Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Bu minyatür glikan dizisinin genel amacı, influenza A virüsü hemaglutininlerinin özgüllüğünü ve aviditesini analiz etmektir. Bu test, influenza A virüsü reseptör bağlanması ve avidite ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tek bir tahlilde, normalde tipik glikan dizisi ve plaka bazlı tahlillerde elde edilemeyen nispi bağlanma aviditesinin yanı sıra özgüllüğü de ele alabilmemizdir.

Bu protokol, glikan örneklerinin hazırlanması ile başlar. Glikanlar için baz çözelti, yapıldığında yavaşça 8.5'lik bir pH'a titre edilmesi ve ardından bir yüzey aktif madde ilavesi verilmesi gereken bir stok baskı tamponudur. Hazırlanan baskı tamponunu kullanarak, PAA konjuge glikanları mililitre başına 100 mikrograma seyreltin.

Ardından, tek değerlikli glikanları baskı tamponunda da 100 mikromolar olacak şekilde seyreltin. Son olarak, amin ile işlevselleştirilmiş boyaların çalışma stoklarını bir mikromolarda yapın. Şimdi her bir glikan örneğinden on mikrolitreyi 384 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyusuna yükleyin.

Bu, beş slayt yazdırmak için yeterli bir çözümdür. Ayrıca on mikrolitre boya işaretleyicisini baskı plakasının bir kuyucuğuna aktarın. Önce dizileyici pimlerini ve yazdırma kafasını düzene göre konumlandırarak dizileri yazdırmaya hazırlanın.

Bu durumda, bir pin tüm örnekleri yazdırabilir. Glikan dizileri, her tarafta boş bir nokta ile çevrili altılı bloklar halinde basılmıştır. Slaytları tutmak için eldiven giyin.

Ambalajından çıkarın ve yüzeylerindeki kalıntıları ultra yüksek saflıkta nitrojen gazı ile üfleyin. Ardından, slaytları kaplanmış yüzü yukarı bakacak şekilde arrayer sahne alanına yerleştirin. Ardından, dizileyiciyi programlayın.

Bu durumda, kaynak plakaya yapılan ziyaret başına 27 nokta programlayın. Poli-L-lizin kaplı bir sürgünün dizilim olmayan alanına yerleştirilen üç ön nokta, pimin ucundaki fazla sıvıyı çıkarmak için kullanılır. Pin ziyareti başına diğer 24 nokta, altı noktayı dört çoğaltma dizisine yerleştirmek için kullanılır.

Ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir. Şimdi, çok kuyulu plakaları yazıcıya yükleyin ve dizileri yazdırmaya başlayın. Yazdırırken nemin %55 ile %65 arasında kaldığından emin olunPoli-L-lizin kaplı slaytlardaki ön noktaların görünümüne dikkat edin.

Yazdırdıktan sonra, her slaydı görsel olarak inceleyin. Hayati önem taşıyan teflon kenarlıklarındaki noktaların doğru hizalanıp hizalanmadığını kontrol edin ve doğru sayıda benekli özellik olup olmadığını kontrol edin. Noktaların birleştirilmesini homojenize etmeye yardımcı olmak için, basılı slaytları yapıldıktan hemen sonra yazdırılmış yüzleri yukarı bakacak şekilde %100 nem oranına sahip bir odaya koyun.

Bir kabı ve derme çatma bir rafı hizalamak için ıslak kağıt havlu kullanın. Nemi hapsetmek için hazneyi plastiğe sarın. Yarım saat sonra slaytları çıkarın.

Ardından, slaytları solvente dayanıklı bir kalemle numaralandırın ve gece boyunca bir kurutma kutusunda saklayın. Ertesi gün, kuvvetlice karıştırarak taze bir engelleme tamponu stoğu hazırlayın. Konsantre sodyum hidroksit kullanarak 9.2 pH'ı ayarlayın.

Ardından, slaytları bir saat boyunca tamponda inkübe edin. Bloğu çıkarmak için, slaytları çift damıtılmış suyla durulayın. Ardından, slaytları cam boyama tutucularına aktarın ve slaytları beş dakika boyunca 10 G'de kurutmak için tutucuları sallanan bir plaka tutucuya yükleyin.

Kuruduktan sonra, gerekirse slaytları eksi 20 santigrat derecede kapalı plastik torbalarda saklayın. Hazırlık olarak, daha önce olduğu gibi başka bir nemlendirme odası yapın. İmmobilize glikanları tespit etmek için, sondalama tamponunda mililitre başına 10 mikrogramda SNA ve ECA biyotinile lektinler hazırlayın ve her seyreltmeye mililitre streptavidin 555 başına iki mikrogram ekleyin.

