Name: Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Öğrenin, insan hücrelerinde endojen ve eksojen sentromer-kinetochore proteinlerinin dolaylı immünofloresan boyama ile lokalizasyonunu optimize etme ve miktarını belirleme yöntemini. Bu protokol hücre biyolojisi araştırmaları için sağlam bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe GM68418 tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Son yıllarda pek çok çalışma, sabit hücreler için farklı nicel mikroskopi deneyleri geliştirdik. 42 Progress sentromer kinetochore biyoloji genellikle hücre içi mekânsal-zamansal düzenleme değişen işlevlerini yansıtan hangi proteinlerin sentromer özgü veya kinetochore özel fonksiyon anlaşılmasını gerektirir hücre döngüsü sırasında bu proteinler. Bu nedenle, burada IIF boyama ve özellikle farklı tedavi örneklerde geçerli olabilir endojen ve eksojen CENP-A proteinlerinin nispi seviyeleri, analiz için niceliksel...

&quot;Sentromerler&quot; Klasik genetikte bastırılmış mayoz rekombinasyon bölgeleri olarak tanımlanan ve daha sonra mitoz sırasında doğru kromozom ayrımı önemli bir rol oynar mitotik kromozom birincil daralma olarak kabul edildi. &quot;Kinetokorlar&quot; elektron mikroskobu ile ortaya koyduğu gibi, sentromerlerinin yüzeyinde mikrotübül bağlanan katmanlı yapılar olarak tarif edildi; &quot;Kinetokorlar&quot; sonra mitotik kromozom sentromer de lokalize makromoleküler kompleksi olarak tanımlandı. omurgalılar arasında sentromerik DNA dizilerinin dramatik farklılığa rağmen, kinetochore yapısı ve bileşimi yüksek oranda korumalıdır. iğ mikrotübüller ve kinetokor oluşumunu uyarır arasındaki dinamik etkileşim mitoz sırasında kromozomların sadık ayrımı için gerekli olan ve sentromer-kinetochore fonksiyonu kurşun kusurları anöploidi ve böylece kanser olduğunu. En ökaryotlarda sentromerResim tanımlanan DNA sekansına sahiptir, ancak 171-bp α-uydu DNA&#39;dan oluşan tekrarlanan alphoid DNA&#39;nın büyük diziler (0,3-5 Mb) oluşmaktadır. Maya tomurcuklanma dışında, sentromer kimliği olmayan DNA dizisi tarafından değil histon H3 varyantı CenH3 içeren özel bir nükleozom varlığı ile elde edilir (sentromer protein A [CENP-A] insanlarda). 5 CENP-A nükleozom lokalize 171-bp α-uydu DNA memeli kinetokorlar 7 ve bağlama iç plakası. Aktif sentromerler gerektiren CENP-A içeren bir araya mili kontrol noktasından mitotik iğ ve sonraki devir ilerlemesine kromozomların eki düzenleyen, bir kurucu sentromer ilişkili ağ (KİAN) ve kinetochore proteinlerin işe yönlendirmek için nükleozom. Yukarıdaki deliller ışığında, CENP-A sentromer 8 epigenetik işareti olduğu ileri sürülmüştür; Bununla beraber, işlem hangi CENP-A i zikredilennBu sentromerik DNA, ve dahil edilmek için sorumlu olan faktörler henüz iyi karakterize edilmemiştir. Kısa bir sentromer hedefleme alanı (CATD) CENP-A bölgesini kat histon bulunur ve CATD ile H3 karşılık gelen bölgenin yerine sentromer doğrudan H3 için yeterlidir. 9 Çeşitli çalışmalarda post-translasyonel fonksiyonel rolleri önerilen modifikasyonu CENP-A 12-16 (PTM); Ancak, sentromer için istihdamında CENP-A bu PTMS moleküler mekanizmalar henüz ortaya konamamıştır. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligaz aktivitesi sentromer için CENP-A CENP-A K124 ubiquitylation ve lokalizasyonu için gerekli olduğu bildirilmektedir. 17 Kinetochore proteinlerin keşfi ve karakterize kromozom segregasyonu ile ilgili yeni bir bakış açısı yol açmıştır. 18 en fazla 100 kinetochore bileşenleri çeşitli yaklaşımlarla omurgalı hücreler tespit edilmiştir. 19,20 Altındafloresan mikroskopi kinetokorlar montaj ve işlevi de hücrelerin içinde her sentromer kinetochore proteinler ve protein-protein ağının hücresel fonksiyonları karakterizasyonu geliyor nasıl ayakta. 19 Doğrudan görselleştirme ve gelişmiş görüntüleme yöntemleri sentromer kinetochore bileşenlerin olağanüstü çözünürlük sağlar ve izin sentromerler ve kinetokorlar spesifik moleküler bileşenleri doğrudan gözlem. Buna ek olarak, özel antikorlar kullanılarak dolaylı immünofluoresan Yöntemi (IIF) boyama Bu gözlemler için çok önemlidir. Bununla birlikte, belirli bir sentromer kinetochore proteinlerin ayrıntılı problemlerinde tartışıldığı IIF protokolleri, birkaç ilgili olarak çok çeşitli raporlara rağmen. 1-4 Böylece geliştirilmesi ve spesifik olarak her bir sentromer kinetochore protein analiz IIF boyama ve kantitatif IIF tahlili yöntemleri rapor son derece önemlidir. IIF boyama, tek ilgilenilen proteinin kaybını önlemek için boyama protokolü ile devam etmelidir veyaHücrenin geri kalanı. Bununla birlikte, sabitleme zaman antigenik mahalleri yok eder ve farklı bir antikor-antijen kombinasyonları, bir fiksatif, yeterli çalışır, ancak çok iyi başka, 21 ve sabitleyici seçimi büyük ölçüde ilgi protein (ler) bağlıdır. Bu nedenle, farklı sabitleyici yöntemleri sentromer kinetochore proteinlerin IIF boyama önem taşımaktadır. Dolaylı immunofloresans (IIF) boyama ve CENP-A ve Flag-künyeli eksojen CENP-A proteinleri ve insan hücrelerinde bu proteinlerin kantitatif dahil endojen sentromer kinetochore proteinlerin lokalizasyonunu gidermek