Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Bu minyatür glikan dizisinin genel amacı, influenza A virüsü hemaglütininlerinin özgünlüğünü ve aviditesini analiz etmektir. Bu analiz, influenza A virüsünün reseptör bağlanması ve aviditesi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tipik glikan dizisi ve plaka tabanlı analizlerde normalde elde edilemeyen özgünlük ile göreceli bağlanma aviditesinin tek bir analizle belirlenebilmesidir.

Bu protokol, glikan örneklerinin hazırlıkları ile başlar. Glikanlar için temel çözelti, hazırlandığında pH değeri yavaşça 8.5'e titre edilmeli ve ardından surfaktan eklenmelidir. Hazırlanan baskı tamponunu kullanarak, PAA-konjuge glikanları mililitrede 100 mikrogram olacak şekilde seyreltin.

Ardından, monovalent glikanları baskı tamponunda 100 micromolar olacak şekilde seyreltin. Son olarak, amin-fonksiyonalize boyaların bir micromolar konsantrasyonunda çalışma stoklarını hazırlayın. Şimdi, her bir glikan örneğinden on microliter alarak 384 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plağının kuyucuklarına yükleyin.

Bu miktar, beş lam basmak için yeterli çözeltidir. Ayrıca, boya işaretleyiciden on mikrolitreyle baskı plakasının bir kuyusuna aktarın. Öncelikle arrayer pinlerini ve baskı kafasını düzene göre konumlandırarak dizileri basmak için hazırlık yapın.

Bu durumda, tek bir pin tüm örnekleri basabilir. Glikan dizileri, her tarafı boş bir alanla çevrili altışar bloklar halinde basılır. Lamlara dokunmak için eldiven takın.

Bunları paketlerinden çıkarın ve yüzeylerindeki tüm kalıntıları ultra yüksek saflıktaki azot gazı ile temizleyin. Ardından, lamları kaplı yüzeyleri yukarı gelecek şekilde arrayer tablasına yerleştirin. Daha sonra, arrayer cihazını programlayın.

Bu durumda, kaynak plakaya ziyaret başına 27 nokta programlayın. Poli-L-lizin kaplı bir slaytın dizi dışı alanına yerleştirilen üç ön nokta, pin ucundaki fazla sıvıyı gidermek için kullanılır. Pin ziyareti başına diğer 24 nokta ise dört tekrarlı dizide altışar nokta yerleştirmek için kullanılır.

Ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir. Şimdi, çok kuyucuklu plakaları yazıcıya yerleştirin ve dizilerin basım işlemini başlatın. Basım sırasında nemin %55 ile %65 arasında kaldığından emin olun. Poli-L-lizin kaplı lamlar üzerindeki ön lekelerin görünümüne dikkat edin.

Yazdırma işleminden sonra her bir lamı görsel olarak inceleyin. Hayati öneme sahip olan noktaların teflon sınırlar içindeki doğru hizalamasını ve basılan özelliklerin sayısının doğruluğunu kontrol edin. Noktaların tutunmasını homojen hale getirmeye yardımcı olmak için, basılan lamları hazırlama işleminin hemen ardından basılı yüzeyleri yukarı bakacak şekilde %100 nemli bir hazneye yerleştirin.

Bir kabı ve derme çatma bir rafı astarlamak için ıslak kağıt havlular kullanın. Nemi hapsetmek için hazneyi plastikle sarın. Yarım saat sonra lamları çıkarın.

Ardından, lamları solvente dayanıklı bir kalemle numaralandırın ve bir gece boyunca desikatörde saklayın. Ertesi gün, kuvvetli karıştırma ile taze bir bloklama tamponu stoku hazırlayın. Konsantre sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 9.2'ye ayarlayın.

Ardından, lamları bir saat boyunca tampon çözeltide inkübe edin. Bloklamayı kaldırmak için lamları çift distile su ile durulayın. Daha sonra, lamları cam boyama tutucularına aktarın ve lamları 10 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyerek kurutmak için tutucuları döner plaka tutucuya yerleştirin.

Kuruduktan sonra, gerekirse lamları kapalı plastik torbalarda -20 °C'de saklayın. Hazırlık aşamasında, daha önce yapıldığı gibi bir nemlendirme kabı daha hazırlayın. İmmobilize edilen glikanları tespit etmek için, probing tamponunda 10 µg/mL konsantrasyonunda SNA ve ECA biyotinize lektinleri hazırlayın ve her dilüsyona 2 µg/mL streptavidin 555 ekleyin.

