Name: Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Keşfedin, tavuk korioallantoik membran modeli kullanarak insan kanser hücrelerinin metastatik potansiyelini kantitatif PCR ile nasıl analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, tümör yayılımını hızlı ve güvenilir şekilde ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz cömertçe döllenmiş yumurta sağlamak için Tyson Foods Inc tanımak istiyorum. Shanna Arnold, bu protokolün çekimler sırasında etkili oldu. Trenis Palmer Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (F31 National Cancer Institute) altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen CCSRI Hibe # 700.537 JDL ve NIH / NCI hibe # CA120711-01A1 ve AZ CA120711-01A1 tarafından desteklenmiştir.

1. Xenografting için yumurta (spontan metastaz) hazırlanması <ol><li> Yeni bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 10 gün ve 100 ° F% 60 nem için dönen bir inkübatör inkübe edilir. Yumurta, her saat başı dört kez döndürülür. </li><li> Gelişim günde 10 yumurta, kendi taraflarında bir yumurta rafa yerleştirilir. Kaz-boyun lambası veya diğer bir uygun ışık kaynağı, künt sonunda airsac bulunan yumurta kabuğu içine ışık tutarak mum yumurtalar için kullanılır. </li><li> Chorioallantoic ven bulunur ve işaretlenir. Bu bağlamda, birkaç büyük kan damarlarının birleştiği kabuğunun üst kısmında yer almaktadır. Bu şube noktada kan damarı CAM, aşağı düşer ve embriyo bağlanır. 1cm kare kutusu ven dal noktası yaklaşık 1cm uzakta kabuğu üzerinde kalem ile çizilmiş. Alan ve meydanın çevresine iyot batırılmış bir pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir. </li><li> Bir silikon karpit taşlama taşı (Dremel parçası # 84.922) hava kesesi içine yumurtanın künt sonuna kadar açılmış bir delik ile donatılmış dönen bir kesme aleti (Dremel) kullanma. Bu aynı aracı kullanarak bir delik kabuğu membran kısa duruş, yumurtanın üstüne önceden çizilmiş bir kare içinde delinmiş. 25-gauge şırınga iğnesinin ucunda ince bir frez ile yatan CAM gözyaşı dikkatli olmak kabuğu zarı küçük bir delik yapmak için kullanılır. CAM ¼ "Tygon boru airsac delik karşı yerleştirilen bir parça ile donatılmış otomatik bir pipet yardımı ile oluşturulan hafif bir emme kullanarak kare alanda kabuğu zarı daha sonra ayrılmış. Emme başvurusu üzerine, bir hava cebi delik meydanında altında CAM kabuğu başarıyla uzak düşmüş olduğu anlamına olmalıdır. CAM bırakılır sonra, hava kesesi ve chorioallantoic ven yakınındaki meydanda bulunan delik delik bir parça bant laboratuvar bant ile kapatılır. Yumurta daha sonra tümör hücrelerinin aşılama beklentisiyle 100 ° F ve% 60 nem sabit bir inkübatör içine yerleştirilir. Sıralı bir tasviri için şekil 1'e bakınız. </li></ol> 2. Yumurta intravenöz enjeksiyon için hazırlanması (deneysel metastaz) <ol><li> Yeni bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 12 gün ve 100 ° F% 60 nem için dönen bir inkübatör inkübe edilir. Yumurta, her saat başı dört kez döndürülür. </li><li> 12 yumurta gelişim gününde, kendi taraflarında bir yumurta rafa yerleştirilir. Kaz-boyun lambası veya diğer bir uygun ışık kaynağı, künt sonunda airsac bulunan yumurta kabuğu içine ışık tutarak mum yumurtalar için kullanılır. </li><li> Chorioallantoic ven bulunur ve işaretlenir. 0.5 cm dikdörtgen 1cm doğrudan damar yukarıdaki kabuğu üzerinde kalem ile çizilir. Alan ve meydanın çevresine iyot batırılmış bir pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir. </li><li> Dremmel matkap ucu (# 118) kullanılarak çizilmiş yerde kabuğu küçük bir pencere oluşturulur. Pencere sonradan mineral yağ damla şeffaf hale yatan kabuğu zar maruz kaldırılır. Bir grafik tasviri için Şekil 5A bakın. </li><li> Bu noktada hava kesesi ve chorioallantoic ven yakınındaki meydanda bulunan delik delik bir parça bant laboratuvar bant ile kapatılır. Yumurta daha sonra tümör hücreleri enjekte beklentisiyle 100 ° F ve% 60 nem sabit bir inkübatör içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Tümör hücrelerinin aşılama veya enjeksiyon için hazırlanması. <ol><li> Xenografting için herhangi bir kalıntı medya, tripsin, EDTA veya kaldırmak için, tümör hücrelerinin tripsin / EDTA kullanarak kendi kültür yemeklerinden müstakil ve fosfat 10 ciltlik ile yıkanır tamponlu salin (PBS). </li><li> IV enjeksiyon için, kültürlü hücreler enzimatik olmayan hücre-ayrılma çözümü kullanarak müstakil, ve serum ücretsiz DMEM ile yıkanır. ve) </li><li> Hücreler bir hemasitometre sayılır ve aşılama için 10-40 milyon hücre / ml PBS içinde yeniden süspanse, ya da alternatif olarak 1 milyon hücre / ml IV enjeksiyon için serum serbest DMEM yeniden süspanse. </li></ol> 4. Yeni maruz CAM (Spontan metastaz) tümör