, sıcaklık ayarları her bir hayvan için ayarlanması gerekir. </li><li> Kafa pencerede kapak kayma, mineral yağ ve pencerenin altında gemiler panoramik bir resim, bir stereomikroskopta ve bir dijital fotoğraf makinesi (Nikon Coolpix 995, Japonya) yardımı ile alınır ile ıslatılmış bir pamuk çubukla hafifçe temizlenir. Resim, basılı, tespit ve tarih ve damar çapı ve kırmızı kan hücre (RBC) hızlarının ölçümleri için bir harita olarak kullanılır. </li><li> Fare, sonra bir intravital mikroskop aşaması (Leica-McBain, San Diego, CA özel) aktarılır. Bir damla su, diş akrilik oluşturduğu yararlanarak kafatası pencere üzerine yerleştirilir, odak ayarlanır. Ölçümler bir 20X (LUMPFL-WIR, sayısal diyafram 0.6 Olympus) su altında kalacak amacı ile yapılmaktadır. Aynı damarların bazal düzeylere doğrudan karşılaştırmalar, küçük bir örnek popülasyonları için daha sağlam istatistikler için izin olabilir takip edilmektedir. Görüntüler bir dijital düşük ışık koşullarında yüksek hızlı kamera (Hamamatsu C9300-221, Japonya), veya bir VCR kaset bağlı düşük ışık analog kamera (Cohu 4815, San Diego, CA) (JVC, Japonya), damgalı zaman (MicroImage Video kullanılarak yakalanır Sistemleri, Boyertown, PA) ve renkli monitör (PELCO, Clovis, CA). Bant kayıt başlamadan önce doğru tespit ve zaman damgası, bu tür olaylar recoded olduğu zaman diliminde belgeleyen olayların belirlenmesini sağlar. </li><li> Gemilerin ilk onay kan damarlarında akan ise hazırlık kalitesini değerlendirmek için yapılan ve. Sonra, ölçülecek olan gemilerin seçimi yapılır ve değişik çaplarda venüller ve arterioller (fare pial hazırlıkları, en gemiler 20 ve 80μm arasında değişmektedir) ve pencere tarafından maruz kalan alan içinde farklı yerlerde kapsamalıdır. Arteriol ve venüller geminin etkileri kan akışı (dağıtan veya kan toplar olmadığını) yönünü kontrol ederek kolayca ayırt edilebilirler. Çalışmalarda, ölçümleri 12 damarlarında yapılır. Ölçülecek her noktanın tam yerini pial damarsal resim açıklamalı. </li><li> Her nokta için, bir görüntü kesme cihazı (Resim Kesme, Vista Electronics, San Diego, CA) 2 damar çapı ile ölçülür. Nokta seçildikten sonra, geminin görüntü dikey konumda uyumlu ve karşı aşırı hizalanır ve okuma belgelenmiştir kadar görüntü makaslanmış. Bu değer, Reticle Kalibrasyon Stage Mikrometre (Edmund Optik A.Ş., Barrington, NJ) kullanarak her bir spesifik büyütme önceki kalibrasyon mikrometre tercüme edilebilir. </li><li> Her nokta için en az 30 saniye boyunca eritrosit izleme kaydedilir. Izleme için kan örneği toplanır ve eritrositler floresan ile etiketlenmiş boya Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) ve kuyruk ven yoluyla aşılanan bir ~ 0,4-0,5% 3 in vivo konsantrasyonu elde etmek için carbocyanine. , Etiketli hiçbir infüzyon; Plasmodium berghei ANKA (PBA) yeşil flüoresan protein (CJ Janse ve AP Waters tarafından yatırılan PBA-GFP, Sıtma Araştırma ve Referans Reaktifi Kaynak Merkezi MR4, Manassas, VA bağış) ifade ile enfekte hayvanların hücre gerekli. Saniyede 150 kare hızında video görüntüleri kaydedilir. Bu oran 8 mm / sn 'ye kadar hızlarının belirlenmesi için bir video çerçeve üzerinde bir hücre 05:59 görüntüler elde etmek için Video görüntüleri Adobe Premier 4.0 yazılımı kullanarak bir kişisel bilgisayar ile sayısallaştırılmış ve her hücre görüntü için xy koordinat verileri SigmaScan Pro 4.0 yazılımı (SPSS, Chicago, IL) 4 kullanılarak elde edilir . Hücre pozisyonları göz eğitimli bir gözlemci, iyi bir tahmin, bir hücrenin merkezinde, yerini vermek gösterildi verilen elle yerine, görüntü analiz yöntemi ile belirlenirh genel olarak çoğu hücre yönelimleri için gözlenen maksimum floresans konuma karşılık gelir. Birden fazla pozisyon ve hız tespitler her hücre için yapılan ve ortalama eritrosit hızı elde etmek için ortalama. </li><li> RBC hız ölçümleri çevrimdışı yapıldığında, her bir fare için toplam gözlem süresi 10-15 dakika anestezi cardiodepressive etkilerinin en aza indirilmesi aşmamaktadır. </li><li> Damar çapı ve RBC hız ölçümleri sonra, her damarda kan akımının hesaplanmasında aşağıdaki formül kullanılarak yapılabilir: Q = V x π (D / 2) 2, Q = kan akımı, V = RBC hızı ve D = damar