için bir tahlilin Burada optimize yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, diğer türlerde sentromer kinetochore proteinlerin analizi uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri / Invitrogen</td><td>11668</td><td>transfeksiyon reaktifi I</td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>13778</td><td>transfeksiyon reaktifi II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>31985</td><td>Azaltılmış serum ortamı, 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu DMEM (Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>yüksek glikozlu DMEM, 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı ile inaktive edilmiş, ABD menşeili</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (fetal sığır serumu)</td></tr> <tr><td>Poli-L-Lizin ÇÖZELTİSİ</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-Lizin, %0,1 w/v, suda</td></tr><tr><td>UltraPure Damıtılmış Su</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Steril doku kültürü dereceli su&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro Kapak camı (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Kapak camı (22 mm x 22 mm)&nbsp;</td></tr><tr><td>6 Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6 kuyulu polistiren plaka&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin, Streptomisin; Sıvı</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penisilin-streptomisin</td></tr><tr><td>PAP KALEM&nbsp;</td><td>Bağlanma Yeri</td><td>AD100.1</td><td>Hidrofobik bariyer kalemi (immünofloresan boyamada su itici bariyer için)</td></tr><tr><td>Paklitaksel (Taxol)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>Mitotik hücre analizi için taksol</td></tr><tr><td>, TN-16, mikrotübül inhibitörü (TN16)</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>BML-T120</td><td>Mitotik hücre analizi için TN16</td></tr><tr><td>BSA (sığır serum albümini)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>Bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>Geçirgenlik için deterjan</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>Fiksasyon reagant</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Nükleer boyama için</td></tr><tr><td>p-fenilendiamin</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td> Orta <td></td></tr><tr><td>VWR Mikro Kızakları monte etmek için, Buzlu</td><td>VWR Uluslararası</td><td>48312-013</td><td>Mikro slaytlar&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CENP-A antikoru</td><td>Stressgen/Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>KAM-CC006</td><td>Fare monoklonal antikoru; 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) seyreltme oranı</td></tr> <tr><td>Anti-CENP-B antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Fare monoklonal antikoru; seyreltme oranı 1:200 (IIF, metanol/aseton fiksasyonu)-1:400 (IIF, paraformaldehit fiksasyonu)</td></tr> <tr><td>Anti-CENP-B antikoru&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; seyreltme oranı 1:200 (IIF, metanol/aseton fiksasyonu)-1:400 (IIF, paraformaldehit fiksasyonu)</td></tr><tr><td>Anti-sentromer antikoru (ACA)</td><td>Fitzgerald Industries International, Inc.</td><td>90C-CS1058</td><td>İnsan sentromer antiserumu; 1:2000 (IIF)</td></tr> <tr><td>Anti-CENP-H antikorunun</td> seyreltme oranı <td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:200 (IIF)</td></tr> <tr><td>Anti-CENP-H antikoru</td><td>BD</td><td>612142</td><td>seyreltme oranı Fare monoklonal antikoru; 1:200 (IIF) seyreltme oranı</td></tr> <tr><td>Anti-CENP-I antikoru</td><td>N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa</td><td></td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:1000 seyreltme oranı (IIF); Niikura ve ark., Onkogen, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>Anti-KNL1 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:100 (IIF)</td></tr> <tr><td>Anti-Hec1 antikoru</td> seyreltme oranı <td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>Fare monoklonal antikoru; seyreltme oranı 1:100 (IIF)</td></tr> <tr><td>Anti-Hec1 antikoru</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; seyreltme oranı 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>Anti-Ska1 antikoru</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:100 (IIF)</td></tr> <tr><td>Anti-Flag antikoru</td><td>seyreltme oranı SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>Fare monoklonal antikoru; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) seyreltme oranı</td></tr>. <tr><td>Anti-Flag antikoru</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) seyreltme oranı</td></tr> <tr><td>Anti-CUL4A antikor</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:3000 (WB) seyreltme oranı; Shiyanov ve diğerleri, Biyolojik kimya Dergisi, 35309-35312 (1999)</td></tr> <tr><td>Anti-RBX1 antikoru</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4397</td><td>Tavşan poliklonal antikoru; 1:2000 (WB)</td></tr> <tr><td>Anti-GAPDH antikoru</td><td>seyreltme oranı Chemicon</td><td>MAB374</td><td>Fare monoklonal antikoru; 1:5000 (WB) seyreltme oranı</td></tr>: <tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>florofor konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>florofor konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor)</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG Yaşam</td><td>Teknolojileri/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>florofor konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Keçi Anti-Tavşan IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>florofor konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor)Yağsız</td></tr> <tr><td>süt tozu (karanfil tozu sütü için onaylanmış ikame)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Yeniden Sipariş No. 190915; Lot # 90629)</td> <td>Yağsız süt</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 motorlu floresan mikroskobu&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>motorlu floresan mikroskobu&nbsp;</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x yağa daldırma lensi</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PH 3 CS</td><td>63X yağa daldırma lensi</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x yağa daldırma lensi</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 YAĞ PHE</td><td>100X yağa daldırma lensi</td></tr><tr><td>Leica EL6000 kompakt ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td></td><td>Floresan uyarma için harici kompakt ışık kaynağı</td></tr><tr><td>ORCA-R2 Dijital CCD kamera&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>dijital CCD kamera&nbsp;</td></tr><tr><td>Openlab sürüm 5.5.2 Bilimsel Görüntüleme Yazılımı&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Görüntü gözlemi, elde etme, niceleme ve analiz için</td></tr><tr><td>Velocity sürüm 6.1.1 3D Görüntü Analiz Yazılımı&nbsp;</td><td>Perkin Elmer/Improvision</td><td></td><td>Görüntü gözlemi, elde etme, miktar tayini ve analizi için</td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>Protein konsantrasyonunun ölçümü için ticari protein tahlil reaktifi I (%2 SDS ile uyumlu)</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Protein konsantrasyonunun ölçümü için ticari protein tahlili reaktifi II (%0.1 SDS ile uyumlu)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Milipore</td><td>IPFL00010</td><td>transferi için PVDF membranı</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Keçi Anti-Fare IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor); seyreltme oranı 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 Keçi Anti-Tavşan IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>IR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor); 1:20000 (IIF)</td></tr> <tr><td>Keçi anti-Fare IgG seyreltme oranı DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>DyLight konjuge ikincil antikorIR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite ile saflaştırılmış ikincil antikor); 1:20000 seyreltme oranı (İTF)</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>DyLight konjuge ikincil antikorIR floresan boya konjuge ikincil antikor (Afinite saflaştırılmış ikincil antikor); 1: 20000 (IIF) seyreltme oranı</td></tr> <tr><td>Keçi anti-fare IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2005</td><td>HRP konjuge sekonje sekonder antikorDyLight konjuge sekonje antikorIR floresan boya konjuge sekonder antikor (Afinite saflaştırılmış sekonder antikor) antikor); 1:10000 seyreltme oranı (IIF)</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>HRP konjuge sekonje sekonder antikorDyLight konjuge sekonje antikorIR floresan boya konjuge sekonder antikor (Afinite saflaştırılmış sekonder antikor); 1:10000 seyreltme oranı (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab sürüm 5.5.2. Bilimsel Görüntüleme Yazılımı&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity sürüm 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity sürüm 6.3 3D Görüntü Analiz Yazılımı (Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonik sonicator Microtip Adım, Katı, Dişli 9,5 mm</td><td>VWR Bilimsel Ürünler A.Ş.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>Sonikasyon için bozucu korna</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonik sonikatör Microtip Konik 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>Sonikasyon için Microtip</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Kızılötesi görüntüleme Sistemi&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>İmmünoblot tespiti için kızılötesi görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Image Studio Analiz Yazılımı Ver 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Yazılımı C</td></tr><tr><td>Moleküler Görüntüleyici Versadoc MP4000 Sistemi&nbsp;</td>İmmünoblot tespiti için <td>Bio-Rad</td><td></td><td>Kemilüminesans görüntüleyici</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D analiz yazılımı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Yazılımı D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyetli Yüzey</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Ultra hassas gelişmiş kemilüminesan (ECL) alt tabaka</td></tr></tbody></table>

