Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Bu prosedürün genel amacı, bir ksenogreft modeli olarak kolal toik membran veya CAM kullanarak kanser hücrelerinin metastatik yeteneğini kantitatif olarak değerlendirmektir. Bu, önce döllenmiş yumurtaların olgun bir kam elde edene kadar kuluçkaya yatırılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, tümör hücrelerini intravenöz olarak enjekte etmek veya topikal olarak ksenogreft tümör hücrelerini kam'a enjekte etmektir.

Analiz için deneysel olarak tanımlanmış bir zaman aralığı dokusu toplandıktan sonra, insan alel dizisi için insana özgü PCR kullanılarak metastaz ölçülür ve sonuçlar analiz edilir. Benim adım Trent Palmer. Dr.Andre Zilstra'nın laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.

Akıl hocam Dr. Zilstra'nın intravenöz enjeksiyonu ve deneysel metastaz modelini göstereceği yerde ksenogreft ve spontan metastaz modelini göstereceğim. Mevcut modellerin bu tekniğinin temel avantajı, bir deneycinin nicel olarak çalışabileceği uygunluk ve kolaylığıdır. İnsan tümör hücrelerinin metastazı ve deneyciler, yaklaşık 120 hayvanı kurabilir ve protokolü iki hafta içinde baştan sona tamamlayabilir.

Civciv embriyosunun erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle, sistem ek X yumurta uygulamalarına kolayca genişletilebilir. Bunu geçtiğimiz yıllarda başardık ve ek JoVE dikeylerinin konusudur. Taze bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 10 gün boyunca saatte dört kez dönen bir inkübatörde kuluçkaya yatırılır.

10. günde, yumurtaları bir yumurta rafı üzerinde yan çevirin ve hava çorabının bulunduğu yumurtanın kör ucundaki yumurta kabuğuna parlak bir doğrudan ışık kaynağı tutun. Şimdi koik damarın dal noktasını bulun. Yumurtayı uzun ekseninin 20 derece içinde döndürerek en kolay şekilde tanımlanır.

Damarın kabuktan uzaklaştığı noktayı görselleştirmek için, kor damarın dal noktasından bir santimetre uzakta, bir santimetre karelik bir kutu çizin. Ardından kutunun etrafındaki alanı iyotla ıslatılmış bir bezle temizleyin. Silikon karabina öğütme taşı ile donatılmış bir dremel kullanarak, önce yumurtanın kör ucundan hava torbasına bir delik açın ve ardından yumurta kabuğu zarından kısa bir süre sonra kare içinde bir delik açın.

Şimdi, doğru şekilde yapılan yumurta kabuğu zarını geri çekmek için ucunda ince bir çapak bulunan 25 gauge bir iğneyi dikkatlice kullanın. Bu, kamı alttaki zardan ayırmak için alttaki kamı yırtmaz. Bir parça çeyrek inç tigon borusu ile donatılmış otomatik bir pipet yardımcısı kullanın.

Hava torbası deliğine nazikçe emme uygulayın ve karedeki deliğin altında başarılı olduğunu gösteren bir hava cebi olup olmadığını kontrol edin. Yumurta kabuğu zarının bozulması sırasında kam hasar görürse, teneke kutu bariz bir şekilde düşmeyecektir. Yumurtanın dönüşü üzerine hava torbası emildiğinde, kabuğun hemen altında görünen hava, hasarlı kamın içine ve altına çekilen şeydir.

Bu yumurtalar kam düşürüldükten sonra kullanılamaz. Her iki deliği de bir parça laboratuvar bandı ile bantlayın ve yumurtaları sabit bir inkübatöre geri koyun. Yumurtalar artık ksenogreft için hazırdır.

Tümör hücrelerini ksenogreft için hazırlayarak başlayın. İlk olarak, tripsin EDTA kullanarak hücreleri kültür kaplarından ayırın. Yoğunluklarını bir hemo sitometre ile ölçerek hücreleri hazırlamayı bitirin ve bunları mililitre başına 10 ila 40 milyon hücrede PBS'de yeniden süspanse edin.

Şimdi davlumbazı ve dremmel aletini etanol ile sterilize ettikten sonra, yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın. Yumurta kabuğunun üst kısmında bir pencere açın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, kamı beş kez örün, pamuğun üzerinde hasarlı bölgeye biraz kan görünmelidir. Hemen bir buçuk ila 1 milyon hücre arasına 25 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.

Şimdi pencereyi laboratuvar bandı ile kapatın ve hücrelerin 10 ila 15 dakika oturmasına izin verin. 15 dakika sonra, yumurtaları, tümörlerin beş ila sekiz gün büyümesine izin verilen sabit inkübatöre geri koyun. İkinci bölümde gösterilen aynı kuluçka yöntemini kullanarak 12 günlük yumurtaları toplayın.