hücreleri üzerine Aşılama <ol><li> Yumurtalar inkübatör kaldırılır ve yerini yeni bir hava cebi oluşmuştur önceden çizilmiş bir kare kesilmiş küçük bir pencere. Bu en kolay bir kesim tekerlek (# 409 dairesel kesme tekerleği ile Dremel aleti) ile donatılmış bir döner alet ile yapılır. Kabuğu olan küçük bir bölümü çıkarın ve altta yatan CAM ortaya çıkarmak için bir çift iğne-burun forseps kullanılır. </li><li> Pamuk uçlu bir aplikatör (Fisher Marka # 23-400-001) CAM 5 kez aşınır. Biraz pamuk kan belirgin olmalıdır. CAM zarar hemen sonra, hücre süspansiyonu 25μl hasarlı bölgeye yerleştirilir. Optimal hücrelerinin sayısı tespit empirically ama 0.5X10 5 1x10 6 arasında olabilir. yumurtanın pencere bandı ile ağzı sıkıca kapatılmış ve civciv hücrelerini yerleşmek için izin vermek için 10-15 dakika ayakta kalan. 15 dakika sonra yumurtaları sabit kuvöz iade edilir. </li><li> Tümörler, özel uygulama ve tümör hücre hattında kullanılan niteliğine bağlı olarak 5-8 gün büyümeye izin verilir. Sıralı bir tasviri için şekil 1'e bakınız. </li></ol> 5. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu (Deneysel metastaz) <ol><li> Hücre süspansiyonu 30 Gauge insülin şırınga 100μl kullanarak her bir embriyo allantoik damar içine enjekte edilir, yumurta, sabit bir inkübatör döndü ve bir ek 1-7 gün boyunca orada kaldı. </li><li> Farklı zaman noktalarında, akciğer veya düşük CAM her embriyo hasat ve aşağıda açıklandığı gibi, tümör hücrelerinin tespiti için işlenmiş. </li></ol> 6. Hasat tümörler ve piliç dokuların <ol><li> A diseksiyon alanı hazırlanır. Tahlil, çok hassas bir PCR yaklaşım kullanarak insan DNA nicel metastatik hücreler algılar. Bu nedenle eksojen DNA ile kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. Diseksiyonlarının özel bir alanda yapılmaktadır ve her hayvan arasında diseksiyonları boyunca araçları temizlenir. Primer tümörün ve iç organların kaldırmak için bir takım kaldırmak için, bir takım yumurta kesmek için bir set: diseksiyon süreci boyunca, araçlar 3 ayrı set kullanılan örnekleri çapraz kontaminasyon önlemek için. Buna ek olarak, dört yıkama kapları, her bir hayvan arasındaki araçlar durulama sıralı için kullanılır. Bu yıkar sırayla şunlardır: 1) çift distile su, 2) çift distile su, 3) çamaşır suyu ve 4)% 70 etanol. </li><li> Yumurta sabit kuvöz kaldırılır ve hayvanları uyutmak ve euthanize 15 dakika boyunca buz üzerinde yerleştirilir. Pencereler tümörler görünür hale gelmesi gibi açılır. Bazı kabuğu kaldırarak büyük pencereler açılması gerekebilir. CAM primer tümör rezeke tartılır ve histoloji için işlenmiş. </li><li> Radyal eşit parçaya kabuk keserek civciv kabuğu kaldırılır. Embriyo kesim kabuk dekante ve temiz bir tekne meme tartmak yan aktarılır. Hayvan taze, temiz bir araç seti ile disseke edilir. Hayvan sternum ile kesim tarafından açıldı. Embriyo, karaciğer ya sağ ya da sol lob toplanan bir parça açıktır. Taşlık bağlı yemek borusu hafifçe çekerek ve kesme organlar bağlamak visera daha sonra iç organları tarafından kaldırılır. Akciğerler kesip toplamak için göğüs kafesi, göğüs plakası ayrılır açıldı ve kalp kaldırılır. Bu noktada, akciğer dört kenarından kesmek mümkün (baş en yakın üst göğüs kafesi, trakea ve sağ tarafta birlikte diyafram yakınında alt sol tarafındaki). Tutarlılık uğruna, aynı akciğer her hayvan toplanır. Hasat doku örnekleri daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanır veya DNA izolasyonu için hemen işlenebilir. </li></ol> 7. Genomik DNA izolasyonu ve kantitatif PCR Analizi <ol><li> Genomik DNA SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR kiti (Sigma-Aldrich Katalog # XNATRG) kullanarak dokular elde edilir. Edilen DNA temiz bir Eppendorf tüp aktarılır ve -20 ° C'de saklanır veya hemen kullanılabilir. Sonraki PCR reaksiyonu kullanmadan önce nükleaz ücretsiz su DNA 01:50 sulandırmak için önemlidir. Alternatif olarak, DNA standart DNA ekstraksiyonu protokolleri (Zijlstra ve ark, 2002) herhangi bir sayı kullanılarak elde edilebilir. </li><li> İnsan DNA'sı kullanarak insan Alu dizileri için kantitatif PCR özel civciv dokularda tespit edilmiştir. Kantitatif PCR SYBR yeşil amplifikasyon Exract-N-Amp kiti kullanılarak yapılır Alu-spesifik primerler kullanılarak. SYBR yeşil, tampon, tuzlar dNTP, Taq polimeraz ve Jumpstart Taq Antikor içeren bir 2x reaksiyon karışımı PCR kiti ile birlikte gelir. Reaksiyon karışımı, her astar 0.4μM, 15μl nihai hacmi oluşur. Çoğu durumda edilen DNA kullanılarak 01:50 nicel veri sağlayacaktır seyreltilmiş için, ancak, en uygun miktarda DNA ampirik optimize edilmesi gerekebilir. Tavuk GAPDH primerler PCR Alu dizileri için aşağıdaki koşullar altında çalışan bir iç kontrol sistemi olarak