Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Bu mikro-nötralizasyon testinin genel amacı, mevcut dolaşımdaki her tür influenza virüsünü ve antikorların ve antiviral ölçümlerin aktivitesini kantitatif, yüksek verimli ve oldukça hassas bir şekilde karakterize etmektir. Bu yöntem, influenza virüslerinin antijenik karakterizasyonu, antikorların kantitatif nötralizasyonu ve antiviral aktiviteler gibi viroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, görünür ve görünmez plaklar ve tek hücre enfeksiyonları dahil olmak üzere tüm enfekte hücre popülasyonunu karakterize etmesidir.

Mikro-nötralizasyon testi, Londra'daki DSÖ Grip İşbirliği Merkezi'nin müdür yardımcısı Dr.Yipu Lin tarafından gösterilecek. Aşağıdaki protokol için biyogüvenlik seviyesi veya BSL, mevsimsel grip virüsleri için BSL 2 ve potansiyel pandemik grip virüsleri için BSL 3+'dır. Başlamak için, yeterli hücreleri 96 oyuklu plakalara ayırın.

Birleşmeye ulaşmak için hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de iki ila üç gün inkübe edin. % 70 etanol kullanarak, çok kuyulu bir plaka yıkayıcıyı sterilize edin ve durulamak için PBS veya VGM kullanın. Ardından, birleşen hücreleri yıkamak için 200 mikrolitre virüs büyüme ortamı veya VGM kullanın.

VGM'yi hücrelerden aspire edin ve hemen her oyuğa 50 mikrolitre VGM ekleyin. Ardından, altı steril tüpün her birine 900 mikrolitre VGM ekleyin. Daha sonra ilk tüpe 100 mikrolitre virüs pipetleyin ve iyice karıştırın.

İlk tüpten başlayarak virüsün seri dilüsyonlarını hazırlayın ve her dilüsyon arasındaki uçları değiştirin. 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını çoğaltmak için en yüksek seyreltmeden başlayarak her virüs seyreltmesinden 50 mikrolitre ekleyin. Ardından, virüsün hücreleri enfekte etmesine izin vermek için plakayı iki ila üç saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Kaplamayı metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, aşıyı kuyucuklardan çıkarın. Ardından, her bir oyuğa 200 mikrolitre kaplama ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede rahatsız edilmeden inkübe edin. Kuyucuklara PBS A'da 200 mikrolitre buz gibi% 4 PFA ekleyin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede veya 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, PFA'yı aspire edin ve plakayı iki kez yıkamak için PBS A'nın oyuğu başına 200 mikrolitre kullanın. Plakaya 100 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, plakayı iki kez yıkamak için PBS A'yı kullanın.

Daha sonra, influenza tip A'ya karşı bir fare monoklonal antikorunun oyuklarına 50 mikrolitre ekleyin ve bir saat çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kuyuyu üç kez yıkamak için 300 mikrolitre yıkama tamponu kullanın. Daha sonra, numunelere 50 mikrolitre HRP konjuge keçi ikincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Kuyucukları daha önce olduğu gibi üç kez yıkadıktan sonra, oyuk başına 50 mikrolitre substrat ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika veya mavi bir rengin gelişimi açıkça görülene kadar inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için, kuyuları iki kez yıkamak için 200 mikrolitre damıtılmış su kullanın. Ardından, plakayı havayla kuruttuktan sonra karanlık bir yerde saklayın.

Optimum ve tekrarlanabilir bir görüntüleme konumunun elde edilebilmesini sağlamak için L şeklindeki konum sınırını kullanarak düz yataklı bir tarayıcının tarama alanına bir kuyu plakası yerleştirin. Burada gösterilen ayarları kullanarak plakayı tarayın. Ardından, bir görüntü yüklemek için Görüntü Yükle düğmesine tıklayarak gerekli virüs konsantrasyonunu hesaplamak için kuyu plakası okuyucu yazılımını çalıştırın.

Ardından, genel eşik sekmesinde, örnekleme eşiğini ayarlamak için histogramdaki kırmızı çubuğu kaydırın. Ardından, bir görüntü üzerindeki efekti incelemek için güncelle düğmesine tıklayın. Şimdi, Nötralizasyonu/Titrasyonu Hesapla kutusunu işaretleyin.