endojen ve İmmünofloresan analizi ve eksojen sentromer-kinetochore proteinler

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Sentromerler" ve "kinetokorlar", hücre bölünmesi sırasında kromozomların iğ ile birleştiği bölgeyi ifade eder. Hücre döngüsü sırasında sentromer-kinetokor proteinlerinin doğrudan görselleştirilmesi, bu proteinlerin mekanizma(lar)ının araştırılmasında temel bir araç olmaya devam etmektedir. Floresan mikroskobundaki gelişmiş görüntüleme yöntemleri, sentromer-kinetokor bileşenlerinin dikkate değer bir çözünürlüğünü sağlar ve sentromerlerin ve kinetokorların spesifik moleküler bileşenlerinin doğrudan gözlemlenmesine izin verir. Ek olarak, spesifik antikorlar kullanılarak dolaylı immünofloresan (IIF) boyama yöntemleri bu gözlemler için çok önemlidir. Bununla birlikte, IIF protokolleri hakkında çok sayıda rapora rağmen, çok azı spesifik sentromer-kinetokor proteinlerinin problemlerini ayrıntılı olarak tartışmıştır. 1-4 Burada, paraformaldehit fiksasyonu ve IIF boyama kullanarak insan hücrelerindeki endojen sentromer-kinetokor proteinlerini boyamak için optimize edilmiş protokolleri rapor ediyoruz. Ayrıca, aseton veya metanol fiksasyonuna maruz kalan insan hücrelerinde Bayrak etiketli eksojen CENP-A proteinlerini tespit etmek için protokoller rapor ediyoruz. Bu yöntemler, insan hücrelerindekiler de dahil olmak üzere endojen sentromer-kinetokor proteinlerinin ve Bayrak etiketli CENP-A proteinlerinin tespit edilmesinde ve miktarının belirlenmesinde faydalıdır.