kullanılır: polimeraz aktivasyon 95 ° C 'de 2 dakika süreyle 95 30 döngüleri takip ° 30 s, 63 ° C için 30 sn 72 ° C, 30 s. Tavuk GAPDH reaksiyon koşulları ancak 40 döngü PCR uzatmak için gerekli olabilir Alüminyum için açıklanan aynıdır. </li><li> Metastaz Kantitatif analiz, kontrol grubu (Schmittgen ve Livak, 2008 deney grupları karşılaştıran ΔΔCt yöntemi kullanılarak yapılır. Zijlstra ve ark, 2002). Alternatif bir standart eğri Özü-N-Amp kiti (Zijlstra ve ark, 2002) kullanılarak çıkarılan insan tümör hücreleri dilüsyon serileri kullanılarak oluşturulabilir. İstatistiksel anlamlılık Öğrenci T-test veya deney ve kontrol grupları Anova analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Tavuk embriyo metastaz modeli. A) önemli adımlar kesiti modelin görünümünü gösteren dört panel diyagram: 1. Inkübasyon 10 gün sonra. CAM yakın maksimum boyutuna ulaştı. Arterler ve damarlar belirgin bir yumurtanın üst karşı konumlandırılmış alantoyik ven görünür. 2. Kabuğu iki delik delme hemen sonra yumurta: airsac içine bir allantoik ven için ek noktasına bitişik. 3. Hafif bir vakum sonra görünüm airsac tahliye ve CAM bırakmak için kullanılır olmuştur. Tümör hücreleri (mavi) düştü CAM uygulanır. 4. Aşılı tümör hücresinin büyümesini sağlayan sonra, tavuk embriyo dokusu ile birlikte tümör analiz için hasat B) modelin seri tasviri: 1. Kuluçkalık yumurtalar, 2. Allantoik ven konumu, 3 işaretleniyor. Kabuğu üzerinde herhangi bir delik, 4. CAM Damlama, 5. Kesme, aşılama tümör hücresi, 6 için bir açılış. Tümör hücrelerinin uygulamak, 7. Buz üzerinde yumurta Soğutma önce doku toplama, 8. 7 gün sonra büyüme tümör Hasat. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 CAM tümörlerin Histolojisi. Tümör taşıyan chorioallantoic membran alınan dokular, formalin, kesitli sabit ve trikrom boyası ile işlendi. A) CAM büyüme yedi gün sonra tümör HEp3. B ve C, A gösteren, tümör ve stroma büyütülmüş bölgeleri göstermektedir. D) normalleri CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Kantitatif boyuna metastaz analizi. Yüksek veya düşük metastatik yeteneği (HEp3 M (Yüksek) ve sırasıyla HEp3 M (Düşük)) baş ve boyun kanseri tanısı HEp3 için Varyantlar Alu PCR kullanarak yaymak için yeteneklerini analiz edildi. On hayvanlar 7 gün süresi için her zaman bir noktada analiz edildi. Bu örnekler # doku cells/50mg olarak bir standart eğri karşı nicel ve daha sonra ifade edildi. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Hayvanlarda spontan metastaz hücreleri metastaz inhibe antikor 1A5 inhibisyon ile tedavi edildi. Tümörler, gün-10 embriyoların CAM uygulanan 5x10 5 HEp3 hücreleri kullanılarak oluşturulmuştur . Hayvanların yarısı anti-CD151 antikoru 1A5 ile tedavi edilen tümör hücrelerinin uyguladıktan sonra üç gün. Tümör taşıyan hayvanlar akciğerler iki gün sonra hasat edilir ve kantitatif gerçek zamanlı alüminyum PCR tabi tutuldu. ChGAPDH Tersine kantitatif gerçek zamanlı PCR host genomik DNA eşdeğer miktarda (ΔΔCt yöntemi (kantitatif iki grup karşılaştırmak için B kullanılmıştır) varlığını doğrulamak için kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Metastatik kaskad tutuklama, büyüme ve intravasation değerlendirilmesi. Tutuklama, büyüme hızı ve intravasation oranı: Temelde, ikincil bir organ metastazı üç yönlerini katkılarıyla tanımlanır. Bu deneysel metastaz (A) ve spontan metastaz (B) bir kombinasyonu kullanılarak belirlenebilir. 2saat yazılan enjeksiyon tutuklama hücre sayısı olarak tanımlanan deneysel metastaz (A) kullanarak tespit edildi. Tutuklandı hücrelerin hayatta kalma ve büyüme, hücre sayısı 24 saat sonrası enjeksiyon değişikliği olarak belirlenmiştir. Büyüme 3-7 gün sırasında proliferasyon oranı olarak tanımlanır. Intravasation spontan metastaz (B) intravasated hücrelerinin sayısı, değeri 6 gün metastatik yükünün büyüme öngördüğü aşması 7 gün metastatik yükünü hediye olarak tanımlanır kullanılarak belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. CAM metastatik görselleştirme genişleme. GFP ifade HEp3 hücrelerinin gelişim 12. günde intravenöz enjekte edildi. 1, 3 ve 5 günde bir yumurta kurban CAM bir bölüm ve bir floresan stereo mikroskop ile görüntülendi. Kabuğu koyu yeşil arka tarafından oluşturulan, damarsal siyah çizgiler olarak görünür ve tümör hücrelerinin parlak yeşil noktalar olarak görünür.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
<li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li>
<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin%2FMMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li>
<li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+%28PETA-3%2FCD151%29+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

