Name: Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin, enfekte farelerdeki bronkoalveoler lavaj sıvısından H1N1 virüsünü yüksek hassasiyetle tespit etmek için kızılötesi boya bazlı görüntüleme sistemini. Bu yöntem, viral yükleri hassas bir şekilde ölçerek solunum yolu hastalıklarının teşhisinde ve tedavisinde araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmanın bir parçası NIH hibe R01 A1064826-01 U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (SM için) desteklenir. Biz yazının eleştiri, tartışma ve teknik yardım için Tina Heil bizim laboratuar üyelere teşekkür etmek isterim. Biz David Bina, Milwaukee Sağlığı Anabilim Dalı Laboratuvarı virüs kültürü ve PCR için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+%28PR8%29+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li>
<li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+%28H5N1%29+viruses+using+a+pyrosequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Directigen+flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li>
<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
<li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR%3A+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+%28FLU+OIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+into+the+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li>
<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
</ol>

Biz ifşa şey var.

Güneydoğu Asya&#39;da kuş gribi ve domuz gribi salgını küresel bir korku son salgın patlak kamu sağlığı ve güvenliği için çok büyük endişeleri empoze. Eleştirel odak noktası mevcut ve yeni influenza virüs suşları için aşılar üretmek ithaf edilmiştir. Hassas algılama ve doğru viral titresinde hesaplamalar için hızlı, yüksek verimli teknolojilerin mevcudiyeti muazzam tedavi artıracaktır. Virüs titresi hesaplamak için kullanılan en sık kullanılan teknikler, plak oluşumu ve grip hemaglütinasyon testleri içerir. Plak oluşturan deneyi ilk bakteriyofaj titreleri tahmin etmek için geliştirilen ve hayvan viral titreler 4 hesaplamak için Renato Dulbecco tarafından kabul edilmiştir. ,, Bu assay gerçekleştirdiğinizde etmek için&gt;,, 6-well plakaları in,,, influenza hisse senedi ya da hayvansal numuneler:, bu tür BAL akışkan gibi of 10-fold seyreltiler hazırlanır uygulanır ve 0,1 ml &#39;&gt; alikotları,,, MDCK hücreleri of monolayer hızda aktarılması gibi son derece önemli özellikler inoküle edilmiş uygulanır. Virüs reklam takip MDCK hücreleri üzerine adsorbe izin verilirbir besin ortamında ve agaroz olduğunu belirtmektedir. İnkübasyon sırasında, orijinal enfekte olmuş hücrelerde sadece komşu hücrelere yayılan viral döl bırakın. : Sitopatojenik bir efekti:,, influenza viral bir enfeksiyon of,, bir teşekkür plaketi olarak adlandırılan, enfekte olmuş hücreleri of, bir dairesel bir bir bir dilimini oldu üretir. Her plak muhtemelen virüs çoğaltma tarafından tek bir virüs parçacık tek bir hücrenin enfeksiyonu sonrası oluşur. Canlı hücreler ve plaklar arasındaki kontrastı kristal viyole gibi boyalarla artabilir. Bu testin önemli bir dezavantajı, tekrarlanabilirlik ve deneyler içinde büyük farklılıklar olmaması. ,,, Influenza viral bir titresinde belirlemek etmek kullanılan Başka bir assay,,, bir hemaglüsinasyon assay konumundadır. ,,, Influenza virüs of yüzey on The hemagglutinin bir protein şimdiki, verimli bir şekilde,,,,, memeli ve avian bir, kırmızı kan hücreleri 1 on N-asetilnöraminik ait, asit-ihtiva eden proteinleri etmek de de bağlar. ,,,,: Influenza virus: ve da aglütinasyon, eritrositlerde tarihleri ​​arasında Bu, bir etkileşim,,, bir lattice of arama formunu, in agglutination etmek yol açar. The Lagglutinasyon evel test örneklerinde influenza virüsü titresi tahmin etmek için kullanılır. Eritrosit agglutination assay, Malzemenin, bir için, da bilinir bir virüs of titrasyon belirlemek etmek,, yalnızca olarak kullanılan edilir ve,, strain tanımlama amaçlarla için kullanılan uygulanmaz değil edebilirsiniz.. Bu deneyde canlı ve ölü virüsler arasında ayrım yapmaz bu yana, viral titreleri kesin bir hesaplama elde etmek zordur. Gribal enfeksiyonlar Mevcut klinik tanı, serolojik testler, polimeraz zincir reaksiyonu, doğrudan numune immünfloresans ve hücre kültürü 1,6 dayanmaktadır. Burada açıklanan yeni bir yöntem, aynı zamanda klinik ve laboratuvar tanı potansiyeline sahiptir. Grip algılama kitleri Directigen FLU-A,, nükleoprotein 7 gibi viral antijen tespit etmek için (BD Biosciences, San Jose, CA) ve BinaxNow (Binax, Inc, Scarborough, ME) kullanımı immunakromatogrfi tahlil. , Virüs tespiti, bu kitleri kullanılarak 15 dakika içinde elde edilebilir, ancak tüm olumsuz örnekleri daha s olmasıDiğer: hücre kültürü: İçerikler üzerine yöntemini kullanıcısı tarafından creened. Çeşitli çalışmalar da enfeksiyon hafif veya 8 düşük olduğunu, özellikle bu kitler düşük hassasiyet, bildirdin. Geliştirilen yöntemde, sürekli olarak virüs gibi düşük olarak 100 PFU algılar. Bu,, bulaşmasına hafif bir konumundadır hatta, ne zaman bizim tekniktir,,, klinik numuneleri in H1N1 bir virüs saptamada in yararlı bir, konumundadır, da anlaşılacağı. ,, Ya da nazofarengeal bir aspirat, numuneler doğrudan doğruya olarak analiz edildi, ya da,,,, virüs çarpma ve müteakip analizler 9, için yatkındır hücreleri of, bir monolayer üzerine inoküle edilmiş edildi nerede,, viral bir antijenleri algılamak kullanıcılar etmek A floresans-tabanlı bir yöntemini, bildirdin, edilmiştir. Bununla birlikte,, bu yöntemlerden,,, tanısal amaçlarla için sınırlıdır ve, virüs titresinde hesaplamalar için uygun bir değil şunlardır? Uygulanır. , Q-PCR ile,,,, viral bir RNA, of varlığında tanımlamak etmek yardımcı olur ve,, canlı bir virüsler of enfektivite tahmin ediyoruz değil bulunmamış. Bu testler karşılaştırıldığında, IR boya bazlı analiz sistemi, klinik ve laboratuvar örnekleri algılama ve viral titre numaralandırma, yardımcı olacaktır. Grip salgını durumunda, bukısa bir süre içinde binlerce örnek teşhis etmek önemlidir. 