Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Bu mikroenjeksiyon tekniğinin genel amacı, gen ve güçlendirici işlevi test etmek için transgenik ve genomu düzenlenmiş yapışkan balıklar üretmektir. Bu yöntem, genlerin ve güçlendiricilerin vücut kalıbı oluşturmak için nasıl işlev gördüğü gibi gelişimsel ve evrimsel genetikteki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fonksiyonel genetik analiz için verimli bir şekilde transgenik balık üretmesidir.

Metin protokolüne göre toll iki plazmit ve mRNA'yı hazırladıktan sonra, borosilikat camdan en az dört mikropipet iğnesi çekin. Keskin uçları aşağı bakacak şekilde kılcal bir saklama kabında dikey olarak saklayın. Yüz adede kadar yapışkan yumurtayı döllemek için 50 mikrolitre sperm solüsyonu ekleyin ve tüm yumurtaların döllendiğinden emin olmak için hafifçe karıştırmak için bir pipet ucu kullanın.

Buz üzerinde çalışırken, iğnenin kör ucuna 0,5 mikrolitre enjeksiyon solüsyonu pipetleyerek en az üç iğneyi geri doldurun ve boşalmasına izin verin. Bu arada, diseksiyon mikroskobu için transillüminasyon ışığını açın ve cam plakanın üzerine 15 santimetrelik bir alçı testere bıçağı ile mikroskop ışık tabanına 13 santimetre karelik bir cam plaka yerleştirin. Testereyi, girintiler iğne tutucuya bakacak şekilde enjeksiyon aparatına dik olarak yönlendirin, ardından kontrol kutusunu açın ve basıncın yaklaşık 175 kilopaskal'a ayarlandığından emin olun.

Enjeksiyon süresini 180 milisaniye olarak ayarlayın. Daha sonra iğne tutucuyu gevşetin, ardından lastik tutucunun direnci hissedilene kadar tutucuya dolu bir iğne sokun ve iğne tutucuyu parmak sıkılığına gelene kadar sıkın. Ardından iğne açısını yaklaşık 45 dereceye ayarlayın.

İğneyi, ucu görüş alanında ortalanacak şekilde ayarlamak için mikromanipülatör kontrollerini kullanın. Yaklaşık 40x büyütmeye kadar yakınlaştırın ve aşağıdaki cama değmemesi gereken iğnenin ucuna odaklanın. Saatçi forsepsleri ile iğnenin ucunu uçtan iki ila üç forseps genişliğinde kavrayın ve ucu 60 derecelik bir açıyla nazikçe kırın.

Ardından iğnenin kırılıp kırılmadığını test etmek için enjeksiyon ayağı pedalına birkaç kez basın. Birkaç dokunuştan sonra, ucundan küçük kırmızı damlacıklar çıkmaya başlamalıdır. Cam plakaya birkaç damla yapışkan su koymak için tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın.

İğneyi yavaşça suya indirin, ardından iğneden hafif bir pembe sıvı akışı çıkana kadar geri basıncı artırın. Embriyoları hazırlarken zarar görmemesi için iğneyi mümkün olduğunca geri çekin. Döllenmeden yaklaşık 25 dakika sonra, debriyajdan beş ila 10 embriyoyu çıkarmak ve cam plakaya aktarmak için iki adet 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.

Pipet uçlarıyla, embriyoları delmemeye dikkat ederek embriyoları testere bıçağının ayrı girintilerine nazikçe ayırın. Daha sonra, bir transfer pipeti ile embriyoları kaplayacak kadar yapışkan su ekleyin. Daha sonra üç ila beş saniye sonra, her embriyoyu kaplayan küçük bir hacim bırakarak suyun çoğunu çıkarın.

En uzaktaki embriyodan başlayarak, cam plakayı kaydırın ve embriyoyu görüş alanının yaklaşık yüzde 25'ini dolduracak şekilde yakınlaştırın. İğneyi görüş alanına indirin, ardından yumurta sarısının üstünde grenli, hafif sarı, kabarık bir sitoplazma yumruğu olan blastomeri tanımlamak için embriyoyu nazikçe döndürmek için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Embriyoyu, blastomer iğnenin ucuna doğrudan dik olacak şekilde döndürün.