Civciv CAM kanser biyolojisi ve metastatik ilerlemesi çeşitli yönlerini incelemek için bir model sistem olarak on yıllardır kullanılmaktadır. Dormansi analizi de dahil olmak üzere çeşitli gruplar tarafından bu modelde, metastatik yetenekleri Prensibi değerlendirme yapılmıştır (Aguirre Ghiso ve ark, 1999; Ossowski ve Reich, 1983), doku yeniden yapılanma (Deryugina ve ark, 2005; Hahn- DANTONA ve ark, 1999) ve metastaz (Zijlstra ve ark, 2008; Zijlstra ve ark, 2002). Kullanım kol...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartalı Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) (1X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH: 7.4 </td></tr><tr><td> Tripsin, EDTA 4NA% 0,05 (1X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sporcu çıkım </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Bu inkübatörler en hazır bazılarıdır. Ancak, video, farklı ekipman gösterecektir. </td></tr><tr><td> Sporcu inkübatör </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel döner aracı </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hiçbir Dremel kesme tekerlekleri. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Taşınabilir Pipet Yardım </td><td> Balıkçı </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Pamuk Aplikatörler Uçlu </td><td> Balıkçı </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Döllenmiş yumurta </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Birçok farklı satıcı kullanılabilir. Yumurta yaklaşık 35-55 gram olmalı. Onları yaş arasında 36 ve 55 hafta olmalıdır bırakır tavuklar. </td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber-optik mikroskop aydınlatıcı </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 iğne </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR Kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