çapı. </li><li> Bu prosedürler zaman içinde tekrar edilebilir. Örneğin, fare modelinde serebral sıtma, enfeksiyon günde 4 günlük ölçümler gerçekleştirir. Her fare için her gün elde edilen değerler% 100 olarak kabul edilir ile ilgili günlük 0 (pre-enfeksiyon), normalize edilir. </li><li> Örneğin gelişmiş perfüzyon pial damarların lökosit ve / veya trombosit haddeleme ve bağlılığın değerlendirmesi ve analizi için, damar çapı ve kan akım ölçümleri yanı sıra, ek değerlendirmeler yapılabilir. Bu ölçümler floresan etiketli işaretleyicileri yardımıyla yapılmaktadır. Sıtma durumda, biz de GFP ifade PBA suşu kullanılarak yoluyla dolaşan veya yapışık parazitleri tespit edebilir. </li><li> Perfüzyon değerlendirmesi için bir çözüm FITC etiketli albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), ve Texas Kırmızı (TxR) etiketli pan-lökosit işaretleyici CD45 karşı antikor pial damarlara lökosit bağlılığı ölçmek için ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Bunun için, 25μL Albumin-FITC (2mg/mL) ve anti-CD45-PE antikor 20μL (200μg/mL) karıştırılır ve önceden ısıtılmış kuyruk ven enjekte edilir. Daha sonra fare sızıntı ölçümleri albümin-FITC 15 dakika dolaşmasına izin alacağı ancak, hemen görüntülü olabilir. XF100-2 (Omega Optik, Brattleboro, VT) ve anti-CD45-TxR floresan (615nm) çıkıldı ve albümin-FITC ve GFP (GFP pRBC PBA-) tarafından yayılan Yeşil floresan (518nm) kullanarak ve ALPHA Canlı yakalanır XF42: Canlı Standardı ile ele geçirdi. </li><li> Floresan etiketli albumin damar ağı, delici damarları dahil olmak üzere gelişmiş görselleştirme sağlar ve non-perfüze veya altında-perfüze damarları kontrol etmek için serebral sıtma gibi hastalık durumlarında yararlıdır. Ayrıca vasküler sızıntı 5 ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Floresan etiketli anti-CD45 antikorları pial damarlara lökosit yuvarlanma ve yapışma belirlemek ve ölçmek için kolaylaştırır. Nicelleştirmesinde önyargı önlemek için, aynı noktalar kan akışını ölçmek için önceden tanımlanmış bir yuvarlanma ve yapışma ölçmek. Lökosit adezyonu Niceleme 100μm damar uzunluğu lökosit sayısı sayım yapılır. Rolling kan hızı 30 saniye boyunca aynı 100μm uzunluğu göre çok daha yavaş bir hızda seyahat lökosit sayısı sayarak sayısal. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1. Kraniyal pencere üzerinden erişilebilir fare pial damar ağı (Adım 2.6) Resimler. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2. Fare pial mikrosirkülasyon intravital mikroskopi için set (Steps 3,1-3,5) Şematik gösterilecek. 1: intravital mikroskop, 2: 20X suya daldırma amacı; 3: ışık kaynağı; 4a: dijital düşük ışık yüksek hızlı kamera, 4b: analog kamera, 5: stereotaksik çerçeve fare, 6 bilgisayar monitörü, 7: Analog Shearer görüntü kesme (ok), damar çapı ölçmek için nasıl yapıldığını gösteren izler. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Şekil 3"> Şekil 3. (Adım 3,6-3,8), yüksek hızda floresan video kayıtları hücre takip ederek Mikrovasküler kırmızı kan hücre hız ölçümleri . F Resimleri bir kamera tarafından mikroskobik bir alan ayrılmış geçiş, tek bir hareket RBC gösteren bir pial damar dizisi görüntüleri. Alanında geçiş öncesi kalibre mesafe ile, 15 veya daha fazla hücre çerçevesi konumlarında kare Manuel belirlenmesi, bir Excel elektronik tablosu yardımı ile her bir geminin ortalama RBC hızının hesaplanması sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Şekil 4"> Şekil 4. (Adım 3.9) Veri Plasmodium berghei ANKA (PBA) enfekte olmuş fareler (n = 5) ve bulaşmamış kontrol farelerde zamanla pial kan akışındaki değişiklikleri gösteren bir temsilcisi deney (n = 5). Pial kan akışını kontrol farelerde zaman içinde nispeten sabit olduğunu dikkate alarak, PBA enfekte farelerde kan akışının belirgin bir azalma göstermektedirserebral sıtma geliştirme (Günde 6) zamanında. Veriler ortalama ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Şekil 5"> Şekil 5. Plasmodium berghei ANKA ile enfekte bir fare pial damarlara yapışık lökositlerin (Adım 4.3) büyük bir kısmı, anti-CD45-Texas Kırmızı floresan antikorlar ile boyanarak ortaya koyduğu gibi.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