Damarın hemen üzerindeki corry ve toic venini bulmak ve işaretlemek için ışık kaynağının önüne bir yumurta yerleştirin. Bir santimetreye 0,5 santimetrelik bir kutu yapın ve alanı iyotla ıslatılmış bir bezle silerek temizleyin. Şimdi bir matkap ucu ile donatılmış bir drmo kullanarak, dikdörtgende yumurta kabuğunda küçük bir pencere açın.

Altta yatan zarı ortaya çıkarmak için yumurta kabuğu penceresini dikkatlice çıkarın. Açıkta kalan zara bir damla mineral yağ ekleyin ve şeffaf hale getirin. Yumurtaları kuluçka makinesinden alın ve 30 gauge insülin şırıngası kullanın.

Her embriyonun auik damarına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. Daha sonra açıkta kalan zarların üzerine bir parça laboratuvar bandı yerleştirin ve yumurtaları önümüzdeki bir ila yedi gün içinde sabit bir kuluçka makinesine geri koyun. Akciğer veya alt kam, aşağıdaki bölümde gösterildiği gibi tümör hücrelerinin tespiti için hasat edilir.

Prosedürün bu adımını, diseksiyonlara ayrılmış bir alanda ve DNA ile mutlak minimum temas şansı ile yürütmek hayati önem taşır. Numunelerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için, yumurtayı kesmek, birincil tümörü çıkarmak ve diseksiyonlara başlamadan önce ve diseksiyonlar arasında iç organları çıkarmak için üç ayrı alet seti kullanın. Her bir alet setini bir kez çamaşır suyuyla, bir kez% 70 etanol ile ve iki kez çift damıtılmış suyla yıkayın.

Yumurtalar sabit kuluçka makinesinden çıkarılır ve 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirilir. Hayvanları uyuşturmak ve ötenazi yapmak için, pencereler tümörler görünür hale gelecek şekilde açılır. Tümörleri tam olarak ortaya çıkarmak için pencereleri büyütmek gerekebilir.

Şimdi birincil tümörleri kameradan kesin. Temiz bir araç seti kullanarak, tümörleri tartın ve histoloji için işleyin. Ardından, organları toplamaya devam edin.

Civcivi yumurta kabuğundan çıkararak başlayın. Bunu yapmak için, kabuğu radyal olarak eşit yarıya kesin. Sonra civciv embriyosunu kesimden boşaltın.

Kabuk ayrıca bir zımba aleti kullanarak yumurta kabuğunun her iki tarafından iki parça kam toplayın ve bunları bir eend tüpüne yerleştirin. Civcivi göğüs tarafı yukarı bakacak şekilde bir peynir altı suyu teknesine aktarın. Temiz bir diseksiyon aleti seti kullanarak, karın ve sternumu keserek ve karın boşluğunu açarak embriyoyu açın.

İlk olarak, sağ veya sol lobdan karaciğerin bir parçasını toplayın. Artık organları birbirine bağlayan iç organlar kesilirken organlar dikkatlice dışarı çekilebilir. Bir akciğer seçin ve göğüs kafesinden kurtarmak için dört tarafını kesin.

Tutarlılık için. Her hayvandan aynı akciğeri toplayın. Organlardan herhangi biri işlenmezse, hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Ksenogreft çıkarıldıktan sonra üç tümör histolojik analizi uygulandı. Bu, Hep üç tümörünün tri RME boyasıdır. Tümörün stromal bileşeni, tümörün farklı lobları arasında açıkça belirgindir.

Burada intravenöz olarak enjekte edilen ve GFP'yi eksprese eden üç hücre floresan mikroskobu ile görüntülenmektedir. IV enjeksiyondan bir gün sonra, enjeksiyondan üç gün sonra sadece dağınık bireysel tümör hücreleri görülebilir, hücre sayısının arttığı ve burada küçük metastatik hücre kolonilerinin oluştuğu açıktır. Aşılamadan sonraki yedi gün boyunca metastaz seviyesi, insan A LU dizisi için gerçek zamanlı PCR kullanılarak ölçülmüştür.

Bugün burada gösterdiğimiz teknik, oldukça niceliksel bir yüksek son değer modelidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bir deneyci saatte yaklaşık 30 hayvan kurabilir ve ek olarak, iki haftalık bir süre içinde, metastaz, gelişimden sonra kuş embriyosu modeli kullanılarak kantitatif olarak analiz edilebilir. Bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, doğal olarak immün yetmezliği olan bir model kullanarak metastazı kantitatif olarak analiz etmelerine izin verdi.