Hazırlama ve Analizler İn Vitro Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Bu prosedür setinin genel amacı, in vitro meme kanseri vekilleri olarak işlev görecek üç boyutlu hücre kültürleri oluşturmak ve vekillerin histolojik bölümlerinde hücre büyümesini ölçmek için bir yöntem sunmaktır. Üç boyutlu hücre kültürü, hücre davranışını in vitro olarak modellemek için iki boyutlu hücre kültüründen daha fizyolojik olarak ilgili bir yöntemdir. Deneysel koşullarda hücresel bileşimi değiştirerek, bu prosedür seti çeşitli biyolojik soruları ele almak ve aday terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için uyarlanabilir.

Hücreleri ECM'ye dahil etmek için, buz üzerinde, hücreleri ve beraberindeki el yazmasındaki tablo bir'de listelenen ilk dört ilgili bileşeni iki milimetrelik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Ardından, pipetleyerek nazikçe karıştırın ve herhangi bir kabarcık oluşturmaktan kaçının. Karışımın turuncu-pembe bir renk gösterdiğinden emin olmak için 10XD MEM'deki fenol kırmızısını kullanarak pH seviyesini izleyin, bu da pH'ın yedi olduğunu gösterir.

Karışım sarı görünüyorsa ve pH çok düşükse, uygun renge ulaşılana kadar her seferinde bir damla yavaş yavaş yüzde 7,5 sodyum bikarbonat ekleyin. Karışımı buz üzerinde tutmayı unutmayın ve erken ECM polimerizasyonunu önlemek için hızlı çalışın. Katı 3D kültürler için, erken ECM polimerizasyonunu önlemek için hazneyi buz üzerinde kaydırın.

Sekiz kuyucuklu hazneli kızağın her bir oyuğuna 100 mikro litre hücre ECM karışımını yavaşça pipetleyin ve karışımın daha iyi dağılmasına yardımcı olmak için hücre ECM karışımını kuyunun kenarlarına pipetleyin. Daha sonra, ECM polimerizasyonuna izin vermek için vekilleri 37 santigrat derecede, yüzde beş CO2'de 45 dakika inkübe edin. Kırk beş dakika sonra, her bir oyuğa 100 mikro litre kültür ortamı ekleyin ve deney süresince 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübe edin.

Kültür ortamını iki günde bir değiştirin. 3D kültürün bir sınırlaması, oksijen ve besin maddelerinin hacme difüzyonunun hücre canlılığını desteklemek için yetersiz olabilmesidir. Bir biyo-reaktör sisteminin eklenmesi, bu sınırlamanın üstesinden gelmeye ve büyümeyi artırmaya yardımcı olabilir.

Bir biyo-reaktör sisteminde 3D kültürleri çoğaltmak için, biyo-reaktör sisteminin vekilleri barındıran kısmını steril bir şekilde hazırlayın ve monte edin. Bir hücre kültürü davlumbazında, 26 gauge iğneli bir şırınga kullanarak, hücre ECM karışımını, hücreleri içerecek şekilde tasarlanmış perfüzyon biyo-reaktörünün alanına enjekte edin ve hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin. Hücrelerin vekiller içinde daha eşit dağılımını sağlamak için, vekilleri barındıran biyo-reaktör bileşenini 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

ECM polimerizasyonuna izin vermek için yerinde bir hibridizasyon fırınında veya bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe ederken 18 rpm'de vekilleri 45 rpm'de sürekli olarak döndürün. Polimerizasyonu ve ortam ilavesini takiben, biyo-reaktör tertibatını pompaya bağlayın. 37 santigrat derece, yüzde beş CO2'de bir inkübatörde orta perfüzyonu başlatın.

Deney süresince orta perfüzyona devam edin ve kültür ortamını spesifik deney tasarımı için gerektiği gibi değiştirin. Deneyin sonunda, işleme sırasında vekilleri sağlam tutmak ve histolojik kesitlemeyi kolaylaştırmak için suretleri numune işleme jeli ile kaplayın. Bunu yapmak için, numune işleme jelini kullanıma hazır olana kadar 60 santigrat derece su banyosunda eritin.