İğneyi indirin, koronu delmek için yavaş ve eşit bir şekilde basınç uygulayın ve iğneyi alttaki yumurta sarısından itmeden sitoplazmaya sokun. Enjekte etmek için ayak pedalına üç ila dört kez basın, böylece hafifçe dağınık kenarları olan kırmızı bir bolus sitoplazmanın çapının yaklaşık 1 / 8'ini doldurur. Corion'a dik keskin bir iğneye sahip olmak bu adımı kolaylaştıracaktır.

Eklenen su miktarını sınırlamak, corion'un yumuşak kalmasına yardımcı olacaktır. Ve son olarak, sitoplazmayı hedeflemek, transgenik bir hayvan elde etme olasılığını artıracaktır. İğneyi geri çekmek için mikromanipülatör kontrollerini kullanın ve 10 mikrolitrelik pipet ucu ile iğneye yapışırsa embriyoyu basılı tutun.

İğneyi geri çektikten sonra, bir sonraki embriyoyu iğne ile hizalamak için cam plakayı kaydırın ve enjeksiyonu tekrarlayın. Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, plakaya su eklemek için transfer pipetini ucu kesilmiş olarak kullanın. Daha sonra embriyoları toplamak için bir transfer pipeti kullanın ve bunları yapışkan su ile doldurulmuş 150 milimetrelik bir petri kabına yerleştirin.

Embriyoları 18 santigrat derecede inkübe edin. Enjeksiyondan bir gün sonra, yapışkan suyu yavaşça dökün ve tatlı su ile değiştirin. Ölü veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları kontrol edin ve kontaminasyonu önlemek için çıkarın.

Burada gösterildiği gibi, arttırıcı aktiviteye sahip transgenler için, başarılı enjeksiyon, transgenin spesifik hücresel ekspresyonu ile sonuçlanır. Örneğin, pektoral ve medyan yüzgeçlerde ve notokordda. Enjekte edilen balıklar daha sonra, döllenmeden dört gün sonra embriyonik kalpte GFP ekspresyonunu yönlendiren bu geri kararlı çizgi gibi kararlı çizgiler üretmek için çaprazlanabilir.

Aktif bir arttırıcı için, embriyoların yüzde 40 ila 50'si, örneğin medyan ve pektoral yüzgeçlerde dokuya özgü transgen ekspresyonu gösterecektir. GFP pozitif F0 balıklarının yüzde 100'e kadarı geçiş ücreti ifade eden iki plazmit transgeni transgenik yavrular üretir. Bununla birlikte, transgeni taşıyan yavruların yüzdesi, yüzde birden az ila yüzde 72 arasında değişmektedir.

Sadece GFP pozitif enjekte edilen embriyoların saklanması genellikle iletim verimliliğini artırır. F0 geri enjekte edilen stickleback embriyolarının sadece yüzde 10'u beklenen dokularda floresan gösterir. Ek olarak, sırtların iletim hızı plazmit yapılarından daha düşüktür.

Taranan stickleback'lerin yalnızca yüzde 14'e kadarı sırtı iletiyor. Geri transgenezin düşük verimliliğinin aksine, pençe enjekte edilen balıkların yüzde 70 ila 100'ü mozaik lezyonlara sahiptir. Burada, enjekte edilen embriyoların her birinde kesilmemiş bir PCR amplizonu, her embriyodaki bazı hücrelerin hedef lokusta lezyonlar taşıdığını gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa 100 embriyodan oluşan bir kavrama için bir saatten biraz fazla bir sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tekniği ve embriyo sağkalımını iyileştirmek için pratik ve sabır gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler, arttırıcı ekspresyonun ayrıntılı modelleri hakkında daha fazla soruyu yanıtlamak için kullanılabilir.

Ayrıca, genomu düzenlenmiş balıklar, indüklenmiş mutasyonlardan kaynaklanan fenotipleri incelemek için çapraz olarak yetiştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, evrimsel ve gelişimsel genetik alanındaki araştırmacıların, geri dönüşlerde gen düzenlemesi ve işlevini incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, transgenez ve genom düzenleme için yapışkan embriyoların nasıl enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.