Burada açıklanan intravital mikroskopi yöntemi fare pial mikrosirkülasyon detaylı gözlem için benzersiz ve güçlü bir araç sağlar. Diğer bireysel arteriyollerin ve venüller singling ve damar çapları, RBC hızları, kan akımı, bağlılık ve lökosit, trombosit ve diğer kan elemanları, vasküler kaçak, doku pH ve pO2 haddeleme gibi parametreleri bir dizi değişiklikler ölçüm sağlar ve potansiyel olarak pek çok uygulamaları. In vivo vasküler yanıt ilaç idaresine gibi müdahaleler üzerine derhal değerlendirilir veya patoloj...

<table><tbody><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Karbosiyanin boyası Dil</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-TxR Ab</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

kapalı kranial pencere kullanarak fare beyin mikrosirkülasyon intravital mikroskopi

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Bu deneysel model, in vivo floresan mikroskobu kullanarak, akut ve kronik, fizyolojik ve patofizyolojik hemodinamik, inflamatuvar ve metabolik koşullar sırasında fare pial mikrosirkülasyon değerlendirmek için tasarlanmıştır . Kapalı bir kafa penceresi farelerin sol parieto-oksipital kortekste üzerine yerleştirilir. Yerel mikrosirkülasyon epi ve floresan aydınlatma, ve damarların çapları ve kırmızı kan hücre (RBC) hızları yapılan ölçümleri kullanarak pencere üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedilir. RBC hızı gerçek zamanlı çapraz korelasyon ve / veya floresan etiketli eritrositler kullanılarak ölçülür. Perfüzyon ve vasküler sızıntı pial damarları ve değerlendirme Lökosit ve trombosit bağlılık Albumin-FITC ve anti-CD45-TxR antikorları gibi floresan etiketli işaretleyicileri yardımıyla yapılır. Mikrosirkülasyon birkaç gün içinde tekrar tekrar video kayıt olabilir. Biz ilk defa pial mikrosirkülasyon çalışmada farelerde Plasmodium berghei ANKA enfeksiyonu seyri sırasında dinamik değişiklikleri takip edebilecek ve CM ifade kan derin düşüş, vazokonstriksiyon ile karakterize mikrosirkulasyonu işlev bozuklukları ile ilişkili olduğunu göstermek için pencereyi kapat beyin intravital mikroskopi için kullanılan akış ve sonuçta vasküler çöküşü.

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Bu deneysel model; akut ve kronik, fizyolojik ve patofizyolojik hemodinamik durumlar sırasında fare pial mikrosirkülasyonunu değerlendirmek üzere tasarlanmıştır...