Endojen CENP-A immünofloresans analizi CUL4A-E3 ligaz sentromer için CENP-A lokalizasyonu için gerekli olduğu hipotezini desteklemektedir Son çalışmalar, CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligaz aktivitesi CENP-A ve sentromer için CENP-A lokalizasyonuna lisin 124 (K124) arasında ubiquitylation için gerekli olduğunu gösterdi. 17 Başlangıçta, interfaz-sentromer kompleksi (içen) ile izole edilmiştir Anti-CENP-a: kromatin immünopresipitasyon, 32-34 ve içen prot...

Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Bu indirekt immünofloresan analizinin genel amacı, insan hücrelerindeki sentromer protein A ve flag-etiketli ekzojen CENP-A proteinleri dahil olmak üzere, endojen ve ekzojen sentromer-kinetokor proteinlerinin lokalizasyonunu ve miktarını optimize etmektir. Bu yöntem, sentromer-kinetokor proteinlerinin nasıl tanımlanacağı ve miktarlarının nasıl belirleneceğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, seçilen ilgili anafaz evresine bağlı olarak farklı sentromer-kinetokor ekspresyon seviyelerinin miktarının belirlenmesinde kullanılabilmesidir.Ekimden 18 saat sonra, kültürlenen hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve altı kuyucuklu polistiren kültür plağının her kuyucuğuna 500 µL düşük serumlu besiyeri ekleyin. Ardından, her kuyucuktaki hücreleri taze hazırlanmış A ve B karışım çözeltisi ile transfekte edin ve kültürleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin. Dört buçuk saat sonra, besiyerini FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş yüksek glukozlu DMEM ile değiştirin ve plağı hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.48 ila 72 saat sonra, hücre kültür ortamını aspire edin ve hücreleri bir kez PBS ile durulayın; hücrelerin yerinden oynamasını önlemek için salini kültür kuyucuklarının kenarlarından ekleyin. Ardından, hücreleri 4 °C'de 30 dakika boyunca %4'lük paraformaldehit ile sabitleyin. Sabitleme süresinin sonunda, hücreleri iki kez Kb2 tamponu ile durulayın ve örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Kb1 tamponu ile permeabilize edin.Ardından hücreleri bir kez Kb2 tamponu ile durulayın ve taze Kb2 tamponu ekleyerek spesifik olmayan bağlanmaları bloke edin. Oda sıcaklığında beş dakika bekledikten sonra, her bir kuyucuktan ekilmiş lamelleri penset yardımıyla çıkarın ve her bir lamel örneğinin etrafına hidrofobik bariyer kalemi ile hidrofobik bariyerler çizin. Lamelleri yeni bir altı kuyucuklu polistiren plakaya aktarın ve örnekleri 37 °C'de bir saat boyunca uygun primer antikore daldırın.Ardından hücreleri üç kez Kb2 tamponu ile durulayın ve uygun sekonder antikor ile 37 °C'de bir saat daha işaretleyin. İnkübasyonun sonunda, örnekleri Kb2 tamponu ile altı dakika süren beş yıkama ile durulayın. Daha sonra hücre çekirdeklerini, oda sıcaklığında beş dakika boyunca DapE içeren Kb3 tamponu ile işaretleyin ve ardından Kb2 tamponu ile bir ila iki kez yıkayarak kuyucukları tekrar Kb2 tamponu ile doldurun.