Hemaglutininlerle boyama yapmak için, metin protokolünde açıklandığı üzere, bloklama tamponu içerisinde dört-iki-bir molar oranında ön kompleks antikorun 20 microgram per milliliter çözeltisini hazırlayın. Hazırlanan çözeltilerden 20 microliters miktarını 384 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara aktarın. Ardından, lektinleri ve hemaglutininleri uygun tamponlarında bir-bir oranında seri olarak seyreltin.

Her bir kuyucuğu 10 µL örnek ve 10 µL tampon ile doldurarak sekiz seyreltme hazırlayın. Ardından, plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Şimdi, her bir seyreltmeden sekiz µL'yi basılı bir slayt üzerindeki 48 mikro kuyuya ekleyin.

Ardından, hazırlanan lamı nemlendirme odasında 90 dakika boyunca inkübe edin. 90 dakika sonra, lamı kenarından tutarak yıkayın; lamı dört kez PBS-T'ye, ardından dört kez PBS'ye ve son olarak dört kez deiyonize suya daldırın. Şimdi, lamı daha önce yaptığınız gibi santrifüjle kurutun.

Santrifüjle kuruttuktan sonra, lamı hemen tarayın. Lamın tarayıcıya doğru yönde ve dikkatlice yerleştirildiğinden emin olun. Beş milliwatt'lık düşük bir lazer gücü kullanarak, kazancı (gain) kademeli olarak %25'ten %75'e artırarak lamları tekrarlanan şekilde tarayın. Tarama ayarlarını optimize ederken, floroforların tekrarlanan taramalarla solduracağını (bleaching) unutmayın.

İlişkili yazılımı kullanarak kaydedilen görüntüdeki bağlanma sinyallerini analiz edin. Noktalama desenini içeren bir dizi listesi yüklenebilir. Izgara işaretçilerinin yerleşimini belirlemeye yardımcı olması için bunu taramanın üzerine yerleştirin.

Ardından, spot yoğunluklarını analiz etmek için yazılımı kullanın ve sonuçları, bir hesap tablosuna veya başka bir istatistik paketine aktarmak üzere sekmeyle ayrılmış bir metin dosyası olarak kaydedin. Verileri, ortalama sinyal yoğunluğundan arka planı çıkararak analiz edin. Her örnek için altı replika spotun dördünün ortalamasını alın; en yüksek ve en düşük sinyalleri hariç tutun.

Ardından, sekiz protein konsantrasyonuna karşı, arka plan çıkarılmış ortalama sinyal değerlerinin bir çizgi grafiğini oluşturun. Elde edilen çizgiyi doğrusal olmayan regresyon kullanarak düzleştirin. PAA dizisi, influenza A virüsü hemaglutininlerinin reseptör bağlanma özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılmıştır.

Dizi, aynı mikrokuyucuklarda siyallanmamış kontrolleri de içeriyordu. Basılan bileşiklere yönelik spesifiteleri bilinen bitki lektinleri pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. ECA lektini, N-asetilglukozamine beta 1-4 bağlanan terminal galaktoza bağlanmış olup, terminal galaktoz siyalik asit ile kapatılmışsa aynı bileşiğe bağlanmamıştır.

Alfa 2-6 bağlı siyalik asidi test etmek için SNA lektini kullanılmıştır. Beklendiği üzere SNA, yalnızca alfa 2-6 bağlı siyalik asitlere bağlanmış; ancak PAA bağlı lacNAc tekrarları ile PAA bağlı olmayan lacNAc tekrarları için afinitesinde belirgin farklılıklar göstermiştir. Ardından, yalnızca alfa 2-3 bağlı siyalik asitleri tanıyan, Vietnam/1203/04 virüsünden türetilmiş bir H5 hemaglutinin test edilmiştir.

H5 hemaglutininin bağlanma profili, PAA bağlantılı yapılara karşı daha yüksek bir avidite ile beklenen özgüllüğü göstermiştir. Son olarak, insan mevsimsel H1N1 suşundan elde edilen H1 hemaglutinin test edilmiştir. Beklendiği üzere, bu hemaglutinin yalnızca alfa 2-6 bağlantılı siyalik asit içeren yapılara bağlanmıştır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, tek bir analizle influenza virüslerinin bağlanma özgüllüklerini ve göreceli aviditelerini ortaya çıkarabilir. Bu teknik, değerli biyolojik materyallerin tüketimini azaltmanın yanı sıra influenza bağlanma analizlerinin verimliliğini önemli ölçüde artıracaktır.