Bu prosedürün genel amacı, pile mikrodolaşımındaki hemodinamik ve inflamatuar belirteçlerdeki dinamik değişikliklerin uzun süreler boyunca takip edilmesine olanak tanıyan intravital mikroskopi ile fare beynindeki mikrodolaşımı incelemektir. Bu teknik, birçok farklı çalışma türü için kullanıldığı La Jolla Bioengineering Institute'da geliştirilmiştir. Örneğin; Plasmodium berghei ANKA enfeksiyonu seyri sırasındaki hemodinamik değişikliklerin ve serebral malarya ekspresyonu anındaki durumun takibinde kullanılmıştır.Bu işlem, öncelikle intravital mikroskopi çalışmalarından iki hafta önce kronik bir kraniyal pencerenin implante edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, düşük büyütmede yüksek çözünürlüklü dijital bir görüntü kullanarak kraniyal pencerenin genel morfolojisinin kaydedilmesidir. Prosedürün üçüncü adımı ise konvansiyonel ve floresan aydınlatma kullanarak intravital mikroskopi görüntülerinin elde edilmesi ve damar çapı ile RBC hızının çevrimiçi ölçümleri için spesifik çalışma bölgelerinin seçilmesidir.Prosedürün son adımı, floresan işaretli spesifik antikorlar aracılığıyla pil vasküllerindeki lökosit ve trombosit yapışmasının intravital analizini gerçekleştirmektir. Nihayetinde, beyin intravital mikroskobu aracılığıyla, bu durumlarla ilişkili hemodinamik değişiklikleri saptamak için fizyolojik, patofizyolojik veya hastalıklı durumların cerebral aynalama modellerinde in vivo mikrodolaşım değişikliklerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyni dış ajanlara veya yapifürel ortamlara maruz bırakmadan kendi fizyolojik ortamında gözlemlememizdir; intravital mikroskopi, manyetik rezonans görüntüleme ve anjiyografiye kıyasla mekansal ve zamansal çözünürlüklere sahiptir ve mikroskobik düzeyden daha mikroskobik düzeylere bakmamıza olanak tanır.Bu yöntem, akut ve kronik hastalıklar sırasındaki hemodinamik ve inflamatuar değişiklikler gibi beyin mikrosirkülasyonunun fizyolojisi ve patofizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İntravital mikroskopi öncesindeki iki ila üç hafta içinde, sekiz ila 10 haftalık farelerde daha önce gösterildiği şekilde, hayvanın kafasına titanyum bar yerleştirilmediği hariç bir kraniyotomi gerçekleştirilir. Kronik kranial pencere, implantasyonun üzerinden aylar geçse dahi deney gününde pil mikrosirkülasyonunun incelenmesine olanak tanıyan stabil bir preparattır.Önceden hazırlanmış floresan işaretli eritrositleri farenin kuyruk veninden enjekte edip hayvanı stereotaksik çerçeveye yerleştirmeden önce, ilk olarak hayvanın vücut sıcaklığını kontrol edin. Bu işlem, daha sonra gösterilecek olan eritrosit takibini mümkün kılacaktır. Ardından, fareyi izofluran ile hafifçe anesteziye alın.İndüksiyon için %4, idame için %1 ila %2. Ardından, hayvanı bir ısıtma pedi üzerinde, stereotaksik çerçevede yüzüstü pozisyona getirin. Kulak barlarını kullanarak başı dikkatlice sabitleyin ve sağ ve sol kolları kullanarak seviyeyi ayarlayın.Kraniyal pencere üzerindeki lamelini, mineral yağı ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin. Ardından, dijital bir kameraya bağlı stereo mikroskop kullanarak, pencerenin altındaki damarların birkaç panoramik fotoğrafını çekin. Panoramik fotoğrafları bir bilgisayara aktardıktan sonra, yazdırılacak, tanımlanacak ve tarih atılacak olan en iyi fotoğrafı seçin.Bu fotoğraf, intra vital mikroskobiye başlamak için bir sonraki adımda gösterilecek olan damar çapı ve kırmızı kan hücresi hızlarının ölçümleri için bir harita olarak kullanılacaktır. Fareyi özelleştirilmiş bir intravital mikroskop tablasına aktarın. Dental akrilik tarafından oluşturulan kuyucuktan yararlanarak kranial pencere üzerine bir damla su damlatın.Sayısal açıklığı 0,5 olan 20x su daldırma objektifi kullanılır. Görüntüler iki kamera ile kaydedilir: bir bilgisayara ve monitöre bağlı dijital düşük ışıklı, yüksek hızlı kamera ile bir VCR kasedine, zaman damgasına ve renkli monitöre bağlı düşük ışıklı analog kamera. Ölçüm için damarlar seçilmeden önce, preparatın kalitesini değerlendirmek için damarlar kontrol edilir ve tüm damarlarda kan akışı mevcutsa, ölçülecek