kuş embriyo model kullanarak kanser metastaz kantitatif analiz

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Primer tümörün metastaz kanser hücrelerinin yayılmasını sırasında, işgal, çevre dokulara ve uzak organlara yayılabilir. Metastaz, birçok doku tipleri, a değişken zaman dilimlerinde, içerir ve genellikle zor araştırmak ve ölçmek için, organların içinde derin meydana karmaşık bir süreçtir. Buna ek olarak, metastatik sürecinin etkinliği zor tümör hücre davranışı tek bir yönü katkısını değerlendirmektir metastatik kaskad birden fazla adımlar etkilenir. Bunun bir sonucu olarak, metastaz testlerin sık metastaz çalışma mutlaka gerçekçi bir bağlam sağlamak için deney hayvanlarında yapılmaktadır. Ne yazık ki, bu modellerin daha da kompleks fizyolojisi karmaşıktır. Civciv embriyo chorioallantoic membran (CAM), tümör hücrelerinin xenografting alıcı kabuğu altında bulunan iyi vaskülarize ekstra embriyonik doku erişilebilirlik nedeniyle eşsiz bir metastaz okuyan birçok sınırlamalar üstesinden in vivo modeldir. (Şekil 1). Ayrıca, doğal civciv embriyo immünyetmezligi beri, CAM kolayca engraftman hem normal ve tümör dokularının destekler. En önemlisi, kuş CAM başarıyla büyüme, istila, anjiyogenez ve mikroçevresinin itilme dahil olmak üzere birçok kanser hücresi özellikleri destekler. Bu kanser metastazı yol ve yeni potansiyel terapötikler metastatik kanser cevabı tahmin etmek yollarının araştırılması için model son derece yararlı hale getirir. Türlerin belirli Alu PCR yaygın hücrelerinin algılama kantitatif 25 hücreleri gibi birkaç kişi tarafından kolonize organlarda metastaz değerlendirmek için mümkün kılar. İnsan Epidermoid Karsinomu hücre hattı (HEp3) kullanarak kanser hücrelerinin spontan civciv karaciğer ve akciğer gibi uzak organlara metastaz analiz etmek için bu modeli kullanın. Ayrıca, Alu-PCR protokolü kullanılarak testin duyarlılığı ve tekrarlanabilirlik intravasation, tutuklama, ekstravazasyon ve kolonizasyon metastaz bireysel unsurları olarak analiz etmek ve ölçmek için bir araç olarak göstermektedir.

Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Metastaz sırasında kanser hücreleri birincil tümörden ayrılır, çevre dokulara invaze olur ve uzak organlara yayılır. Metastaz karmaşık bir...

