Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi
29 Mayıs 2016
Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.
Bu minyatür glikan dizisinin genel amacı, influenza A virüsü hemaglutininlerinin özgüllüğünü ve aviditesini analiz etmektir. Bu test, influenza A virüsü reseptör bağlanması ve avidite ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tek bir tahlilde, normalde tipik glikan dizisi ve plaka bazlı tahlillerde elde edilemeyen nispi bağlanma aviditesinin yanı sıra özgüllüğü de ele alabilmemizdir.
Bu protokol, glikan örneklerinin hazırlanması ile başlar. Glikanlar için baz çözelti, yapıldığında yavaşça 8.5'lik bir pH'a titre edilmesi ve ardından bir yüzey aktif madde ilavesi verilmesi gereken bir stok baskı tamponudur. Hazırlanan baskı tamponunu kullanarak, PAA konjuge glikanları mililitre başına 100 mikrograma seyreltin.
Ardından, tek değerlikli glikanları baskı tamponunda da 100 mikromolar olacak şekilde seyreltin. Son olarak, amin ile işlevselleştirilmiş boyaların çalışma stoklarını bir mikromolarda yapın. Şimdi her bir glikan örneğinden on mikrolitreyi 384 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyusuna yükleyin.
Bu, beş slayt yazdırmak için yeterli bir çözümdür. Ayrıca on mikrolitre boya işaretleyicisini baskı plakasının bir kuyucuğuna aktarın. Önce dizileyici pimlerini ve yazdırma kafasını düzene göre konumlandırarak dizileri yazdırmaya hazırlanın.
Bu durumda, bir pin tüm örnekleri yazdırabilir. Glikan dizileri, her tarafta boş bir nokta ile çevrili altılı bloklar halinde basılmıştır. Slaytları tutmak için eldiven giyin.
Ambalajından çıkarın ve yüzeylerindeki kalıntıları ultra yüksek saflıkta nitrojen gazı ile üfleyin. Ardından, slaytları kaplanmış yüzü yukarı bakacak şekilde arrayer sahne alanına yerleştirin. Ardından, dizileyiciyi programlayın.
Bu durumda, kaynak plakaya yapılan ziyaret başına 27 nokta programlayın. Poli-L-lizin kaplı bir sürgünün dizilim olmayan alanına yerleştirilen üç ön nokta, pimin ucundaki fazla sıvıyı çıkarmak için kullanılır. Pin ziyareti başına diğer 24 nokta, altı noktayı dört çoğaltma dizisine yerleştirmek için kullanılır.
Ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir. Şimdi, çok kuyulu plakaları yazıcıya yükleyin ve dizileri yazdırmaya başlayın. Yazdırırken nemin %55 ile %65 arasında kaldığından emin olunPoli-L-lizin kaplı slaytlardaki ön noktaların görünümüne dikkat edin.
Yazdırdıktan sonra, her slaydı görsel olarak inceleyin. Hayati önem taşıyan teflon kenarlıklarındaki noktaların doğru hizalanıp hizalanmadığını kontrol edin ve doğru sayıda benekli özellik olup olmadığını kontrol edin. Noktaların birleştirilmesini homojenize etmeye yardımcı olmak için, basılı slaytları yapıldıktan hemen sonra yazdırılmış yüzleri yukarı bakacak şekilde %100 nem oranına sahip bir odaya koyun.
Bir kabı ve derme çatma bir rafı hizalamak için ıslak kağıt havlu kullanın. Nemi hapsetmek için hazneyi plastiğe sarın. Yarım saat sonra slaytları çıkarın.
Ardından, slaytları solvente dayanıklı bir kalemle numaralandırın ve gece boyunca bir kurutma kutusunda saklayın. Ertesi gün, kuvvetlice karıştırarak taze bir engelleme tamponu stoğu hazırlayın. Konsantre sodyum hidroksit kullanarak 9.2 pH'ı ayarlayın.
Ardından, slaytları bir saat boyunca tamponda inkübe edin. Bloğu çıkarmak için, slaytları çift damıtılmış suyla durulayın. Ardından, slaytları cam boyama tutucularına aktarın ve slaytları beş dakika boyunca 10 G'de kurutmak için tutucuları sallanan bir plaka tutucuya yükleyin.
Kuruduktan sonra, gerekirse slaytları eksi 20 santigrat derecede kapalı plastik torbalarda saklayın. Hazırlık olarak, daha önce olduğu gibi başka bir nemlendirme odası yapın. İmmobilize glikanları tespit etmek için, sondalama tamponunda mililitre başına 10 mikrogramda SNA ve ECA biyotinile lektinler hazırlayın ve her seyreltmeye mililitre streptavidin 555 başına iki mikrogram ekleyin.