damarlar seçilir. Seçilenler, farklı çaplardaki ven ve arterleri içermeli ve pencere tarafından açılan alandaki farklı konumları kapsamalıdır.Deneyimizde, kranial pencere içindeki çeşitli alanları incelerken ölçüm yapmak için 12 damar seçiyoruz. Damarları seçmek için, daha önce çekilmiş olan PY vaskülarizasyon fotoğrafında ölçülecek her bir noktanın kesin konumunu işaretleyin; her bir nokta için damar çapı bir görüntü kaydırma (image shear) cihazı kullanılarak ölçülür. Nokta seçildikten sonra, damarın görüntüsü dikey konuma getirilir ve görüntü zıttına kadar kaydırılır.Uç noktalar hizalanır ve okuma kaydedilir. Eritrosit takibi için, her nokta dijital kamera ile en az 30 saniye boyunca kaydedilir ve video görüntüleri saniyede 150 kare hızında kaydedilir. Bu hız, saniyede altı milimetreye kadar olan hızların belirlenmesi için tek bir video karesinde bir hücrenin bir ila altı görüntüsünü elde edecek şekilde ayarlanmıştır.Veri toplama işlemi tamamlandığında, fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve uygun yazılımı kullanarak anesteziden ayılması için kafesine geri koyun. Elde edilen video görüntüleri dijitalleştirilir ve her bir hücre görüntüsü için XY.Koordinat verileri elde edilir. Hücre konumları, görüntü analizi yerine manuel olarak belirlenir.Eğitimli bir gözlemcinin gözünün, genellikle gözlemlenen maksimum floresan konumuna karşılık gelen hücre merkezinin konumu hakkında iyi bir tahmin sağladığı göz önünde bulundurulmuştur. Çoğu hücre yönelimi için, her damarda 15 hücrenin konum ve hız belirlemeleri yapılır. Damar çapı ve RBC hızı ölçümleri elde edildikten sonra, ortalama RBC hızını bulmak için bir ortalama hesaplama yapılır.Her bir damardaki kan akışının hesaplanması, Q eşittir D bölü iki kare çarpı PI çarpı V formülü kullanılarak yapılabilir; burada Q kan akışını, V RBC hızını ve D, perfüzyon değerlendirmesi ve pile damarlarındaki lökosit yapışmasının analizi için damar çapını temsil eder. İntravital mikroskopi, FSE işaretli albümin ve Texas Red ile işaretlenmiş pan lökosit belirteci CD 45'e karşı antikorların karışımı infüze edilmiş bir hayvanda gerçekleştirilir. Floresan işaretli albümin, penetran damarlar da dahil olmak üzere vasküler ağın daha iyi görüntülenmesini sağlar ve özellikle serebral malaria gibi hastalık durumlarında perfüze olmayan veya düşük perfüzyonlu damarların kontrol edilmesi için kullanışlıdır.Floresan işaretli anti CD 45 antikorları, lökosit yuvarlanmasının ve pile damarlarına yapışmasının tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini kolaylaştırır. Lökosit yapışmasının nicelendirilmesi, 100 mikronluk damar uzunluğundaki lökosit sayısının sayılmasıyla yapılır. Yuvarlanma ise, aynı 100 mikronluk uzunlukta 30 saniye boyunca kan hızından önemli ölçüde daha yavaş hızda hareket eden lökositlerin sayısı sayılarak nicelendirilir. Gösterilmiştir.Burada, yüksek hızlı floresan görüntülemeden hücre takibi yoluyla yapılan mikrovasküler kırmızı kan hücresi hız ölçümlerine bir örnek verilmiştir. A'dan F'ye kadar olan video kayıt görüntüleri, mikrosirkülasyonun ardışık görüntüleridir. Her bir resim, yüksek hızlı kamera tarafından kare kare yakalanan, akan tek bir kırmızı kan hücresinin konumunu temsil eder.Temsili bir deneyden alınan bu grafik, zaman içindeki pile kan akışındaki değişimleri göstermektedir. Plasmodium berghei ANKA ile enfekte olan farelerde ve enfekte olmayan kontrol farelerinde, kontrol farelerinde pile kan akışı zaman içinde nispeten sabitken, PBA enfekte fareler serebral malaria gelişimi sırasında kan akışında belirgin bir azalma göstermektedir.Altıncı günde, anti CD 45 Texas red floresan antikorlarla yapılan boyama, plasmodium burgi onca ile enfekte edilmiş bir farenin pilus damarlarına yapışmış çok sayıda lökositi ortaya çıkarmaktadır. Bu prosedür, bugün burada gösterilen işlemin ötesinde geniş bir uygulama alanına sahiptir. In vivo olarak kullanılabilecek her türlü optik teknik bu modele uyarlanabilir ve doku, doku oksijen seviyesi, pH, reaktif oksijen türleri ve lökositlerin endotel ile etkileşimi gibi parametreler bu modelde incelenebilir.