384-plaka ve IR tarayıcı dayalı Bizim yöntemi, bu nedenle diğer direkt floresan yöntemlerine göre daha fazla avantaj sunan bir süre (&gt; 2.000 örnekleri) 6 plakaları tarayabilir. Binlerce klinik örneklerin hızlı işlem Fizibilite testi zaman ve maliyet test değişkenliği, süresini azaltabilir. ,, Bir M2-belirli bir bir antikor of kullanımını,,,,,, H ve N proteinleri in strain farklılıkları of bağımsız bir olmanın of avantajı, sunmaktadır. M2 proteini nispeten insanlara bulaşmasını en influenza suşlarına korunur. Dolaşan lekeler için özel antikorlar sistemi ile kombine edilmesi durumunda bir virüs titresi ölçmek ve zorlanma tespit edebilir. Ancak,, M2 Amantadin benzeri ilaçlar için bir hedef olduğundan, mutantlar, burada kullanılan, mAb için bağlayıcı bir site değişebilir ortaya çıkabilir. Bu, bu ilaçlarla tedavi edilen bireylerde bu sistem için potansiyel bir sınırlama ifade eder. Çokludeneyleri,,,, test örnekleri içinde influenza titreleri numaralandırılamadı kullanıcılar etmek kullanılır uygulanır. Virüs titresi,% 50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID 50) ve yumurta allantoik sıvı tabanlı testleri hesaplamak için yaygın olarak 1,10 kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla gün gereksinimleri bu yöntemler daha az güvenilir olun. Dahası,, bu yöntemlerden, in,,,,,, plaklarla of numarasını in% 50 oranında değişikliği on dayanır hesaplamalar,, teorik bir, ancak doğru bir değil viral bir titrasyonlarını sağlamak. Plak testleri oluşturan 96 saat içinde yapılabilir, ancak tekrarlanabilirliği eksikliği, viral titre hesaplamalarda önemli bir husustur. Burada anlatılan bu tekniği birkaç belirgin avantajları vardır. İlk olarak, tutarlı sonuçlar ile yüksek oranda tekrarlanabilir bir tekniktir. İkincisi, viral titre hesaplamaları tanımlanmış standart eğrileri karşılaştırılarak floresan yoğunluklarına basit miktar dayanmaktadır. Üçüncü olarak,,, iki ya da daha fazla çok birincil antikorlar,,, verilen, bir numune in birden çok serotiplerinin tanılamanıza kullanıcılar etmek kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz. Ayrıca, IR boya-konjuge antikorların damlaark otoflöresansının değerlendirilmesi ve hücre imajlama 11, için kullanılan&gt; edilmiştir&gt; adres. Varlığı yüksek kuantum verimli endojen florofor nedeniyle yüksek hücresel otofloresans UV veya görsel radyasyon (300-600 nM&#39;den) sonuçları. Bunlar,,,, aromatik bir amino asitler, lipo-pigmentleri, pyridinic. Nükleotidlerle (NADPH.), Elastin, kollajen ve flavin koenzimlerinin şunlardır. Hücreleri of Bu, intrinsik bir bir mülkiyet,,, spesifik proteinlerin of, probes bir ekspresyonu quantify etmek gibi dolu sunucular, it zor bir,, radyasyon of, bu kaynaklardan yararlanmak olan etmek hale getirir. Kontrast yılında,, yakınındaki-IR boyalar,,, heyecanlandırabilir ve 670-1000 nm tarihleri ​​arasında yayarlar. Birçok konağın hücresel moleküllerin ve poliaromatik hidrokarbonlar bu dalga boyunda heyecanlandırmak ve düşük ışık saçılması nedeniyle, son derece düşük eşiğe yaymaz. Dahası,,, arka plan ve belirli bir bir algılama tarihleri ​​arasında window,,, büyük ölçüde,,,, yakınındaki-IR florofor gruplarının, of, bir, yüksek bir soyu tükenme katsayısı, etmek nedeniyle artırıldı edilir. , Üstün sinyal-gürültü oranı, Fotostabilite viral titreleri nicelleştirmesinde son derece uygundur. Microfl of kullanınuidic odaları robotik kontroller aracılığıyla tarama işlemi otomatik olacak ve kullanım kolaylığı ile bize son derece bulaşıcı bir klinik test etmek için izin verebilir. Böylece, bu yöntemlerin yakın IR boyaların kullanımı doku örneklerinde viral titreleri numaralandırmak için ideal ve son derece güvenilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sığır serum albümin </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virüs </td><td></td><td></td><td> Dr Thomas M Moran itibaren </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare IRDye @ 800 </td><td> LI-COR biyoloji </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 oranında seyreltildiğinde </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR tarayıcı </td><td> LI-COR-biyoloji </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-kuyu düz alt plaka </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-kuyu düz alt plaka </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM besiyeri ortamında </td><td> Invitrogen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI medyumu </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti--, M-2 antikor </td><td></td><td></td><td> Dr Thomas M Moran itibaren </td></tr><tr><td> Anti--NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Bir MTA ile elde </td></tr></tbody></table>