Hemaglutininlerle lekelemek için, metin protokolünde tarif edildiği gibi dörte ikiye bir molar oranda bloke edici tamponda mililitre başına 20 mikrogramlık bir pre kompleks antikor çözeltisi yapın. Hazırlanan çözeltilerin 20 mikrolitresini 384 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın. Daha sonra, lektinleri ve hemaglutininleri uygun tamponlarında bire bir seri olarak seyreltin.
Her bir kuyucuğu 10 mikrolitre numune ve 10 mikrolitre tampon ile doldurarak sekiz seyreltme yapın. Şimdi, plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Şimdi her seyreltmeden sekiz mikrolitreyi, basılı bir slayttaki 48 mikro kuyudan birine ekleyin.
Daha sonra hazırlanan slaytı nemlendirme odasında 90 dakika inkübe edin. 90 dakika sonra, sürgüyü kenardan tutarken yıkayın; dört kez PBS-T'ye batırın, ardından dört kez PBS'ye batırın ve son olarak dört kez deiyonize suya batırın. Şimdi, slaydı daha önce olduğu gibi sıkarak kurutun.
Sıkarak kuruttuktan sonra hemen slaytı tarayın. Slaytı tarayıcıya doğru yönde dikkatli bir şekilde yüklediğinizden emin olun. Beş miliwatt'lık düşük bir lazer gücü kullanarak slaytları yinelemeli olarak tarayın, kazancı kademeli olarak %25'ten %75'e çıkarınTarama ayarlarını optimize ederken, floroforların tekrarlanan taramalarla ağartacağını unutmayın.
İlgili yazılımı kullanarak kaydedilen görüntüyü bağlama sinyalleri için analiz edin. Lekelenme desenine sahip bir dizi listesi yüklenebilir. Izgara işaretçilerinin yerleşiminde gezinmeye yardımcı olması için taramanın üzerine yerleştirin.
Ardından, nokta yoğunluklarını analiz etmek için yazılımı kullanın ve sonuçları bir elektronik tabloya veya başka bir istatistiksel pakete aktarmak için sekmeyle ayrılmış bir metin dosyası olarak kaydedin. Ortalama sinyal yoğunluğunu eksi arka planı hesaplayarak verileri analiz edin. Her örnek için altı çoğaltma noktasından ortalama dördünü alın, en yüksek sinyali ve en düşük sinyali dışarıda bırakın.
Ardından, sekiz protein konsantrasyonuna karşı arka plan eksi ortalama ortalama sinyalin bir çizgi grafiğini oluşturun. Doğrusal olmayan regresyon kullanarak elde edilen çizgiyi düzgünleştirin. PAA dizisi, influenza A virüsü hemaglutininlerinin reseptör bağlanma özgüllüğünü değerlendirmek için kullanıldı.
Dizi, aynı mikro kuyularda sialillenmemiş kontrolleri içeriyordu. Basılı bileşikler için bilinen özgüllüklere sahip bitki lektinleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Terminal galaktoz beta 1-4'e bağlanan ECA lektini, anacetylglukozamine bağlandı ve terminal galaktoz sialik asit ile kapatıldıysa aynı bileşiğe bağlanmadı.
Alfa 2-6'ya bağlı sialik asidi test etmek için SNA lektin kullanıldı. Beklendiği gibi, SNA yalnızca alfa 2-6 bağlı sialik asitlere bağlanır, ancak PAA'ya bağlı olmayan boya lakNAc tekrarlarına karşı PAA'ya bağlı afinitede dikkate değer farklılıklar vardır. Daha sonra, sadece alfa 2-3 bağlı sialik asitleri tanıyan bir Vietnam / 1203/04 virüsünden türetilen bir H5 hemaglutinin test edildi.
H5 hemaglutinin'in bağlanma profili, PAA'ya bağlı yapılar için daha yüksek bir avidite ile beklenen özgüllüğü gösterdi. Son olarak, bir insan mevsimsel H1N1 suşundan elde edilen H1 hemaglutinin test edildi. Beklendiği gibi, bu hemaglutinin sadece alfa 2-6 bağlı sialik asit içeren yapılara bağlanır.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, tek bir tahlilde influenza virüslerinin bağlanma özelliklerini ve göreceli avidilitelerini ortaya çıkarabilir. Bu teknik, influenza bağlama testlerinin verimliliğini büyük ölçüde artıracak ve değerli biyolojik maddelerin tüketimini azaltacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, grip A virüsü hemaglutininlerinin özgüllüğünü ve aviditesini analiz etmek için tasarlanmış minyatür bir glikan dizisi sunmaktadır. Yöntem, alıcı bağlanmasını ve aviditeyi aynı anda değerlendirmeye olanak tanır, bu tipik olarak standart testlerde elde edilemez.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Glikobilim
- Test Geliştirme
Arka Plan
- Grip A virüsü hemaglutinini, alıcı bağlanmasında kritik bir rol oynar.
