Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

Bu dolaylı immünofloresan testin genel amacı, insan hücrelerinde sentromer protein A ve bayrak etiketli eksojen CENP-A proteinleri dahil olmak üzere endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerinin lokalizasyonunu ve niceliklendirmesini optimize etmektir. Bu yöntem, sentromer-kinetokor proteinlerinin nasıl tanımlanacağı ve miktarının nasıl belirleneceği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, seçilen ilgilenilen anafaza bağlı olarak farklı sentromer-kinetokor ekspresyon seviyelerini niceliklendirmek için kullanılabilmesidir.

Tohumlamadan 18 saat sonra, kültürlenmiş hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve altı kuyulu polistiren kültür plakasının her bir oyuğuna 500 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Daha sonra, her bir oyuktaki hücreleri taze hazırlanmış A ve B karışım çözeltisi ile geçirin ve kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Dört buçuk saat sonra, FBS ve antibiyotiklerle takviye edilmiş orta ila yüksek glikoz DMEM'i değiştirin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

48 ila 72 saat sonra, hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri bir kez PBS ile durulayın, hücreleri rahatsız etmemek için tuzlu suyu kültür kuyucuklarının kenarlarına ekleyin. Daha sonra hücreleri %4 paraformaldehit ile 4 santigrat derecede 30 dakika sabitleyin. Fiksasyon süresinin sonunda, hücreleri Kb2 tamponu ile iki kez durulayın ve numuneleri Kb1 tamponunda oda sıcaklığında 30 dakika geçirgen hale getirin.

Daha sonra hücreleri Kb2 tamponu ile bir kez durulayın ve taze Kb2 tamponu ilavesiyle spesifik olmayan bağlanmaları bloke edin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, tohumlanmış örtü camlarını her bir oyuktan çıkarmak için forseps kullanın ve her bir kapak camı numunesinin etrafına hidrofobik bariyerler çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Kapak camlarını altı kuyulu yeni bir polistiren plakaya aktarın ve numuneleri 37 santigrat derecede bir saat boyunca uygun birincil antikora daldırın.

Daha sonra hücreleri Kb2 tamponu ile üç kez durulayın ve 37 santigrat derecede bir saat daha uygun ikincil antikorla etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, numuneleri Kb2 tamponunda 6 dakikalık beş yıkama ile durulayın. Daha sonra hücre çekirdeklerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca DapE içeren Kb3 tamponu ile etiketleyin, ardından Kb2 tamponunda bir ila iki yıkama yapın ve kuyucukları Kb2 tamponu ile yeniden doldurun.

Şimdi, her bir hücre kapak camı için bir mikroskop lamının ortasına bir damla montaj ortamı yerleştirin ve hücre örneklerinden herhangi bir sıvıyı çıkarın. Son olarak, her bir numuneyi hazırlanan mikroskop slaytlarından birinin ortasına dikkatlice yerleştirin ve fazla montaj ortamını bir kağıt havluyla çıkarın. Bu temsili deneyde gözlemlendiği gibi, CUL4A siRNA transfekte edilmiş hücrelerin toplam hücre lizatlarındaki endojen CENP-A protein ekspresyonu seviyeleri, Luciferase siRNA transfekte edilmiş hücrelerdeki CENP-A ekspresyonu seviyelerine benzerdi.

Ayrıca, RBX1 siRNA transfekte edilmiş hücrelerin toplam hücre lizatlarındaki endojen CENP-A'nın protein seviyeleri, Luciferase siRNA transfekte edilmiş hücrelerin endojen CENP-A seviyelerine benzerdi, bu da CENP-A'nın sentromerlere lokalizasyonu için CUL4A RBX1 E3 ligazının gerekli olduğunu düşündürmektedir. CENP-A lizin mutantları, sentromerler içinde lokalize olma yeteneklerini kaybederler, bu da CENP-A K124 ubikitilasyonunun CENP-A'nın sentromerlere lokalizasyonu için gerekli olduğunu düşündürür. Daha da önemlisi, CENP-A proteininin eksojen monoubikitin füzyonu, proteini sentromerik konumuna geri döndürerek delokalizasyon CENP-A K124R mutantını kurtardı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre fiksasyonu ve immünofloresan boyama prosedürleri, uygun şekilde yapılırsa beş ila altı saat içinde tamamlanabilir. Numuneleri durularken veya daldırırken hücrelerin kapak camlarından çıkmaması için tüm solüsyonları kuyucukların kenarlarına nazikçe uygulamayı unutmayın. Havalandırılan bir odanın dışında ısıtılmış paraformaldehit ile çalışmanın veya yangının yakınında yanıcı maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.