Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Bu büyük ölçekli elektron mikroskobunun veya bir nanotomi deneyinin genel amacı, dejenere zebra balığı beyninde makromoleküler seviyeden doku seviyesine kadar olan değişimleri tanımlamaktır. Nanotomi, yaşam bilimlerindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, nörodejenerasyonda ve tip 1 diyabet araştırmalarında.

Nanotominin temel avantajı, makromoleküllerden, organellerden, hücrelerden dokulara kadar tarafsız bilgilerin elde edilmesidir. Bu, nanotomy.org aracılığıyla niceliksel ve açık erişimli veri paylaşımına izin verir. Nanotomi, zebra balığı nörodejeneratif beyinde bağışıklık bakımı ve mikroglia hakkında bilgi sağlasa da, hücre kültürü, fare ve hatta insan dokuları dahil olmak üzere diğer hastalık modellerine de uygulanır.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bilim adamları, veri miktarı çok büyük olduğu için mücadele ederler. Bu, geleneksel EM ile elde edilenden bin kat daha fazla olabilir. Zebra balığı larvalarını metin protokolüne göre sabitledikten sonra, osmiyumun penetrasyonunu kolaylaştırmak için larva başlarını rostral olarak arka beyne kesin. Larvaları %1 osmiyum tetroksit, %1.5 potasyum ferrosiyanür, 0.1 molar sodyum kakodilat içine yerleştirin ve iki saat buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra embriyoları her seferinde beş dakika boyunca üç kez durulamak için çift damıtılmış su kullanın. Gömmeden önce, numunelerin bir dizi etanol içinde kurutulması gerekir. Embriyoları gömmek için, metin protokolüne göre gece boyunca seyreltilmiş epoksi reçine içinde inkübe ettikten sonra, seyreltilmiş reçineyi çıkarın ve yerine saf reçine kullanın.

30 dakika inkübe edin, ardından reçineyi ikinci kez değiştirin ve 30 dakika daha inkübe edin. Reçineyi üçüncü kez yeniledikten sonra, oda sıcaklığında üç saat inkübe edin. Daha sonra 58 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Son olarak, oda sıcaklığında düşük basınç altında bir saat inkübe edin. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, kafaları piyasada bulunan silikon düz gömme kalıplarına yönlendirmek için bir iğne veya kürdan kullanın. Daha sonra epoksi reçineyi gece boyunca 58 santigrat derecede polimerize edin.

Numune tamamen sertleştiğinde, saplamadaki fazla reçineyi kesmek için tıraş bıçağı kullanın. Doğru konumlandırmayı tespit etmek için, toluidin mavisi/bazik fuksin için yarı ince larva bölümlerini kesmek için bir ultramikrotom üzerinde bir cam bıçak veya elmas histoknife kullanın. Yarı ince kesitleri, ucu alevde eritilerek kapatılmış bir cam Pasteur pipeti ile toplayarak mikroskobik slaytların üzerine aktarın.

Su kalmayana kadar sıcak bir tabakta kurutun. Daha sonra, numuneleri suda% 1 toluidin mavisi içine yerleştirin ve bölümleri lekelemek için 10 saniye boyunca sıcak bir plaka üzerinde inkübe edin. Ardından, bölümleri durulamak için su kullandıktan sonra, numuneleri 10 saniye daha lekelemek için %1 sodyum tetraborat içinde %05 bazik fuksin kullanın.

10X ila 40X'te normal bir ışık mikroskobu ile numuneleri inceleyin. Uygun bölgeye veya oryantasyona ulaşıldığında, ultra ince kesitleme sırasında ilgilenilen beyin bölgesini belirlemek ve numune eğildiğinde kesit açısını ayarlamak için koku alma çukurları, gözler veya gri-beyaz madde sınırları dahil olmak üzere kolayca tanımlanabilir anatomik yapıları kullanın. Ultra ince 70 nanometre kesitleri kesmek için epoksi reçine bloğunu elmas bıçakla bölümlere ayırmaya devam edin.

Izgara çubukları tarafından kesintisiz alıma izin vermek için her bölümü tek bir yuva L2'ye 1 form barkodlu bakır ızgaraya monte edin. Bir milimetre kare küçük görünebilir. Sadece açıklığa sığacak.

Bu sayede ızgara çubuklarının numunemizi bloke etmesini önlemiş oluyoruz. Örneğimizde tanıtılan her eserin geleneksel EM'ye kıyasla kaydedileceğini anlayın. Numuneleri metin protokolüne göre ağır metallerle karşılaştırın ve bir ızgara kutusunda saklayın. Numuneyi taramalı elektron mikroskobuna veya SEM'e monte etmek için, ızgarayı transfer kutusundan çoklu ızgara numune tutucusundaki bölümle birlikte yerleştirin ve SEM'in odasına aktarın.

Dedektörü metin protokolüne göre hizaladıktan sonra, taranacak alanın tamamı görüntü penceresine sığacak şekilde uzaklaştırarak numuneyi önceden ışınlayın. Diyafram açıklığı 120 mikrometre olarak değiştirildikten ve görüntü bulanıklaştırıldıktan sonra, taranan alanı mümkün olduğunca dar hale getirmek için azaltılmış alan taraması seçeneğini kullanın. Ardından, kareyi yaklaşık bir ila iki saniye içinde taramak için kare hızını ayarlayın.