Ardından, etiketli bir kriyomoldun dibine yaklaşık 300 mikro litre numune işleme jeli pipetleyin. Bir neşter bıçağı ve forseps kullanarak, biyo-reaktörden veya sekiz oyuklu bir hazneli slaydın kuyusundan bir vekili dikkatlice çıkarın ve numune işleme jeli içeren kriyokalıplara yerleştirin. Kriyo kalıptaki vekili kaplamak için yaklaşık 300 mikro litre numune işleme jeli pipetleyin.

Ardından, 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Numune işleme jeli katılaştıktan sonra, vekili içeren numune işleme jelini kriyomoldtan çıkarın ve bir doku kasetine yerleştirin. Aynı doku kasetine birden fazla vekil konulacaksa, fiksasyon ve işlemeyi takiben numuneleri ayırt etmek için doku işaretleme boyaları kullanılabilir.

Daha sonra, vekili içeren doku kasetini, tam fiksasyona izin vermek için oda sıcaklığında on ila on iki saat boyunca yüzde on nötr tamponlu formüle yerleştirin. Fiksasyonu takiben, vekili içeren doku kasetini yüzde 70 etanole aktarın. Sabit vekil artık parafine işlenmeye ve ardından histolojik kesitlemeye hazırdır.

H ve E lekeli bölümlerin hücre yoğunluğunu ve fotomikroskobik görüntülerini ölçmek için, vekilin bir görüntü dosyasını açın. ImageJ'deki Çokgen aracını ve ECM'nin kenarlarını kılavuz olarak kullanarak, fareyi sürükleyip bağlantı noktaları oluşturmak için tıklatarak vekilin alanını çizin. Ana hatları çizildikten sonra, Analiz sekmesinin altında Ölç'ü seçin.

Ardından, görüntü dosyalarını dosya listesine sürükleyerek vekil alanı ölçmek için kullanılan görüntü dosyalarını Cell Profiler'a yükleyin. Ardından, Names and Types Import modülünde içe aktarılan her görüntüye bir ad atayın ve görüntü türünü seçin. Analiz işlem hattı oluşturulduktan sonra Test Modu'nu başlatın ve Hücre Profili Oluşturucu'da Çalıştır'a tıklayın.

Test görüntüsündeki çekirdeklerin çoğunun uygun şekilde tanımlandığından ve hücreleri tanımlamak için en uygun parametrelerin seçildiğinden emin olmak için filtrelenmiş nesneleri değerlendirin. Dahil edilen çekirdekler yeşil daire içine alınacaktır. Ardından projeyi kaydedin, test modundan çıkın ve Görüntüleri Analiz Et'e tıklayın.

Burada, yedi gün boyunca yetiştirilen perfüze edilmiş bir vekilden alınan H ve E lekeli bölümün temsili bir görüntüsü gösterilmektedir. Ve bu, yedi gün boyunca büyütülen ve her iki günde bir ortam değiştirilen katı bir vekilden alınan H ve E lekeli bölümün temsili bir görüntüsüdür. Katı vekillerde hücresellik çok daha düşüktür.

Bu grafik, yedi günlük büyümenin ardından alan başına ortalama çekirdekli hücre sayısının karşılaştırmasını göstermektedir. Perfüze edilmiş ve sağlam bir vekil. Bu sayısal veriler, H ve E lekeli bölümlerin fotoğraf mikro grafiklerindeki hücreselliği desteklemektedir.

Ve bu grafik, perfüze ve katı vekillerin yedi günlük büyümesini takiben hücre proliferasyonunun ölçümü olan Ki-67 etiketleme indeksinin karşılaştırmasını göstermektedir. Bu veriler yine perfüze edilmiş vekillerde daha fazla büyümeyi desteklemektedir. Bu prosedürü takiben, RNA ve protein ekspresyonu gibi soruları cevaplamak için vekillerin histolojik kesitleri üzerinde in situ hibridizasyon ve amino histokimyası gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu in vitro doku vekillerinin nasıl hazırlanacağını ve işleneceğini iyi anlamalı ve H ve E boyalı histolojik kesitler üzerinde vekil analiz yapmalısınız.