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kortikal kan akımı dinamikleri 2-foton mikroskobu ile kemirgen kuyruk damar içine enjekte görüntüleme floresan dekstran boyalar in vivo olarak incelenebilir. Bu video görüntü kan akışını dinamikleri ile farelerin bir cam kaplı kafatası pencere hazırlama neokorteks nasıl gösterir.

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Bu videoda, implante edilmiş bir kraniyal pencere aracılığıyla bir fare modelinde önceden enjekte edilmiş kanser hücrelerinin intravital görüntülemesini gerçekleştiriyoruz. Bu yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme tekniği, canlı faredeki kanser hücrelerinin dinamik davranışının incelenmesini sağlar.

Bir Fare Modelinde Kranial Pencere Tabanlı İntravital Görüntüleme: Bir Murin Modelinin Beynindeki Önceden Enjekte Edilmiş Kanser Hücrelerinin Davranışını İncelemek İçin Bir Görüntüleme Tekniği

Kaynak: Sweeney, A. M., et al. Floresan Makroskobu Kullanılarak Sağlam Fare Kafatasından Beyin Omurilik Sıvısı Taşınmasının İn Vivo Görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, floresan görüntüleme kullanarak bir fare beynindeki beyin omurilik sıvısı (BOS) akışını görselleştirme sürecini göstermektedir. Cisterna magna'ya (CM) bir floresan izleyici enjekte edilir ve BOS ile hareketinin subaraknoid ve perivasküler boşluklar boyunca izlenmesine izin verilir. Hızlandırılmış görüntüleme, izleyicinin...

Floresan Makroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyninde Beyin Omurilik Sıvısı Taşınmasının İn Vivo Görüntülenmesi

distal orta serebral arter dalı (MCAO) Cerrahi tıkanması, deneysel inme araştırmalarında sıkça kullanılan bir modeldir. Bu el yazması farelerde boyuna intravital mikroskopi için bir fırsat sunuyor yanal kafatası pencere takılması, birlikte kalıcı MCAO temel tekniğini açıklar.

Yanal Kronik Kranial Pencere Hazırlık sağlar İn Vivo Farelerde Distal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı takiben Gözlem

Bu yazının uzunlamasına iki foton mikroskopi kullanılarak in vivo amiloid plak birikimi sırasında cerebrovasculature bir biçimlenme izlemek için bir yordam açıklanır. Incelmiş kafatası preparat, Alzheimer hastalığının bir fare modelinde serebrovasküler hasara ilerlemesini değerlendirmek için floresan boyalar görselleştirme sağlar.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Transkraniyal optik görüntüleme, canlı fareler korteks içinde sağlam bir kafatası ile beyin omurilik sıvı taşımacılığı geniş alan görüntüleme sağlar.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

Bu protokol, floresan polistiren mikrosferler kullanılarak in vivo iki foton mikroskopi görüntüleme için optimize edilmiş kronik kraniyal pencere ve mikrovasküler embolizm fare fare modeli için adım adım yaklaşımın ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Floresan Polistiren Mikrosferleri Kullanarak In Vivo İki Foton Mikroskopi İçin Mikrovasküler Embolizm Fare Modeli

Öğrenin fare beyni mikrosirkülasyonunu intravital mikroskopi ile incelemeyi. Kronik kranial pencere implantasyonu kullanarak hemodinamik ve inflamatuar değişiklikleri canlı olarak gözlemleyin. Bu yöntem nörolojik hastalıkların patofizyolojisini anlamak için güçlü bir araçtır.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Daha fazla video keşfet