Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, enfekte farelerin hava yollarındaki influenza viral titrelerini verimli bir şekilde ölçmektir. Fareler ilk olarak seçilen zamanda intranazal olarak influenza virüsü ile aşılanır. Enfeksiyondan sonraki noktalar.

M feda edilir ve bronkoalveoler lavaj veya BAL sıvısı toplanır. Daha sonra, BAL sıvısı MDCK hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Enfekte hücreler daha sonra spesifik primer antikorlar ve ardından kızılötesi konjuge sekonder antikorlar kullanılarak viral proteinlerin varlığı için boyanabilir.

Kızılötesi sinyaller Lycor Odyssey tarayıcısı kullanılarak okunur ve Odyssey yazılımı viral titreleri belirlemek için kullanılabilir. Standart bir eğri kullanılarak, viral titrelerin kantitatif tayini elde edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajları, viral titrelerin kesin olarak ölçülmesi, tekrarlanabilirlik ve bu testi gerçekleştirmek için gereken küçük hacimdir.

Bu tekniğin etkileri, çeşitli solunum yolu viral hastalıklarının tanı ve tedavisine doğru genişletilebilir, çünkü bu prosedürü takiben klinik örneklerde viral titreleri ölçmek için kullanılabilir. Viral kopya sayısı gibi ek soruları yanıtlamak için QPCR gibi başka bir yöntem de uygulanabilir. Bu tekniği denerken, bu gelişmeden sonra titre standart kontrol virüsünü kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu teknik, viral mantık alanındaki araştırmacının klinik örneklerde virüs titresi veya büküm lekesi viral proteinini keşfetmesinin yolunu açar. Bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik 17 saat içinde uygulanabilir. 30 mikrolitre steril PBS'de 5.000 platform ünitesi veya PR sekiz influenza virüsünün PFU'su ile fareleri intranazal olarak veya önce ötenazi hayvanlardan BAL sıvısı toplanması için negatif bir kontrol olarak tek başına PBS ile hassas bir şekilde enfekte etti, göğüs boşluğunu kesin ve ince steril makasla ortaya çıkarmak için trakeaya paralel bir santimetre kesi yapın.

Trakeada küçük bir kesi yapın, trakeayı 0.5 mililitre% 1 BSA içeren PBS ile infüze edin ve lavaj sıvısını nazikçe aspire edin. Lavaj sıvılarındaki viral titreleri ölçmek için BAL sıvılarını eksi 20 santigrat derecede saklayın. İlk kültür: Ertesi gün 37 santigrat derecede bir T 75 şişesinde 20 mililitre tam RPMI'de 5 milyon MDCK hücresi, hücreleri hasat edin ve bunları kuyucuk başına 10.000 hücrede optik düz tabanlı siyah 96 oyuklu bir plakada plakalayın.

Daha sonra, inkübasyonu takiben plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve hücreleri FBS yerine% 0.2 BSA içeren tam ancak serumsuz DMEM'de iki kez yıkayın. Hücreler yıkandıktan sonra, kuyucuk başına 50 mikrolitre BAL sıvısı veya 50 mikrolitre bilinen bir virüs konsantrasyonu içeren bir süspansiyon ekleyin.

Daha sonra, viral bağlanmayı, girişi ve replikasyonu arttırmak için mililitre başına 0.2 mikrogramda TPCK ile muamele edilmiş tripsin içeren ortam olan DMEM kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyin. Virüsün emmesine izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, gece boyunca inkübasyonun ardından enfeksiyonun yayılmasına izin vermek için hücreleri gece boyunca kültürleyen her bir kuyucuğa tam RPMI içeren 100 mikrolitre FBS ekleyin.

Hücreleri 100 mikrolitre% 1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın. Hücreler yıkandıktan sonra,% 1 para formaldehit oyuğu başına 100 mikrolitre ekleyin ve hücreleri sabitlemek için plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin Daha sonra% 1 B-S-A-P-B-S kuyusu başına 100 mikrolitre ile yıkayın ve hücreleri bloke etmek için 30 dakika daha inkübe edin. Hücreler bloke edildikten sonra, bir ila 1000 oranında seyreltilmiş birincil antiviral M iki antikorun kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyin ve inkübasyondan sonra mevcut olan herhangi bir viral proteini lekelemek için plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, hücreleri %1 B-S-A-P-B-S'de üç kez yıkayın ve bunları oda sıcaklığında bir saat boyunca bir ila 200 seyreltmede kızılötesi boya konjuge ikincil antikor kuyusu başına 100 mikrolitre ile inkübe edin Karanlıkta, hücreler lekelendikten sonra, daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın.

Ardından plakaları Licor Odyssey kızılötesi tarayıcının okuma camı platformuna yerleştirin. Licor Odyssey yazılımını kullanarak okuyucuda 96 kuyulu plaka ayarını seçin. Boş negatif kontrol kuyularını tanımlayın, ardından tüm plakadaki floresanı ölçün.

Bir testin ortasında ilgilenilen bölgeyi veya yatırım getirisini çizmek için otomatik şekillendirme aracını kullanın. Negatif bir kontrolden gelen yatırım getirisini iyi kullanın. Tahlil için temel floresan değerini ayarlamak için, kuyu boyunca floresansın yoğunluğunu ölçmek için ROI içinde Odyssey yazılımı tarafından sağlanan iki karşıt artı işaretini tanıtın.

Ardından, algılama için 780 nanometre kanalını ve referans dalga boyu olarak 680 nanometreyi kullanarak plakayı tarayın. Okuma komutu etkinleştirildikten sonra, ROI'nin tekdüze aralıklarındaki floresan yoğunlukları ölçülecektir. Ve sonra toplanan veri noktaları entegre edildi.

Bir standart sapma çarpanı, ROI'ye dahil edilen taban çizgisi üzerindeki sinyal seviyesini belirleyecektir, boyuttan bağımsız olarak tanımlanmış alanlar için net piksel hacmini temsil ettiğinden, hesaplamalar için entegre yoğunluk seçeneğini seçtiğinizden emin olun. Arka plan floresansı, sahte enfekte kontrollerden ölçülecek ve test kuyularındaki entegre yoğunluğu tahmin etmek için kullanılacaktır. Titre edilmiş virüsün seri seyreltmelerini içeren çift kuyulardan gelen kızılötesi floresan, standart bir eğri oluşturmak için kullanılır.

Standart eğri daha sonra enfekte farelerden alınan BAL sıvısının titrelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu deneyde, ikinci ve dördüncü günlerde viral yükte önemli bir artış gözlendi. Enfeksiyon sonrası virüs, burada gösterildiği gibi 10. güne kadar temizlendi.

Bu test kullanılarak ölçülen viral titreler, enfeksiyonu takiben fare kilo kaybı ile iyi korelasyon gösterir. Bu teknik insan örneklerine de uygulanabilir. Burada gösterilen, bir insan burun sürüntüsünden H bir N bir virüsün bir miktar tayinidir.

Buradaki tespit sınırı, üçüncü TCID veya doku kültürü enfektif dozu 10 ila 3'tür. Bu videoyu izledikten sonra, kızılötesi kalıp tabanlı tahlil kullanarak influenza virüsü titresinin nasıl tahmin edileceğini de iyi anladınız. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü corp görüntüleyiciyi kullanmak zor olabilir ve bu, 96 veya 384 oyuklu bir plakada viral titreleri ölçmek için yöntemlerimizi basitleştirmeye ve göstermeye yardımcı olacaktır.

Ve son olarak, virüsle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi öncüllerin alınması gerektiğini unutmayın.