Şimdi, hücrelerin bulunduğu her bir lam üzerine, mikroskop lamının merkezine bir damla montaj medyumu yerleştirin ve hücre örneklerindeki tüm sıvıları uzaklaştırın. Son olarak, her bir örneği hazırlanan mikroskop lamlarının merkezine dikkatlice yerleştirin ve fazla montaj medyumunu bir kağıt havluyla temizleyin. Bu temsili deneyde gözlemlendiği üzere, CUL4A siRNA transfekte edilen hücrelerin toplam hücre lizatlarındaki endojen CENP-A protein ekspresyon seviyeleri, Luciferase siRNA transfekte edilen hücrelerdeki CENP-A ekspresyon seviyeleri ile benzerdi.Ayrıca, RBX1 siRNA transfekte edilen hücrelerin toplam hücre lizatlarındaki endojen CENP-A protein seviyeleri, Luciferase siRNA transfekte edilen hücrelerin endojen CENP-A seviyeleri ile benzerdi; bu durum, CENP-A'nın sentromerlere lokalizasyonu için CUL4A RBX1 E3 ligazının gerekli olduğunu göstermektedir. CENP-A lizin mutantları sentromerler içinde lokalize olma yeteneklerini kaybetmişlerdir, bu da CENP-A K124 ubikitinasyonunun CENP-A'nın sentromerlere lokalizasyonu için temel olduğunu düşündürmektedir. Önemli bir şekilde, CENP-A proteininin ekzojen monoubikitin füzyonu, delokalize olan CENP-A K124R mutantını kurtararak proteinin sentromerik konumuna dönmesini sağlamıştır.Hücre fiksasyonu ve immünofloresan boyama prosedürleri, uzmanlaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında beş ila altı saat içinde tamamlanabilir. Durulama veya numuneleri daldırma işlemleri sırasında hücrelerin lamelden ayrılmaması için tüm solüsyonları kuyucukların kenarlarına nazikçe uyguladığınızı unutmayın. Havalandırmalı bir oda dışında ısıtılmış paraformaldehit ile çalışmanın veya yanıcı maddelerin ateş yakınında bulunmasının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

immunofluorescence-analysis-endogenous-exogenous-centromere

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Drosophila spermatogenez sırasında centrosomal proteinlerin Görüntüleme sentrozom biyoloji için önemli bir yeni proteinleri tespit etmek yanı sıra, bu işlem bilinen oyuncu belirli bir işlevi aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Burada, bir proteinin floresan yoğunluğunu uygun bir iç standardınkine normalleştirerek, özellikle sentrozomlarda bir proteinin seviyesindeki değişiklikleri ölçmek için yeni bir kantitatif floresan testi geliştirilmiştir.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Arındırmak ve centrioles farklı yönelimleri Süper çözünürlük mikroskobu ve tek-parçacık ortalama için mükellef içinde çok sayıda resim için bir strateji geliştirdik.

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Mayoz fazı sırasında kromozom hareketi, spor oluşumu için temel olan, yeterince anlaşılmamış bir olgudur. Bu protokol, Arabidopsis thaliana erkek mayositlerinde mayotik faz sırasında sentromer hareketlerini elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için bir yöntemi açıklar.

Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

Öğrenin, insan hücrelerinde endojen ve eksojen sentromer-kinetochore proteinlerinin dolaylı immünofloresan boyama ile lokalizasyonunu optimize etme ve miktarını belirleme yöntemini. Bu protokol hücre biyolojisi araştırmaları için sağlam bir temel sunar.

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

Daha fazla video keşfet