Hemaglutininlerle lekelemek için, metin protokolünde tarif edildiği gibi dörte ikiye bir molar oranda bloke edici tamponda mililitre başına 20 mikrogramlık bir pre kompleks antikor çözeltisi yapın. Hazırlanan çözeltilerin 20 mikrolitresini 384 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın. Daha sonra, lektinleri ve hemaglutininleri uygun tamponlarında bire bir seri olarak seyreltin.

Her bir kuyucuğu 10 mikrolitre numune ve 10 mikrolitre tampon ile doldurarak sekiz seyreltme yapın. Şimdi, plakayı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Şimdi her seyreltmeden sekiz mikrolitreyi, basılı bir slayttaki 48 mikro kuyudan birine ekleyin.

Daha sonra hazırlanan slaytı nemlendirme odasında 90 dakika inkübe edin. 90 dakika sonra, sürgüyü kenardan tutarken yıkayın; dört kez PBS-T'ye batırın, ardından dört kez PBS'ye batırın ve son olarak dört kez deiyonize suya batırın. Şimdi, slaydı daha önce olduğu gibi sıkarak kurutun.

Sıkarak kuruttuktan sonra hemen slaytı tarayın. Slaytı tarayıcıya doğru yönde dikkatli bir şekilde yüklediğinizden emin olun. Beş miliwatt'lık düşük bir lazer gücü kullanarak slaytları yinelemeli olarak tarayın, kazancı kademeli olarak %25'ten %75'e çıkarınTarama ayarlarını optimize ederken, floroforların tekrarlanan taramalarla ağartacağını unutmayın.

İlgili yazılımı kullanarak kaydedilen görüntüyü bağlama sinyalleri için analiz edin. Lekelenme desenine sahip bir dizi listesi yüklenebilir. Izgara işaretçilerinin yerleşiminde gezinmeye yardımcı olması için taramanın üzerine yerleştirin.

Ardından, nokta yoğunluklarını analiz etmek için yazılımı kullanın ve sonuçları bir elektronik tabloya veya başka bir istatistiksel pakete aktarmak için sekmeyle ayrılmış bir metin dosyası olarak kaydedin. Ortalama sinyal yoğunluğunu eksi arka planı hesaplayarak verileri analiz edin. Her örnek için altı çoğaltma noktasından ortalama dördünü alın, en yüksek sinyali ve en düşük sinyali dışarıda bırakın.

Ardından, sekiz protein konsantrasyonuna karşı arka plan eksi ortalama ortalama sinyalin bir çizgi grafiğini oluşturun. Doğrusal olmayan regresyon kullanarak elde edilen çizgiyi düzgünleştirin. PAA dizisi, influenza A virüsü hemaglutininlerinin reseptör bağlanma özgüllüğünü değerlendirmek için kullanıldı.

Dizi, aynı mikro kuyularda sialillenmemiş kontrolleri içeriyordu. Basılı bileşikler için bilinen özgüllüklere sahip bitki lektinleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Terminal galaktoz beta 1-4'e bağlanan ECA lektini, anacetylglukozamine bağlandı ve terminal galaktoz sialik asit ile kapatıldıysa aynı bileşiğe bağlanmadı.

Alfa 2-6'ya bağlı sialik asidi test etmek için SNA lektin kullanıldı. Beklendiği gibi, SNA yalnızca alfa 2-6 bağlı sialik asitlere bağlanır, ancak PAA'ya bağlı olmayan boya lakNAc tekrarlarına karşı PAA'ya bağlı afinitede dikkate değer farklılıklar vardır. Daha sonra, sadece alfa 2-3 bağlı sialik asitleri tanıyan bir Vietnam / 1203/04 virüsünden türetilen bir H5 hemaglutinin test edildi.

H5 hemaglutinin'in bağlanma profili, PAA'ya bağlı yapılar için daha yüksek bir avidite ile beklenen özgüllüğü gösterdi. Son olarak, bir insan mevsimsel H1N1 suşundan elde edilen H1 hemaglutinin test edildi. Beklendiği gibi, bu hemaglutinin sadece alfa 2-6 bağlı sialik asit içeren yapılara bağlanır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, tek bir tahlilde influenza virüslerinin bağlanma özelliklerini ve göreceli avidilitelerini ortaya çıkarabilir. Bu teknik, influenza bağlama testlerinin verimliliğini büyük ölçüde artıracak ve değerli biyolojik maddelerin tüketimini azaltacaktır.