Enfekte hücre popülasyonunu veya ICP'yi ölçmek için Örnekleme düğmesine tıklayın. Ardından istendiğinde, İndirim Örnekleme sonuçlarını kaydetmek için düğmesine basın. Titrasyon sonuçlarını elde etmek için kuyu plakası tanımlama haritasını yükleyin veya girin.

Titrasyonda: Optimal Virüs Popülasyonu eşiği gösterir. Titrasyon sonuçlarını hesaplamak için Titrasyon İşlemi sekmesini seçin. Ardından, sonuçları kaydetmek için Kaydet ve Kapat düğmesine tıklamadan önce titrasyon sonuçlarını kontrol edin.

Yazılımın daha ayrıntılı talimatı için ek S1'e bakın. Virüs nötralizasyonunu gerçekleştirmek için, hücre tek tabakasını iki veya üç gün önceden hazırlayın. Ardından, plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre VGM ekleyin.

Virüs kontrolü ve hücre kontrolü için sırasıyla 11 ve 12 numaralı sütunları kullanın. Reseptör tahrip edici enzimin veya RDE'nin 20'de bir seyreltilmesinin 50 mikrolitrelik alikotlarını, bir ila 10 arasındaki sütunların ilk sırasına ekleyin. 50 mikrolitreyi A satırından H satırına aktararak ve H satırından 50 mikrolitre atarak iki katlı seri seyreltmeler gerçekleştirin.Ardından, hücre kontrol kolonunun her bir oyuğuna 50 mikrolitre seyreltici ekleyin.

Hücre kontrol sütunu hariç, plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre virüs ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede iki ila üç saat inkübe edin. Ardından, aşıyı çıkarın ve kaplamayı her bir oyuğa ekleyin.

Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede rahatsız edilmeden inkübe edin. Ardından, bu videoda daha önce gösterildiği gibi plakaları sabitleyin ve boyayın. Nötralizasyonu ölçmek için, bu videoda daha önce gösterildiği gibi düz yataklı bir tarayıcının tarama alanına bir kuyu plakası yerleştirin.

Plakayı tarayın ve daha önce olduğu gibi gerekli viral titreleri hesaplamak için kuyu plakası okuyucu yazılımını çalıştırın. Kuyu plakası haritasını yükledikten veya girdikten sonra, Nötralizasyon: Enfeksiyon Kesintisi'nde eşiği belirtin. Ardından, titreleri hesaplamak için Nötralizasyon İşlemi'ni seçin.

Son olarak, titreleri kontrol edin ve nötralizasyon sonuçlarını kaydetmek için Kaydet ve Kapat düğmesine tıklayın. Burada, negatif olana 1.0 çarpı 10 ve negatif altıya 1.0 çarpı 10 arasında seyreltmelere sahip sekiz giriş virüsünün son antijenik karakterizasyon deneylerinden elde edilen titrasyon sonuçları gösterilmektedir. Grafik, virüs seyreltmesindeki artışla birlikte ICP'lerin azaldığını göstermektedir.

Eğriler, bir kuyucuk içindeki tüm hücrelerde enfeksiyonlara neden olan aynı virüslerin ICP'lerine karşı normalleştirildi. Bu tabloda, nötralizasyon için giriş virüsü seyreltmesi olarak seçilen ICP doygunluğunun %30'unu üreten virüs seyreltmeleri listelenmiştir. Bu şekil, beş antiseruma karşı bir giriş virüsü kullanan bir nötralizasyon deneyinin sonuçlarını göstermektedir.

Grafik, serum seyreltmesindeki artışla birlikte enfeksiyon sürecini göstermektedir. Dikey eksende normalleştirilmiş pozitif popülasyon, referans virüsün ortalama ICP'sine karşı karşılık gelen antiserum yanıtından ICP'lerin oranını temsil eder. Son olarak, nötralizasyon titreleri, %50 ICP azalmasına karşılık gelen antiserum dilüsyonlarının tersi olarak belirlendi.

Bu test, giriş virüslerinin kantitatif titrasyonu, yüksek verimli görüntüleme ve veri işleme dahil olmak üzere tutarlılık, hız ve algılama hassasiyetine odaklanır. Uygun maliyetlidir, kullanıcı dostudur ve viral antijenik çalışmalarda rutin olarak kullanılmaktadır.