Bu prosedürün genel amacı, koryoallantoik membran veya CAM'ı bir xenograft modeli olarak kullanarak kanser hücrelerinin metastatik yeteneğini nicel olarak değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle döllenmiş yumurtaların olgun bir CAM gelişene kadar inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise tümör hücrelerinin CAM'e intravenöz olarak enjekte edilmesi veya topikal olarak xenograft şeklinde uygulanmasıdır.Deneysel olarak belirlenen bir süre sonunda doku analiz için toplanır, ardından metastaz miktarı, insan allel dizisine yönelik insana özgü PCR kullanılarak belirlenir ve sonuçlar analiz edilir. Benim adım Trent Palmer. Dr. Andre Zilstra'nın laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.Ben ksenogreft ve spontan metastaz modelini göstereceğim; mentorum Dr. Zilstra ise intravenöz enjeksiyonu ve deneysel metastaz modelini gösterecek. Mevcut modeller arasında bu tekniğin temel avantajı, bir araştırmacının nicel olarak çalışabilmesinin hızı ve kolaylığıdır. İnsan tümör hücrelerinin metastazını çalışan araştırmacılar, yaklaşık 120 hayvanı hazırlayabilir ve protokolü baştan sona iki hafta içinde tamamlayabilirler.Civciv embriyosunun erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı sayesinde, bu sistem diğer in ovo uygulamalarına kolayca genişletilebilir. Bunu geçtiğimiz yıllarda başardık ve bu konu diğer JoVE dikey yayınlarının konusudur. Taze yumurtlanmış döllü tavuk yumurtaları, döner bir inkübatörde saatte dört kez olmak üzere 10 gün boyunca inkübe edilir.10. günde, yumurtaları bir yumurta rafı üzerinde yan taraflarına çevirin ve hava boşluğunun bulunduğu küt uca parlak, doğrudan bir ışık kaynağı tutun. Şimdi koryon damarının dallanma noktasını belirleyin. Bu nokta, yumurtayı uzun ekseni boyunca 20 derece kadar döndürerek en kolay şekilde tanımlanabilir.Damarın kabuktan ayrıldığı noktayı görselleştirmek için, korotik venin dallanma noktasından bir santimetre uzağa, bir santimetre boyutunda kare bir kutu çizin. Ardından, kutunun etrafındaki alanı iyota batırılmış bir pamuklu çubukla temizleyin. Silikon karbür taşlama taşı takılmış bir dremel kullanarak, önce yumurtanın küt ucundan hava kesesine doğru bir delik açın ve ardından yumurta kabuğu zarına ulaşmadan hemen önce duracak şekilde karenin içine bir delik açın.Şimdi, yumurta kabuğu zarını dikkatlice geri çekmek için ucunda ince bir çapak bulunan 25 gauge bir iğne kullanın; doğru yapıldığında bu işlem altındaki kamın yırtılmasına neden olmayacak ve kamın alttaki zardan ayrılmasını sağlayacaktır. Çeyrek inçlik bir tigon tüp parçası takılmış otomatik bir pipet yardımcısı kullanın.Hava kesesi deliğine hafifçe vakum uygulayın ve karede deliğin altında, işlemin başarılı olduğunu gösteren bir hava boşluğu olup olmadığını kontrol edin. Yumurta kabuğu membranı parçalanırken kam zarar görürse, kam belirgin bir şekilde düşmeyecektir. Yumurtanın döndürülmesi sırasında hava kesesine vakum uygulandığında, kabuğun hemen altında görünen hava, hasarlı kamın içine ve altına çekilen havadır.Bu yumurtalar, kam düştükten sonra kullanılamaz. Her iki deliği bir parça laboratuvar bandıyla kapatın ve yumurtaları sabit bir inkübatöre geri yerleştirin. Yumurtalar artık xenograft işlemi için hazırdır.Tümör hücrelerini ksenogreft için hazırlayarak başlayın. Öncelikle, hücreleri trypsin EDTA kullanarak kültür kaplarından ayırın. Hücrelerin yoğunluğunu bir hemositometre ile ölçerek hazırlama işlemini tamamlayın ve bunları mililitre başına 10 ila 40 milyon hücre olacak şekilde PBS içinde yeniden süspande edin.Çeker ocak ve dremel aleti etanol ile sterilize edildikten sonra, yumurtaları inkübatörden çıkarın. Yumurta kabuğunun üst kısmında bir pencere açın ve pamuklu bir aplikatör kullanarak, hasarlı bölgeye pamuğa biraz kan gelecek şekilde beş kez hafifçe dokundurun. Hemen ardından, 0,5 ile 1 milyon hücre içeren 25 µL hücre süspansiyonunu enjekte edin.Şimdi pencereyi laboratuvar bandı ile kapatın ve hücrelerin çökelmesi için 10 ila 15 dakika bekleyin. 