- Alıcı özgüllüğünü anlamak, aşı geliştirme için hayati önem taşır.
- Geleneksel testler genellikle hem aviditeyi hem de özgüllüğü aynı anda ölçme yeteneğinden yoksundur.
- Testlerin minyatürleştirilmesi, verimi artırabilir ve reaktif maliyetlerini düşürebilir.
Çalışmanın Amacı
- Grip A virüsü analizi için minyatür bir glikan dizisi geliştirmek.
- Siyal asit reseptörleri için hemaglutininlerin aviditesini ve özgüllüğünü değerlendirmek.
- Glikan dizisi testlerinin verimini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir stoklu baskı tamponu kullanılarak glikan örneklerinin hazırlanması.
- Baskı tamponunun pH 8,5'e titrasyonu.
- PAA-konjuge glikanların 100 mikrogram/mililitreye seyreltilmesi.
- Test için 96 kuyuluk plaka formatının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Minyatür test, hemaglutinin aviditesini başarılı bir şekilde ölçer.
- Siyal asit içeren reseptörler için özgüllük etkili bir şekilde analiz edilmiştir.
- Sonuçlar, geleneksel yöntemlere kıyasla iyileştirilmiş verimlilik gösterir.
- Teknik, tek bir test içinde kapsamlı analizi mümkün kılar.
Sonuçlar
- Minyatür glikan dizisi, grip araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, alıcı etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasına olanak tanıyabilir.
- Gelecek uygulamaları, aşı geliştirme stratejilerini geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This miniaturized glycan microarray enables simultaneous assessment of influenza A virus hemagglutinin specificity and avidity, addressing a critical gap in receptor-binding analysis. By reducing reagent consumption and increasing throughput, the assay supports early-stage antiviral and vaccine development with improved predictive confidence. The format allows for efficient screening of hemagglutinin variants across sialic acid linkages, informing target validation and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates hemagglutinin binding to α2-3 and α2-6 sialic acid receptors to clarify receptor specificity and host range potential.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of PAA-linked and non-PAA-linked glycans to assess avidity differences within a single assay.
- Scientific Value: Uses plant lectins (SNA, ECA) as positive controls to validate array functionality and ensure reliable readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports serial dilution of hemagglutinins across eight concentrations to generate binding curves for avidity estimation.
- Operational Value: Miniaturized format prints 48 arrays per slide, equivalent to 18 conventional 96-well plates, significantly reducing sample and reagent use.
- Scientific Value: Allows simultaneous testing of six glycan-binding proteins at eight dilutions across six different glycans, including non-sialylated controls.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assesses binding profiles of hemagglutinins from avian (H5) and human seasonal (H1N1) strains to evaluate receptor adaptation trends.
- Operational Value: Enables rapid comparison of binding specificity and relative avidity between viral strains to inform preclinical risk assessment.
- Scientific Value: Includes non-sialylated controls in each microwell to distinguish specific from nonspecific binding, improving data interpretability.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, providing quantitative binding data that supports go/no-go decisions in influenza therapeutic and vaccine programs.
- Discovery Biology: Tests hemagglutinin-receptor interactions to clarify mechanistic basis of viral entry and host specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts after blocking, incubation, washing, and scanning steps.
- Analytics: Generates signal intensity data averaged from replicate spots, enabling nonlinear regression and avidity modeling.
- Translational Research: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes such as receptor adaptation and cross-species transmission potential.
- Enterprise Reuse: The printed slide format allows for storage, batch processing, and reuse across multiple hemagglutinin screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides dual readouts of specificity and avidity, reducing mechanistic ambiguity in hemagglutinin-receptor interactions.
- Operational Value: Standardizes glycan presentation via PAA conjugation and controlled printing, enhancing assay reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates screening timelines and reduces costs, improving capital efficiency in early influenza research.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of hemagglutinin targets based on receptor binding profiles and avidity metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in glycan chemistry, microarray printing, and fluorescence detection.
- Dependent on arrayer precision, humidity control (55–65% during printing), and proper slide handling to ensure spot integrity.
- Necessitates standardized blocking, probing, and washing protocols to minimize background and ensure specific signal detection.
- Requires calibration of scanning settings (low laser power, incremental gain) to avoid fluorophore bleaching while maximizing sensitivity.
- Limited to soluble glycan-binding proteins; not suitable for intact virions or membrane-bound complexes without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Glycan Preparation and Plate Setup
1:56
Printing the Arrays
3:49
Humidifying, Numbering, and Blocking the Arrays
5:10
Analyzing Glycan Binding Proteins
6:55
Slide Scanning and Analysis
8:21
Results: Polyacrylamide (PAA) Array Specificity and Discrimination
10:00
Conclusion
