Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler
March 3rd, 2016
Burada, insan hücrelerindeki endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerini tespit etmek ve bu protein seviyelerini fiksasyon (paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyonu) kullanarak dolaylı immünofloresan boyama yoluyla sentromer-kinetokorlarda ölçmek için protokolleri rapor ediyoruz.
Bu dolaylı immünofloresan testin genel amacı, insan hücrelerinde sentromer protein A ve bayrak etiketli eksojen CENP-A proteinleri dahil olmak üzere endojen ve eksojen sentromer-kinetokor proteinlerinin lokalizasyonunu ve niceliklendirmesini optimize etmektir. Bu yöntem, sentromer-kinetokor proteinlerinin nasıl tanımlanacağı ve miktarının nasıl belirleneceği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, seçilen ilgilenilen anafaza bağlı olarak farklı sentromer-kinetokor ekspresyon seviyelerini niceliklendirmek için kullanılabilmesidir.
Tohumlamadan 18 saat sonra, kültürlenmiş hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve altı kuyulu polistiren kültür plakasının her bir oyuğuna 500 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Daha sonra, her bir oyuktaki hücreleri taze hazırlanmış A ve B karışım çözeltisi ile geçirin ve kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Dört buçuk saat sonra, FBS ve antibiyotiklerle takviye edilmiş orta ila yüksek glikoz DMEM'i değiştirin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.
48 ila 72 saat sonra, hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri bir kez PBS ile durulayın, hücreleri rahatsız etmemek için tuzlu suyu kültür kuyucuklarının kenarlarına ekleyin. Daha sonra hücreleri %4 paraformaldehit ile 4 santigrat derecede 30 dakika sabitleyin. Fiksasyon süresinin sonunda, hücreleri Kb2 tamponu ile iki kez durulayın ve numuneleri Kb1 tamponunda oda sıcaklığında 30 dakika geçirgen hale getirin.
Daha sonra hücreleri Kb2 tamponu ile bir kez durulayın ve taze Kb2 tamponu ilavesiyle spesifik olmayan bağlanmaları bloke edin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, tohumlanmış örtü camlarını her bir oyuktan çıkarmak için forseps kullanın ve her bir kapak camı numunesinin etrafına hidrofobik bariyerler çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Kapak camlarını altı kuyulu yeni bir polistiren plakaya aktarın ve numuneleri 37 santigrat derecede bir saat boyunca uygun birincil antikora daldırın.
Daha sonra hücreleri Kb2 tamponu ile üç kez durulayın ve 37 santigrat derecede bir saat daha uygun ikincil antikorla etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, numuneleri Kb2 tamponunda 6 dakikalık beş yıkama ile durulayın. Daha sonra hücre çekirdeklerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca DapE içeren Kb3 tamponu ile etiketleyin, ardından Kb2 tamponunda bir ila iki yıkama yapın ve kuyucukları Kb2 tamponu ile yeniden doldurun.
Şimdi, her bir hücre kapak camı için bir mikroskop lamının ortasına bir damla montaj ortamı yerleştirin ve hücre örneklerinden herhangi bir sıvıyı çıkarın. Son olarak, her bir numuneyi hazırlanan mikroskop slaytlarından birinin ortasına dikkatlice yerleştirin ve fazla montaj ortamını bir kağıt havluyla çıkarın. Bu temsili deneyde gözlemlendiği gibi, CUL4A siRNA transfekte edilmiş hücrelerin toplam hücre lizatlarındaki endojen CENP-A protein ekspresyonu seviyeleri, Luciferase siRNA transfekte edilmiş hücrelerdeki CENP-A ekspresyonu seviyelerine benzerdi.
Ayrıca, RBX1 siRNA transfekte edilmiş hücrelerin toplam hücre lizatlarındaki endojen CENP-A'nın protein seviyeleri, Luciferase siRNA transfekte edilmiş hücrelerin endojen CENP-A seviyelerine benzerdi, bu da CENP-A'nın sentromerlere lokalizasyonu için CUL4A RBX1 E3 ligazının gerekli olduğunu düşündürmektedir. CENP-A lizin mutantları, sentromerler içinde lokalize olma yeteneklerini kaybederler, bu da CENP-A K124 ubikitilasyonunun CENP-A'nın sentromerlere lokalizasyonu için gerekli olduğunu düşündürür. Daha da önemlisi, CENP-A proteininin eksojen monoubikitin füzyonu, proteini sentromerik konumuna geri döndürerek delokalizasyon CENP-A K124R mutantını kurtardı.
Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre fiksasyonu ve immünofloresan boyama prosedürleri, uygun şekilde yapılırsa beş ila altı saat içinde tamamlanabilir. Numuneleri durularken veya daldırırken hücrelerin kapak camlarından çıkmaması için tüm solüsyonları kuyucukların kenarlarına nazikçe uygulamayı unutmayın. Havalandırılan bir odanın dışında ısıtılmış paraformaldehit ile çalışmanın veya yangının yakınında yanıcı maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, insan hücrelerindeki sentromer-kinetokोर proteinlerini tespit etmek ve kantitativleştirmek için dolaylı immünofloresan boyama kullanan protokolleri sunmaktadır. Yöntemler, bu proteinlerin lokalizasyonunu optimize etmek için çeşitli fiksasyon tekniklerini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Sinirbilim
- Protein Analizi
Arka Plan
- Sentromer-kinetokोर proteinleri hücre bölünmesinde kritik bir rol oynar.
- Bu proteinlerin lokalizasyonunu ve ekspresyon seviyelerini anlamak, hücre biyolojisi araştırması için hayati önem taşır.
- Dolaylı immünofloresan boyama, bu proteinleri incelemek için kullanılan yaygın bir tekniktir.
- Farklı fiksasyon yöntemleri bu proteinlerin tespit edilmesini etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Endojenik ve eksojenik sentromer-kinetokορ proteinlerinin lokalizasyonunu optimize etmek.
- İnsan hücrelerindeki sentromer-kinetokορlardaki protein seviyelerini kantitatifleştirmek.
- Alandaki araştırmacılar için güvenilir bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Dolaylı immünofloresan boyama teknikleri.
- Paraformaldehit, aseton veya metanol fiksasyon yöntemlerinin kullanımı.
- Kültürlenmiş hücrelerin spesifik protein konstruktları ile transfeksiyonu.
- Protein ekspresyonunu optimize etmek için inkübasyon ve ortam değişiklikleri.
Ana Sonuçlar
- Sentromer protein A ve bayraklı CENP-A proteinlerinin başarılı lokalizasyonu.
- Farklı anafazda evrelerde protein seviyelerinin kantitatifleştirilmesi.
- Çeşitli fiksasyon yöntemlerinin etkinliğinin gösterilmesi.
- Farklı deneysel ihtiyaçlara uyarlanabilecek bir protokol sağlanması.
Sonuçlar
- Çalışma, sentromer-kinetokोर proteinlerini incelemek için sağlam bir yöntem sunar.
- Bulgular, hücre bölünmesinde protein dinamiklerinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
- Protokollar, hücre biyolojisi alanında gelecekteki araştırmalarda kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative immunofluorescence analysis of centromere-kinetochore proteins enables precise interrogation of chromosome segregation mechanisms, a critical inflection point in cell division research. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for discovery-stage programs focused on mitotic regulation. Robust localization and quantification workflows for endogenous and exogenous proteins facilitate portfolio decisions in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of centromere-kinetochore protein localization in human cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic or chemical perturbations on protein targeting.
- Facilitates functional validation of candidate targets involved in chromosome segregation fidelity.
- Provides quantitative benchmarks for pathway interrogation and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immunofluorescence protocols adaptable for high-content screening of mitotic regulators.
- Ensures reproducible detection of both endogenous and exogenous protein variants across experimental conditions.
- Enables quantitative readouts suitable for comparative analysis in compound or genetic screens.
- Supports assay standardization for cross-laboratory and cross-platform studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling detection of protein mislocalization linked to chromosomal instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting biomarker quantification in engineered cell systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative protein localization data.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and downstream assay development for lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of centromere-kinetochore protein function and localization.
- Screening: Provides quantitative, reproducible immunofluorescence readouts for screening campaigns targeting mitotic pathways.
- Analytics: Supports statistical comparison of protein localization and expression across experimental groups.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by quantifying protein mislocalization relevant to chromosomal instability syndromes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in mitotic pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable protocols for reproducible immunofluorescence analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and programs based on mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to validated antibodies and high-quality imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of fixation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell models but may require optimization for specific protein tags or fixation chemistries.
- Careful handling of hazardous reagents and adherence to safety protocols are essential.