15 dakika sonra yumurtaları, tümörlerin beş ila sekiz gün boyunca büyümesine izin verilen sabit inkübatöre geri yerleştirin. İkinci bölümde gösterilen inkübasyon yöntemini kullanarak 12 günlük yumurtaları toplayın.Koryon ve allantois venlerini belirlemek ve venin hemen üzerine işaretlemek için bir yumurtayı ışık kaynağının önüne yerleştirin. Bir santimetreye 0,5 santimetre boyutlarında bir kutu çizin ve alanı iyoda batırılmış bir pamuklu çubukla temizleyin. Şimdi, matkap ucu takılmış bir dremel kullanarak, yumurta kabuğundaki dikdörtgen alan üzerinde küçük bir pencere açın.Alttaki membranı açığa çıkarmak için yumurta kabuğu penceresini dikkatlice kaldırın. Açığa çıkan membrana şeffaflaşmasını sağlamak için bir damla mineral yağı ekleyin. Yumurtaları inkübatörden alın ve 30 gauge insülin şırıngası kullanın.Her bir embriyonun auic venine 100 µL hücre süspansiyonu enjekte edin. Ardından, açıkta kalan membranların üzerine bir parça laboratuvar bandı yerleştirin ve yumurtaları sonraki bir ila yedi gün boyunca sabit bir inkübatöre geri koyun. Bir sonraki bölümde gösterildiği üzere, tümör hücrelerinin tespiti için akciğer veya alt kam hasat edilir.Prosedürün bu adımını, diseksiyonlar için ayrılmış bir alanda ve DNA ile temas olasılığının mutlak minimum olduğu bir ortamda gerçekleştirmek hayati önem taşımaktadır. Örneklerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için; yumurtayı kesmek, primer tümörü çıkarmak ve iç organları çıkarmak için diseksiyonlara başlamadan önce ve her diseksiyon arasında üç ayrı alet seti kullanın. Her bir alet setini bir kez çamaşır suyuyla, bir kez %70 etanol ile ve iki kez çift distile su ile yıkayın.Yumurtalar sabit inkübatörden çıkarılır ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Hayvanları anesteziye almak ve ötanazi yapmak için, tümörler görünür hale gelecek şekilde pencereler açılır. Tümörleri tamamen açığa çıkarmak için pencerelerin genişletilmesi gerekebilir.Şimdi birincil tümörleri CAM'den kesin. Temiz bir alet seti kullanarak tümörleri tartın ve histoloji için hazırlayın. Ardından, organların hasadına geçin.İşleme, civcivin yumurta kabuğundan çıkarılmasıyla başlayın. Bunun için kabuğu radyal olarak eşit parçalara bölün. Ardından civciv embriyosunu kesik bölgeden boşaltın.Shell ayrıca bir punch aleti kullanarak yumurta kabuğunun her iki yanından ikişer parça kam örneği alır ve bunları bir eend tüpüne yerleştirir. Civcivi, göğüs kısmı yukarı gelecek şekilde bir whey boat'a aktarın. Temiz bir diseksiyon aleti seti kullanarak, abdomen ve sternum boyunca kesik atıp abdominal alanı açarak embriyoyu açın.İlk olarak, sağ veya sol lobdan bir karaciğer parçası alın. Şimdi, organları birbirine bağlayan iç organlar kesilirken organlar dikkatlice dışarı çekilebilir. Bir akciğer seçin ve onu göğüs kafesinden ayırmak için dört yanından kesin.Tutarlılık sağlamak için her hayvandan aynı akciğeri toplayın. Organlardan herhangi biri hemen işlenmeyecekse, bunları -20 °C'de saklayın.Bir xenograft hep three tümörünün çıkarılmasının ardından histolojik analiz uygulandı. Bu, Hep three tümörünün tri RME boyamasıdır. Tümörün stromal bileşeni, tümörün belirgin lobları arasında açıkça görülmektedir.Burada, GFP eksprese eden intravenöz olarak enjekte edilmiş Hep 3 hücreleri floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir. IV enjeksiyondan bir gün sonra yalnızca dağınık haldeki tekil tümör hücreleri görülmektedir; enjeksiyondan üç gün sonra ise hücre sayısının arttığı ve küçük metastatik hücre kolonilerinin oluştuğu açıkça görülmektedir. Greftleme sonrası yedi günlük süre boyunca meydana gelen metastaz düzeyi, insan ALU dizisi için gerçek zamanlı PCR kullanılarak nicelleştirilmiştir.Bugün burada gösterdiğimiz teknik, oldukça kantitatif ve yüksek değerli bir modeldir. Bu yöntemde uzmanlaştıktan sonra, bir araştırmacı saatte yaklaşık 30 hayvan hazırlayabilir ve ayrıca, iki haftalık bir süreçte, gelişimi tamamlanan kuş embriyosu modeli kullanılarak metastaz kantitatif olarak analiz edilebilir. Bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların doğal olarak immün yetmezliği olan bir model kullanarak metastazı kantitatif olarak analiz etmelerine olanak sağlamıştır.