gribi için yüksek verimlilik tespit yöntemi

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Grip virüsü Dünyanın birçok yerlerinde her yıl morbidite ve mortalitesi yüksek derecede neden olan bir solunum yolu patojen. Bu nedenle, kesin tanı klinik örneklerden çok büyük sayıda bulaşmasını gerginlik ve hızlı yüksek verimlilik tarama pandemik enfeksiyonların yayılmasını kontrol etmek için her şeyden önemlidir. Gribal enfeksiyonlar Mevcut klinik tanı, serolojik testler, polimeraz zincir reaksiyonu, doğrudan numune immünfloresans ve hücre kültürü 1,2 dayanmaktadır. Burada, canlı grip virüsleri tespit etmek için kullanılan yeni bir teşhis tekniği geliştirme sunduk. Biz MDCK hücreleri kullanarak 4 Bu tekniğin etkinliğini test etmek için fare-uyarlanmış insan A/PR/8/34, (PR8, H1N1) virüsü 3 kullanılır. MDCK hücreleri (yanı 10, 4 ya da 5 - başı gecelik x 10 3) Mayıs,, 96 aşağıdakilerle in kültürlenen edildi - ya da,, PR8. Ve viral proteinler sentezlenir ile birlikte bulaşmışsa 384-well bir plakaları,,,,, bir IR bir dye-konjuge edilmiş sec tarafından, anti--M2 izledi kullanarak algıladı &#39;de edildisekonder antikor. , M2 5 ve - hemagglutinin 1,,,,, pek çok farklı bir tanısal deneyleri in kullanılan iki adet major işaretleyici proteinleri şunlardır. Istihdam IR-boya-konjuge sekonder antikorlar, diğer floresan boyalar ile ilişkili otofloresans en aza indirir. , Anti--M2 antikor of kullanımını,,, bize,, viral bir nicelik of, bir doğrudan bir bir bir metrik gibi antijen-belirli bir bir bir floresans bir yoğunluğunu kullanmak etmek, izin verilen. Floresan yoğunluğu numaralandırmak için, biz LI-COR Odyssey tabanlı IR tarayıcı kullanılır. Bu sistem florofor tespit ve arka plan gürültüsü onları ayırt etmek için iki kanal lazer tabanlı IR tespitlerde kullanır. Birinci kanal, 680 nm dalga boyunda heyecanlandıran ve arka plan ölçmek yardımcı olmak üzere 700 nm dalga boyunda yayar. Ikinci kanal 780 nm florofor heyecanlı bir şekilde algılar ve 800 nm dalga boyunda yayar. IR tarayıcı, PR8-enfekte MDCK hücrelerin viral titre-bağımlı parlak floresan Tarama belirtti. 10 2 -10 5 PFU itibaren virüs titresi floresans şiddetinin pozitif bir korelasyon con olabilirsistently gözlenmiştir. 10 2 -10 3 PFU PR8 viral titreler yakın-IR boyalar yüksek hassasiyet göstermiştir Minimal fakat fark pozitifliği ile tutarlı görülmektedir. Sinyal-gürültü oranı mock-enfekte veya izotip antikor tedavi MDCK hücreleri karşılaştırarak tespit edilmiştir. 96 floresan yoğunluklarına kullanarak veya 384-plaka biçimleri, standart titrasyon eğrileri inşa edilmiştir. Bu hesaplamalarda, ilk değişken İkinci değişken floresan yoğunluğu ise viral titre. Bu nedenle,, polinom viral titreleri ve floresan yoğunluklarına arasında ilişkiyi belirlemek için bir eğri-fit oluşturmak için üstel dağılım kullanılır. Topluca, IR boya bazlı protein algılama sistemi viral suşlar bulaşmasını teşhis ve hassas bulaşmasını patojenlerin titresi numaralandırmak yardımcı olabileceği sonucuna varıldı.

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

İnfluenza virüsü, dünyanın pek çok yerinde her yıl yüksek düzeyde morbidite ve mortaliteye neden olan bir solunum yolu patojenidir. Bu nedenle, ...