Ardından en az 100X yakınlaştırın ve küçük bir alanı 10 saniye boyunca tarayın. Alandaki parlaklık hala değişiyorsa, ön ışınlamaya devam edin. Bu alan çevresine göre parlaklığını değiştirmediğinde ön ışınlama yeterli olmaktadır.

Odaktayken, en açık alanı veya özelliği seçin ve tarama hızını ayrıntılar görünecek şekilde ayarlayın. Mikroskop yazılımında, tüm pikselleri dinamik aralıkta tutmak için histogramı dikkatlice izleyerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. En karanlık alanlar ve özellikler için de aynısını yapın.

Parlak alana geri dönün ve histogramın her iki tarafında biraz boşluk olup olmadığını tekrar kontrol edin. Dördüncü altı ila dört sekizinci adımlarda, parlaklık ve kontrast ayarının çok dikkatli bir şekilde yapılması gerekir, böylece tüm alan dinamik aralık içinde olur. Taranacak alanın tamamı hayal penceresine sığacak şekilde uzaklaştırın ve geniş alan edinme programını başlatın.

Ardından, ekrandan bir alan seçerek bir mozaik oluşturmak için sihirbaz seçeneğini kullanın. Hangi ayrıntıların gerekli olduğuna bağlı olarak iki ila beş nanometre arasında bir piksel boyutu kullanın ve transmisyon elektron mikroskobunu veya STEM'i taramak için üç mikrosaniyelik bir bekleme süresi ayarlayın. Mikroskop ayarlarını kontrol etmek için optimize düğmesine basın, gereken süre görüntülenecektir.

Ardından harici tarama oluşturucuyu tekrar açın ve devam düğmesine basın. STEM verilerini analiz etmek için, büyük ölçekli bir EM dosya görüntüleyici programı açın ve döşenmiş tif dosyalarını açacak olan mosaic info adlı dosyayı açın. Tüm Mozaiği Otomatik Dikme seçeneğini seçin ve aşağıdaki parametreleri seçin: örtüşme modu yarıya, dikiş eşiği 0,90'a ve gürültü azaltma otomatike eşittir.

Birleştirme kriterleri karşılanamıyorsa, kutucuğu yakınlaştırın ve manuel olarak yerine yerleştirin ve Olduğu Gibi Devam Et'i tıklayın. Verileri bir HTML dosyası veya tek bir tif olarak dışa aktarın. Daha sonra ölçümleri etkinleştirmek için son piksel boyutunu ve dosya adını ekleyin, ardından verileri metin protokolüne göre analiz edin. Burada gösterildiği gibi, kontrol beyin bölümlerinin nanotomisi, koku alma lifi demetleri, nöronal çekirdekler ve sinapslar dahil nöronal alt bölmeler dahil olmak üzere rostral ön beynin nöral dokusunun tipik ultrastrüktürel özelliklerini ortaya koymaktadır.

Burada, hücre altı yapılar, Golgi aygıtı, endoplazmik retikulum, mitokondri, sinaptik veziküller ve post-sinaptik yoğunluklar dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde ve organellerde farklı nükleer morfolojileri ve odakları içerir. Beklenmedik bir şekilde, ventrikülü kaplayan hücrelerin çekirdekleri, beyinde daha yanal olarak dağılmış diğer hücrelere kıyasla çok elektron yoğundur. Mikroglia'da, çekirdekler ayrıca beyindeki diğer hücrelerde bulunmayan koyu odaklar, muhtemelen heterokromatin gösterir.

Nöronal ablasyon geçiren bir zebra balığı larvasındaki bir koronal bölümün büyük ölçekli EM'sinden elde edilen bu görüntü, fagositik mikrogliayı ortaya koymaktadır. Memeli hücrelerinde mikroglia'nın karakteristik özellikleri, belirgin Golgi aygıtı ve lizozomlar gibi çok sayıda inklüzyon dahil olmak üzere bu hücrelerde de bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, satın alma bir gün içinde yapılabilir, burada geleneksel EM size en az bir haftaya mal olur.

Bu prosedürü denerken, bir mikroskop operatörünün yüksek kaliteli görüntüler elde etmede çok önemli bir rol oynaması önemlidir. Bu sadece bir düğmeye basma tekniği değildir. Şimdi nanotomiyi sadece zebra balığı nöral dejenerasyon modeline uygulamakla kalmadık, aynı zamanda hücrelerin immüno-etiketlemesi ve sinek dokularını, insan dokularını ve daha fazlasını incelemek için de kullandık.

Bu teknik, herhangi bir alandaki herhangi bir araştırmacının önünü açar. Veri kümelerini nanotomy.org'da çevrimiçi olarak tekrar ziyaret edebilirler. Daha sonra nanometreden milimetre ölçeğine ve incelenen tüm modellere kadar varsayılan değişiklikleri keşfedebilirler.

Bu videoyu izledikten sonra, araştırma sorunuza ve araştırdığınız hücresel veya doku sistemine nanotomiyi nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Unutmayın, toksik reaktifler ve etik hususlar nedeniyle numune hazırlama işlemini yalnızca bir profesyonel yapmalıdır, ancak herkes nanotomi web sitesini deneyebilir. evde org.