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, transgenik zebra balığı embriyolarının perivitellin boşluğuna meme kanseri hücresi verilmesi için bir mikroenjeksiyon yöntemi açıklanmaktadır. Kuluçkadan sonra, kanser hücresi istilasını, yayılmasını ve metastazı gözlemlemek için embriyoyu floresan mikroskop altında görselleştiriyoruz.

zPDX-İnvazivlik Analizi: Zebra Balığı Embriyo Ksenogreftlerinde Metastatik Kanser Hücrelerinin İnvaziv Davranışının Araştırılması

Bu videoda, bir in ovo model oluşturmak için kanser hücrelerinin bir tavuk koryoallantoik zarına implantasyonunu açıklıyoruz. Model, jinekolojik kanserin ilerlemesini incelemek için yumurtalık kanseri hücrelerini başarıyla aşılar.

Tavuk Korioallantoik Membran Tabanlı Kanser Modellemesi: Kanser Hücresi Tümörigenezi ve Metastazı Çalışmak İçin Bir In Ovo Model

Bu video, bir CAM kanseri metastaz modeli oluşturmak için kanser hücrelerinin tavuk koryoallantoik membran damar sistemine intravenöz olarak enjekte edilmesi prosedürünü göstermektedir. Enjekte edilen hücreler sonunda dağınık tek kanser hücresi kolonileri oluşturur ve bu da kanser istilası ve metastazı çalışmasına izin verir.

Kanser Hücrelerinin Tavuk Korioallantoik Membran Damar Sistemine İntravenöz Enjeksiyonu: Kanser İstilasını ve Metastazı İncelemek için Korioallantoik Membran Kanseri Modeli Oluşturma Prosedürü

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.

Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Bu, kanser metastazının baskılayıcılarını veya sürücülerini taramak için etkili bir yöntemdir. Bir ifade kütüphanesi ile transdüklenen hücreler, metastatik koloniler oluşturmak için tavuk chorioallantoic membran vaskülatürüne enjekte edilir. İnvazivliği azalmış veya artmış koloniler, fenotiplerini doğrulamak için ekscised, genişletilmiş, reenjected ve son olarak, yüksek verim sıralaması kullanılarak analiz edilir.

Hızlı ve Nicel Intravital Chick Chorioallantoic Membran Modeli Kullanılarak Metastatik Regülatörlerin Keşfi

Kanser hücrelerinin metastatik kapasitesini değerlendirmek için yapılan CAM-Delam testi nispeten hızlı, kolay ve ucuzdur. Yöntem, metastaz oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaların çözülmesinde ve ilaç taramasında kullanılabilir. İnsan tümör örneklerini analiz etmek için optimize edilmiş bir tahlil, kişiselleştirilmiş kanser tedavisi için klinik bir yöntem olabilir.

Kanser Hücrelerinin Delaminasyon ve İnvazyon Kapasitesini Ölçerek Metastatik Özellikleri Puanlamak için CAM-Delam Testi

Keşfedin, tavuk korioallantoik membran modeli kullanarak insan kanser hücrelerinin metastatik potansiyelini kantitatif PCR ile nasıl analiz edebilirsiniz. Bu yöntem, tümör yayılımını hızlı ve güvenilir şekilde ölçmenizi sağlar.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Daha fazla video keşfet