Bu prosedürün genel amacı, enfekte farelerin havayollarındaki influenza viral titrelerini verimli bir şekilde nicelendirmektir. Fareler, enfeksiyondan sonra seçilen zaman noktalarında önce intranazal olarak influenza virüsü ile inoküle edilir.M'ler sakrifiye edilir ve bronkoalveoler lavaj veya BAL sıvısı toplanır. Ardından, BAL sıvısı MDCK hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Enfekte olan hücreler, daha sonra spesifik primer antikorlar ve ardından kızılötesi konjuge ikincil antikorlar kullanılarak viral proteinlerin varlığına göre boyanabilir.Kızılötesi sinyaller Lycor Odyssey tarayıcı kullanılarak okunur ve viral titrelerin belirlenmesi için Odyssey yazılımı kullanılabilir. Bir standart eğri kullanılarak, viral titrelerin kantitatif tayini gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajları; viral titrelerin hassas şekilde nicelendirilmesi, tekrarlanabilirliği ve bu analizi gerçekleştirmek için gereken hacmin küçük olmasıdır.Bu tekniğin uygulamaları, bu prosedürün ardından klinik örneklerdeki viral titrelere miktar belirlemek için kullanılabildiği için çeşitli solunum yolu viral hastalıklarının teşhis ve tedavisine genişletilebilir. Viral kopya sayısı gibi ek soruları yanıtlamak için qPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu tekniği uygularken, bu geliştirmeden sonra titrel standart kontrol virüsünü kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir.Bu teknik, viral lojik alanındaki araştırmacıların klinik örneklerde virüs titresini araştırmasına veya viral proteinleri twist boyama yöntemiyle incelemesine olanak sağlar. Teknikte uzmanlaşıldıktan sonra uygulama 17 saat içinde tamamlanabilir. İşlemleleyle, farelere intranazal yolla 30 µL steril PBS içinde 5.000 plak oluşturan birim (PFU) PR eight influenza virüsü veya negatif kontrol olarak sadece PBS şeklinde enfeksiyon uygulanır. Ötanazi uygulanmış hayvanlardan BAL sıvısı toplamak için öncelikle toraks boşluğu açılır ve ince steril makasla trakeayı açığa çıkarmak için trakeaya paralel bir santimetrelik bir kesi yapılır.Trakeada küçük bir insizyon yapın, trakeaya %1 BSA içeren PBS'den 0,5 mililitre infüze edin ve lavaj sıvısını nazikçe aspire ederek dışarı alın. Lavaj sıvılarındaki viral titrelere miktar belirlemek için BAL sıvılarını -20 °C'de saklayın. İlk olarak, 5 milyon MDCK hücresini 20 mililitre tam RPMI içeren bir T 75 flask içinde 37 °C'de gece boyunca kültürleyin; ertesi gün hücreleri hasat edin ve optik düz tabanlı siyah 96 kuyucuklu plakaya her kuyucukta 10.000 hücre olacak şekilde ekleyin.Ardından, inkübasyonun ardından plak gece boyunca 37 °C'de inkübe edilir. Süpernatant nazikçe aspire edilir ve hücreler, FBS yerine %0,2 BSA içeren serumsuz ancak tam DMEM ile iki kez yıkanır. Hücreler yıkandıktan sonra, her kuyuya 50 µL BAL sıvısı veya bilinen konsantrasyonda virüs içeren 50 µL süspansiyon eklenir.Ardından, viral tutunmayı, girişi ve replikasyonu artırmak için kuyucuk başına, 0,2 micrograms per milliliter konsantrasyonunda TPCK ile işlenmiş tripsin içeren DMEM besiyerinden 50 microliters ekleyin. Virüsün absorbe olması için hücreleri 37 degrees centigrade'de bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, her kuyucuğa komplet RPMI içeren 100 microliters FBS ekleyin ve enfeksiyonun yayılmasına izin vermek için hücreleri gece boyunca kültüre edin; gece boyunca süren inkübasyonu takip edin.Hücreleri 100 µL %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın. Hücreler yıkandıktan sonra, hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 100 µL %1 paraformaldehit ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkube edin. Ardından, kuyucuk başına 100 µL %1 B-S-A-P-B-S ile yıkayın ve bloklama için hücreleri 30 dakika daha inkube edin. Hücreler bloklandıktan sonra, kuyucuk başına 1/1000 oranında seyreltilmiş 50 µL primer antiviral M2 antikoru ekleyin ve mevcut viral proteinleri boyamak için plakaları oda sıcaklığında bir saat inkube edin. İnkübasyon sonrası hücreleri %1 B-S-A-P-B-S ile üç kez yıkayın ve 1/200 oranında seyreltilmiş kuyucuk başına 100 µL kızılötesi boya konjuge ikincil antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkube edin. Hücreler boyandıktan sonra, daha önce yapıldığı gibi onları üç kez yıkayın.Ardından plakaları, Licor Odyssey kızılötesi tarayıcının okuma cam platformuna yerleştirin. Licor Odyssey yazılımını kullanarak okuyucuda 96 kuyucuklu plaka ayarını seçin. Boş negatif kontrol kuyucuklarını belirleyin ve ardından tüm plakanın floresansını miktarlandırın.Bir test kuyusunun ortasındaki ilgi bölgesini veya ROI'yi çizmek için otomatik şekil aracını kullanın. Analiz için temel floresan değerini belirlemek amacıyla, negatif kontrolden gelen bir kuyuktaki ROI'yi kullanın; ardından kuyuk boyunca floresan yoğunluğunu ölçmek için Odyssey yazılımı tarafından sağlanan iki karşıt artı göstergeyi ROI içine yerleştirin.Ardından, tespit için 780 nanometre kanalı ve referans dalga boyu olarak 680 nanometre kullanılarak plakayı tarayın. Okuma komutu etkinleştirildiğinde, ROI'nin düzenli aralıklarındaki floresan yoğunlukları ölçülecektir. Daha sonra toplanan veri noktaları entegre edilecektir.Standart sapma çarpanı, ROI'ye dahil edilecek baz çizgisi üzerindeki sinyal seviyesini belirleyecektir; hesaplamalar için lütfen entegre yoğunluk seçeneğini seçtiğinizden emin olun, çünkü bu seçenek, boyuttan bağımsız olarak tanımlanan alanlar için net piksel hacmini temsil eder. Arkaplan floresansı, yalancı enfekte kontrollerden miktarla belirlenecek ve test kuyucuklarındaki entegre yoğunluğu tahmin etmek için kullanılacaktır. Titre edilmiş virüsün seri dilüsyonlarını içeren çift kuyucuklardan elde edilen kızılötesi floresans, bir standart eğri oluşturmak için kullanılır.Standart eğri daha sonra enfekte farelerden alınan BAL sıvısının titrelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu deneyde, ikinci ve dördüncü günlerde viral yükte anlamlı bir artış gözlemlenmiştir. Burada gösterildiği üzere, enfeksiyon sonrası virüs 10. güne kadar temizlenmiştir.Bu analiz kullanılarak ölçülen viral titreler, enfeksiyon sonrası fare ağırlık kaybı ile iyi bir korelasyon göstermektedir. Bu teknik insan örneklerine de uygulanabilir. Burada, bir insan burun sürüntüsünden alınan H1N1 virüsünün kantifikasyonu gösterilmiştir.Buradaki saptama sınırı 10³ TCID veya doku kültürü enfektif dozudur. Bu videoyu izledikten sonra, kızılötesi boya tabanlı analiz kullanarak influenza virüs titresinin nasıl tahmin edileceği konusunda da iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır; çünkü Core Imager kullanımı zor olabilir ve bu anlatım, 96 veya 384 kuyucuklu plakalarda viral titrelerin miktarını belirleme yöntemlerimizi basitleştirmeye ve göstermeye yardımcı olacaktır.Ve son olarak, virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Bu çalışmada, taşınabilir bir RRT-PCR sistemi kullanarak vahşi kuşlarda kuş gribi teşhisi açıklamaktadır. Bu yöntem, bir salgın senaryosunun tipik olmayan bir laboratuar ortamında yabani kuşlar, ekrana dondurularak kurutulmuş reaktifler yararlanır. Moleküler araçlarını kullanın, hızlı tanı için doğru ve hassas alternatifler sunuyor.

