Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Bu prosedürün genel amacı, yeni genetik mutasyonları taramak ve yeni tanımlanan Centro somal genlerinin işlevini ortaya çıkarmak için genetik olarak etiketlenmiş Centro Somal belirteçlerini kullanmaktır. Bu, üç farklı görüntüleme stratejisi ile gerçekleştirilebilir. Canlı testislerin görüntülenmesini, parça B'yi, testislerin kimyasal fiksasyonunu veya C immün boyamasını izleyin.

İşlemin ilk adımı, genetik olarak işaretlenmiş centris somal proteinlerini eksprese eden sineklerin testislerini izole etmektir ve bunu hemen görüntüleme takip edebilir. İkinci adım, testislerin kimyasal olarak sabitlenmesidir ve bunu görüntüleme de takip edebilir. Üçüncüsü, testisler immün olarak boyanabilir ve daha sonra görüntülenebilir.

Sonuçta, centri proteinlerinin yerleri floresan mikroskobu ile tanımlanır. Bu yöntem, merkezi oluşumun moleküler temeli, merkezi uzama ve merkezi ayrılma gibi merkezi bölge alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. JoVE yayını 2 6 4 1'de detaylandırıldığı gibi drosophila testislerini izole ederek başlayın.

Testisleri izole ettikten sonra, numuneyi pozitif yüklü bir cam mikroskop lamı üzerinde altı mikrolitre taze hazırlanmış oda sıcaklığında dappy boyama tamponuna daldırın. 10 dakika bekleyin, ardından boyama tamponunu iki kez değiştirerek fazla DPI'yı nazikçe yıkayın. Altı mikrolitre PBS ile.

Testisleri yıkamamaya dikkat edin. Solüsyonları fitillemek için bir parça filtre kağıdı kullanarak slayttan çıkarın. Altı mikrolitrelik hacimler, 18 milimetre kare kapak fişleri için iyi çalışır.

Artık ilgilenilen hücre tipinin yakınındaki testisleri delmek için keskin bir neşter kullanmaya yardımcı oluyor ve bu, ezme adımı sırasında bu hücreler üzerindeki baskıyı en aza indiriyor. Daha sonra numunenin üzerine dikkatlice bir kapak fişi yerleştirin ve oje ile kapatın. Daha sonra testislerin slayttaki konumunu bir kalemle işaretleyin ve görüntülemeye devam edin.

Testisleri izole ettikten sonra, pozitif yüklü bir cam mikroskop lamının üzerine altı mikrolitrelik bir PBS damlasına daldırın. Testisleri doğrusal bir şekilde veya başka bir şekilde tercih edildiği şekilde manuel olarak yönlendirin. Daha sonra PBS'yi uzaklaştırmak için bir parça filtre kağıdı kullanın ve altı mikrolitre yeni hazırlanmış sabit tamponla değiştirin.

Sabit tamponda beş dakika kaldıktan sonra, bir parça filtre kağıdı ile fitilleyin. Şimdi numuneyi 10 dakika boyunca altı mikrolitre taze hazırlanmış DPI boyama tamponuna daldırın. DPI'yı iki adet altı mikrolitre hacimli PBS ile değiştirerek yıkayın.

Daha sonra numunenin üzerine dikkatlice 18 milimetre karelik bir kapak fişi yerleştirin ve oje ile kapatın. Daha sonra slaytta testislerin yerini işaretleyin ve görüntülemeye devam edin. Bu prosedür için önce bazı silikonlu lamel fişler hazırlayın.

İlk olarak, kapak fişlerini bir davlumbaz altında oda sıcaklığında bir dakika boyunca küçük bir silikonlu çözelti tepsisine daldırın, kapak fişlerinin tamamen açıkta kaldığından ve üst üste istiflenmediğinden emin olun. Ardından, kapak fişlerini yıkama başına bir dakika boyunca üç kez suda yıkayın. Bunu, %70 etanolde bir dakikalık üç yıkama ve suda son bir dakikalık yıkama ile takip edin.

Ardından, silikonlu kapak kızaklarının bir çeker ocak altında kurumasına izin verin. Birkaç testisi inceledikten ve numune tipinde bir slayt oyduktan sonra, silikonlu örtü fişine beş mikrolitre PBS ekleyin ve testisleri PBS damlacığına aktarın. Başarıyı sağlamak için her biri tek bir testise sahip birkaç kapak fişine ihtiyaç vardır.

Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, daha önce gösterildiği gibi testislerin her birini dikkatlice delin. Şimdi, pozitif yüklü bir cam mikroskobu yavaşça yerleştirin. Kapak kızağı üzerinde kaydırın ve PBS'nin kapak kızağı ile sürgü arasında eşit şekilde dağılmasını sağlayın.

