Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, enfekte farelerin hava yollarındaki influenza viral titresini etkili bir şekilde nicelendirmektir. Farelere, enfeksiyondan sonra seçilen zaman noktalarında öncelikle intranazal olarak influenza virüsü inoküle edilir.

Fareler sakrifiye edilir ve bronkoalveoler lavaj veya BAL sıvısı toplanır. Ardından, BAL sıvısı MDCK hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Enfekte olan hücreler, ardından kızılötesi konjugatlı sekonder antikorlar kullanılarak, spesifik primer antikorlar ile viral proteinlerin varlığına karşı boyanabilir.

Kızılötesi sinyaller Lycor Odyssey tarayıcı kullanılarak okunur ve viral titrasyonların belirlenmesi için Odyssey yazılımı kullanılabilir. Bir standart eğri kullanılarak, viral titrasyonların kantitatif tayini yapılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları; viral titrasyonların hassas şekilde quantify edilmesi, tekrarlanabilirliği ve bu analizi gerçekleştirmek için gereken hacmin küçük olmasıdır.

Bu teknik, klinik örneklerdeki viral titrelerin miktarını belirlemek için kullanılabildiği için çeşitli solunum yolu viral hastalıklarının teşhisi ve tedavisine yönelik olarak genişletilebilir. Viral kopya sayısı gibi ek soruları yanıtlamak için bu prosedürün ardından qPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniği uygularken, bu gelişmenin ardından titre standart kontrol virüsünü kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir.

Bu teknik, viral lojik alanındaki araştırmacıların klinik örneklerde virüs titresini araştırmasına veya viral proteinlerin Twist boyamasını yapmasına olanak sağlar. Bu teknikle uzmanlaşıldığında, işlem 17 saatte tamamlanabilir. Tam olarak şu şekilde uygulanır: Farelere intranazal yolla 30 µL steril PBS içinde 5.000 plak oluşturan birim (PFU) PR eight influenza virüsü veya negatif kontrol olarak sadece PBS enjekte edin. Ötanazi uygulanmış hayvanlardan BAL sıvısı toplamak için öncelikle toraks boşluğunu açın ve ince steril makasla trakeayı ortaya çıkarmak için trakeaya paralel bir santimetrelik bir insizyon yapın.

Trakeada küçük bir insizyon yapın, trakeaya %1 BSA içeren 0,5 mililitre PBS infüze edin ve lavaj sıvısını nazikçe aspire ederek dışarı çıkarın. Lavaj sıvılarındaki viral titreleri belirlemek için BAL sıvılarını -20 °C'de saklayın. İlk olarak 5 milyon MDCK hücresini, bir T 75 flask içinde 20 mililitre komple RPMI'da 37 °C'de gece boyunca kültüre edin; ertesi gün hücreleri hasat edin ve optik düz tabanlı siyah 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 10.000 hücre olacak şekilde ekleyin.

Ardından, inkübasyonun ardından plak 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Süpernatan nazikçe aspire edilir ve hücreler, FBS yerine %0,2 BSA içeren serumsuz ancak tamamlanmış DMEM ile iki kez yıkanır. Hücreler yıkandıktan sonra, her kuyucuğa 50 µL BAL sıvısı veya bilinen konsantrasyonda virüs içeren 50 µL süspansiyon eklenir.

Ardından, viral tutunma, giriş ve replikasyonu artırmak için her kuyucuğa 0,2 µg/mL konsantrasyonunda TPCK işlem görmüş tripsin içeren DMEM besiyerinden 50 µL ekleyin. Virüsün absorbe olması için hücreleri 37 °C'de bir saat inkübe edin. Daha sonra, her kuyucuğa 100 µL FBS içeren tamamlanmış RPMI ekleyin ve enfeksiyonun yayılmasına izin vermek için hücreleri gece boyunca kültüre edin; gece boyunca süren inkübasyonu takip edin.

Hücreleri 100 µL %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın. Hücreler yıkandıktan sonra, hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 100 µL %1 paraformaldehit ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, kuyucuk başına 100 µL %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın ve bloklama için hücreleri 30 dakika daha inkübe edin. Hücreler bloklandıktan sonra, kuyucuk başına 1:1000 oranında seyreltilmiş 50 µL primer antiviral M two antikoru ekleyin ve mevcut viral proteinleri boyamak için plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri üç kez %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın ve 1:200 seyreltmede kuyucuk başına 100 µL kızılötesi boya konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında karanlıkta bir saat inkübe edin. Hücreler boyandıktan sonra, önceki adımlarda olduğu gibi onları üç kez yıkayın.

Ardından plakaları Licor Odyssey kızılötesi tarayıcının okuma cam platformuna yerleştirin. Licor Odyssey yazılımını kullanarak okuyucuda 96 kuyucuklu plaka ayarını seçin. Boş negatif kontrol kuyucuklarını belirleyin, ardından tüm plakanın floresansını nicelendirin.

Otomatik şekil aracını kullanarak, bir test kuyusunun ortasındaki ilgi bölgesini (ROI) çizin. Deney için bazal floresans değerini belirlemek amacıyla, negatif kontrol kuyusundaki ROI'yi kullanın. Ardından, kuyu genelindeki floresans şiddetini ölçmek için Odyssey yazılımı tarafından sağlanan iki karşıt artı işaretini (cross hairs) ROI içine yerleştirin.

Ardından, tespit için 780 nanometre kanalını ve referans dalga boyu olarak 680 nanometreyi kullanarak plakayı tarayın. Okuma komutu etkinleştirildiğinde, ROI'nin tekdüze aralıklarındaki floresan yoğunlukları ölçülecektir. Daha sonra toplanan veri noktaları entegre edilecektir.

Standart sapma çarpanı, ROI'ye dahil edilen baz çizgi üzerindeki sinyal seviyesini belirleyecektir; hesaplamalar için entegre yoğunluk seçeneğinin seçildiğinden emin olun, çünkü bu seçenek tanımlanan alanlar için boyutundan bağımsız olarak net piksel hacmini temsil eder. Arka plan floresansı, yalancı enfekte kontrollerden nicelendirilecek ve test kuyucuklarındaki entegre yoğunluğu tahmin etmek için kullanılacaktır. Titre edilmiş virüsün seri dilüsyonlarını içeren duble kuyucuklardan elde edilen kızılötesi floresans, bir standart eğri oluşturmak için kullanılır.

Standart eğri daha sonra enfekte farelerden alınan BAL sıvısının titraşlarını belirlemek için kullanılabilir. Bu deneyde, ikinci ve dördüncü günlerde viral yükte anlamlı bir artış gözlemlenmiştir. Burada gösterildiği üzere, enfeksiyon sonrası virüs 10. güne kadar temizlenmiştir.

Bu analiz kullanılarak ölçülen viral titrelere, enfeksiyon sonrası farelerdeki kilo kaybı ile güçlü bir korelasyon vardır. Bu teknik insan örneklerine de uygulanabilir. Burada, bir insan burun sürüntüsündeki H1N1 virüsünün kantifikasyonu gösterilmiştir.

Buradaki saptama sınırı 10³ TCID veya doku kültürü enfeksiyöz dozudur. Bu videoyu izledikten sonra, kızılötesi boya tabanlı analiz kullanarak influenza virüs titresinin nasıl tahmin edileceği konusunda da iyi bir anlayışa sahip olacaksınız. Bu tekniğin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir çünkü core imager kullanımı zor olabilir; bu video, 96 veya 384 kuyucuklu plakalarda viral titreleri nicelleştirmek için kullandığımız yöntemleri basitleştirmeye ve göstermeye yardımcı olacaktır.

Ve son olarak, virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.