Yabani Kuşlar Kuş Gribi Virüsü Hızlı Teşhis: Alanında Taşınabilir RRT-PCR ve Dondurulmuş kuru Reaktifler Kullanımı

Bu videoda, CIT50 ile viral enfeksiyonların çokluğu arasındaki korelasyonu tartışıyoruz. Virüsle enfekte olmuş hücreler sitopatik etkiler gösterir, bu da ölümlerine ve altın mikroelektrottan ayrılmalarına neden olur ve bu da empedansı azaltır.

İnfluenza Virüsünün Enfeksiyon Çeşitliliğini Ölçmek için Empedans Bazlı Hücresel Test

Video, influenza virüsleri A ve B'yi ölçmek için bir testi göstermektedir. Bu test, influenzaya özgü primerler ile çentikli endonükleaz amplifikasyonunu ve moleküler işaret probları kullanılarak hedef tespitini kullanır.

İnfluenza A ve B Virüslerini Ölçmek için Moleküler Bazlı Bir Test

Entegre mikroakışkan termoplastik çip bir moleküler tanı olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Çip nükleik asit ekstraksiyon, ters transkriptaz ve PCR gerçekleştirir. Imalatı ve yonga çalıştırmak için yöntemler tarif edilmiştir.

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Biz moleküler temelli İnfluenza A, hızlı ve B tahlil açıklar. Grip deneyi moleküler işaret probları ile hedef tespiti ve ardından influenzaya spesifik primerler ile izotermal amplifikasyon kullanılarak 15 dakika içinde her bir hedef tespit eder. Grip A ve B tahlil kullanıcı dostu ve gerçekleştirmek için en az eller-zaman gerekli.

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Biz antivirallerin nöraminidaz inhibitörü sınıfına influenza A ve B virüsleri duyarlılığını değerlendirmek için bir fenotipik flüoresan bazlı nöraminidaz inhibisyonu deneyi kullanılmasını tarif eder.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

Keşfedin, enfekte farelerdeki bronkoalveoler lavaj sıvısından H1N1 virüsünü yüksek hassasiyetle tespit etmek için kızılötesi boya bazlı görüntüleme sistemini. Bu yöntem, viral yükleri hassas bir şekilde ölçerek solunum yolu hastalıklarının teşhisinde ve tedavisinde araştırmacılara yardımcı olur.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Daha fazla video keşfet