Daha sonra, testisler üzerindeki basıncı artıracak ve onları ezecek olan kapak kayması ve sürgü arasındaki fazla tamponu fitilleyin. Şimdi hazırlanan slaytı sıvı nitrojenin içine bırakın. Artık daha fazla slayt hazırlanabilir ve tanka eklenebilir.

Büyük forseps kullanmaya devam etmeden önce, slaytlardan birini sıvı nitrojenden çıkarın ve kapak fişini çıkarmak için hızlı bir şekilde bir neşter kullanın. Kapak fişi numuneden çıkarılırken numune slayt üzerinde kalmalıdır. S slaytının yüzeyine bulaştırmamaya dikkat edin.

Bu, kapak kaymasını tek bir hızlı hareketle çıkarmak için neşter kullanılarak elde edilebilir. Şimdi slaytları metanol ile doldurulmuş bir cam coplan boyama kavanozunda inkübe edin. Eksi 20 derecede 15 dakika soğutulur.

Kuluçka işleminden sonra, slaytları aseton içeren bir kavanoza aktarın. Aseton içinde 30 saniye sonra eksi 20 santigrat derecede soğutulur. Slaytları oda sıcaklığında PBS'de bir dakika yıkayın.

Daha sonra, spesifik olmayan bölgeleri engellemek için slaytları taze hazırlanmış PBST'de 10 dakika inkübe edin PBS TB inkübasyonu sırasında, bir nem odasının kuyularını suyla doldurun 10 dakika sonra, slaytları PBST'den çıkarın ve numunenin etrafındaki her slaytı kurutun. Numunenin kendisini kurutmamaya dikkat edin. Her slayt kurutulurken.

Nem haznesine yerleştirin. Antikor çözeltisini eklemeden önce numuneyi çevreleyen lam alanını kurutmak önemlidir. Bu, antikorun numune üzerinde lokalize kalmasını sağlar, böylece inkübasyon adımı sırasında kurumayı önler.

Daha sonra, taze hazırlanmış P-B-S-T-B-R içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre primer antikoru numunelerin üzerine yavaşça bırakın. Karakterize edilmemiş antikorlar için bir ila 200 seyreltme kullanın. Daha sonra, antikor çözeltisini yaymak ve antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için numunenin üzerine bir santimetre karelik bir paraform parçası yerleştirin.

Örneklerin oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin. Bir saat sonra, paraformu slaytlardan nazikçe çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra slaytları PBST'de oda sıcaklığında yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, slaytları numune yukarı bakacak şekilde nem odasına aktarın ve numunelerin üzerine PBST, BR ile seyreltilmiş 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Daha önce olduğu gibi, paraform uygulayın ve bir saat bekleyin, ikincilleri PBST'de üç beş dakikalık yıkama ve ardından PBS'de üç beş dakikalık yıkama ile yıkayın. Ardından, numunelere dokunmadan slaytları dikkatlice kurulayın.

Altı mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve standart bir kapak fişi uygulayın. Kapak fişini oje ile kapattıktan ve testislerin pozisyonunu işaretledikten sonra görüntülemeye devam edin. Sentrozomlar, spermatogenez boyunca çok sayıda morfolojik ve fonksiyonel dönüşüme uğrarlar.

Kolayca gözlemlenen bir süreç, spermatogonyada sentrozom uzamasıdır, LAR belirteci ANA bir GFP, bu olenin spermatogenez sırasında uzadığı 0.6 mikron uzunluğundaki ole işaret eder ve neredeyse olgun spermatidlerde 2.5 mikron uzunluğa ulaşır. Drosophila sperminin sentriks yağları benzersiz derecede uzun olduğundan, sentrozom uzaması ile ilgili kantitatif açıklamalar yapmak için görüntüleme kullanılabilir. Yabani tip morfolojisi ile karşılaştırıldığında, merkezi büyümeyi değiştiren çeşitli mutasyonlar tanımlanmıştır.

İki örnek her zaman erken ve mayoz bölünmenin başlangıcından önce spermatogenezi durduran, ancak bu mutantlarda yüzde uzamasını engellemeyen gülle mutasyonlarıdır Olgun spermatositin cent yağları, maksimum 1.8 mikron uzunluğa ulaşan kontrol hücrelerinin cent yağlarına kıyasla yaklaşık 2.4 mikrona kadar büyür. Ana sayfa izlendikten sonra, örneklem büyüklüğüne bağlı olarak A parçası 20 dakikada, B parçası 30 dakikada ve C parçası üç ila beş saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, uçuş sırasında sentrozomun nasıl görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.